CN109251936A - 一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白及制备与应用 - Google Patents

一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白及制备与应用。通过公开含有该基因的重组表达载体和表达转化体，以及光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA‑ApSerpin‑FA72D的制备方法和应用。根据光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因RCL区域设计引物进行PCR扩增，并构建至载体pET‑32a上，得到重组表达质粒，将质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，获得含有重组大肠杆菌表达表达转化体，发酵培养、纯化后获得28 kD大小的TrxA‑ApSerpin‑FA72D融合蛋白，具有生物农药潜质，在害虫抑制性防治等领域具有广泛的应用价值。

Description

一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白及制备与应用
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白及其制备及应用技术领域。
背景技术
丝氨酸蛋白酶抑制剂(SerineProtease inhibitor，Serpin)存在于自然界中各个生物的各个组织中，并且所发挥的作用也是各不相同的。目前，已在人类、动物、植物、微生物中确定了多种Serpin家族成员的功能。Serpin超家族蛋白质能够抑制丝氨酸蛋白酶，而丝氨酸蛋白酶是生物体内不可或缺的，因此Serpin能够参与调节生物体内多种生理反应，其中包括血液凝集、纤维蛋白溶解、补体激活、免疫黑化、机体成长过程中组织构建和程序性细胞死亡等，但大多数的Serpin功能还未完全确定。在动物实验中，Serpin是生命关键途径的重要蛋白。此种酸性蛋白的活性被认为导致包括肝硬化、肺气肿、凝血障碍、老年痴呆症等疾病的根源所在。
研究证明，大部分昆虫受到外界微生物的攻击感染时，会使得其免疫系统中的识别蛋白如肽聚糖识别蛋白(PGRP)识别并将该信号放大传递于免疫通路中下游信号传递蛋白--丝氨酸蛋白酶(Serine)。Serine会继续传递于下游使得酚氧化酶原激活酶(ProPPO)催化酚氧化酶原(PPO)转化为酚氧化酶(PO)，此时PO则产生醌类物质从而包裹并清除侵入机体内微生物，抵御外界微生物感染从而保护机体。
Serpin在生物体内分布十分广泛，在生物体中凝血，纤溶，炎症，和免疫等方面都发挥着重要的作用，对其的研究也越发成为热点。Serpins在维持免疫动态平衡起至关重要的作用，对Serpin功能的研究可能有助于治疗自身免疫性疾病。因Serpins含有的大多数特性，因此其在新型药物的开发及预防一些免疫疾病等有着十分光明的前景。
一般用化学途径消灭害虫会对食物及环境构成威胁。通过研究丝氨酸蛋白酶抑制剂在昆虫内的功能来控制害虫，走生物途径来防治农业害虫，可以有效降低对环境的污染、提高作物产量。而且昆虫繁殖周期短，数量多，为人类对丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究提供大量材料，对研究其参与的抗菌机理及其它免疫防御机制等方面有重要意义。
发明内容
针对现有技术中未见有关构建大肠杆菌表达转化体pET-32a-ApSerpin-FA72D及发酵获得光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的研究现状，本发明提供一种新的光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白，含有该基因的重组表达载体、转化体，以及光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白制备方法和应用。本申请以现有技术pEASY-T1-ApSerpin-FA72质粒为模板，根据光滑鳖甲ApSerpin-FA72基因RCL区域设计的带酶切位点引物进行PCR扩增，并构建至克隆载体pEASY-T1，载体转化后将菌液进行二活后提取pEASY-T1-ApSerpin-FA72D重组质粒，双酶切质粒后，将其连接构建至表达载体pET-32a上，从而得到此重组质粒pET-32a-ApSerpin-FA72D。将获得的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组大肠杆菌表达转化体pET-32a-ApSerpin-FA72D，对其进行IPTG诱导表达，经小量诱导条件优化，蛋白最佳诱导条件为37℃，170rpm，诱导4h，获得28kD左右的光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D。保留RCL结构域蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D与现有技术重组蛋白TrxA-ApSerpin-FA72相比作用更加显著，具有生物农药潜质，在害虫的抑制性防治等领域具有广泛的应用价值。可以有效降低对环境的污染、提高作物产量。
本发明技术方案在于提供一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D，其大小为28KDa，核苷酸序列如SEQID NO.1所示，重组表达载体，包含光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的核苷酸序列；该重组表达载体的载体骨架优选原核表达载体，更优选pET-32a，采用的重组表达转化体优先为大肠杆菌BL21(DE3)。
同时，本发明提供一种融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的制备方法，利用上述提供重组表达转化体，获得融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D，具体所述的融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D具体制备方法如下：
(1)菌种活化：将高温灭菌后的牙签用镊子取出从保存重组大肠杆菌表达转化体pET-32a-ApSerpin-FA72D的甘油管中蘸取菌液，在固体培养基中进行划线，然后将其置于37℃的恒温培养箱中培养10～14h，挑取菌体于1.5mL含有液体LB培养基的EP管中，37℃220rpm培养4～6h。
(2)摇瓶种子培养：将步骤(1)获得的菌株，接入1L摇瓶种子LB培养基中，于37℃220rpm培养12h，菌液OD值为1.1～1.6，pH为7.1～7.6，培养结束。
(3)发酵罐培养：将10％的步骤(2)获得的种子发酵液，接种于TB培养基的生物发酵罐中，重组大肠杆菌表达转化体最佳发酵条件为温度37℃，转速500rpm，通气量为6L/min时，p H值为7.0；取1m L发酵产物进行稀释，当测得的OD值在0.2～0.8之间为合格。
(4)融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的纯化：对步骤(3)获得的大量表达转化体进行离心超声破碎，将所得上清进行硫酸铵沉淀法提取可溶性TrxA-ApSerpin-FA72D蛋白，对所得沉淀进行包涵体蛋白的提取的获得包涵体TrxA-ApSerpin-FA72D蛋白。
进一步，本发明提供光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D在抑制害虫中应用的技术方案，采用提供的重组光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂螯合蛋白在防治农业害虫中的应用，对害虫有相应的抑制生长效果，当幼虫龄期越小，对其效果越强烈，且TrxA-ApSerpin-FA72D蛋白对棉铃虫、茶尺蠖、菜青虫的抑制生长作用显著高TrxA-ApSerpin-FA72蛋白；验证了TrxA-ApSerpin-FA72D作为生物农药具有可行性，为研究新型生物农药奠定一定的基础。
具体的，本发明提供表达光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白重组表达载体的获得方法，具体包括如下步骤：
(1)根据光滑鳖甲ApSerpin-FA72基因RCL区域的特性，设计带酶切位点的引物F与R并合成，通过表达载体构建引物。
(2)将保存在-80℃冰箱的现有技术pEASY-T1-ApSerpin-FA72质粒取出并进行转化。
(3)将活化验证无误的菌种，取二活提取pEASY-T1-ApSerpin-FA72质粒，用ApSerpin-FA72D带酶切位点引物进行扩增，将其构建在克隆载体pEASY-T1上。
(4)取二活提取pEASY-T1-ApSerpin-FA72D质粒，同时取表达载体pET-32a空载质粒，并对二者进行双酶切；用T4连接酶于16℃水浴锅进行24h连接，得到重组表达质粒pET-32a-ApSerpin-FA72D。
本发明中，提供的重组表达转化体，包含上述的任何一种现有技术的核苷酸序列或本发明的重组表达载体；该重组表达转化体优选细菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明中，提供表达光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白重组表达转化体的获得方法中，将获得的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，从而获得产光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因工程菌，即获得重组大肠杆菌表达转化体pET-32a-ApSerpin-FA72D。
本发明中，提供的光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白的制备方法中，培养上述本发明的重组转化体，获得重组的光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白。
本发明中，提供上述方法所制备而得的重组光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂螯合蛋白，其融合蛋白大小为28KDa，蛋白分子量较小，易于表达从而得到大量蛋白，可大大降低生产成本，与现有技术记载的水平相比有明显提高。
本发明基于已有现有技术“光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂基因ApSerpin-FA72的克隆、表达及功能验证”(赵钰，昆虫学报，2017，60(8):857-864)已公开了ApSerpin-FA72蛋白基因序列，ApSerpin-FA72蛋白基因与质粒pET-32a(+)重组构建了表达载体，获得重组质粒pET-32a-ApSerpin-FA72再转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得了表达转化体。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:
(1)本发明提供了重组大肠杆菌表达转化体能够有效表达光滑鳖甲丝氨酸抑制剂蛋白，经检测，获得的融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D，其融合蛋白大小为28KDa，蛋白分子量较小，易于表达从而得到大量蛋白，可大大降低生产成本，与现有技术记载的水平相比有明显提高。
(2)本发明提供的一种纯化表达的光滑鳖甲丝氨酸抑制剂。研究发现，将发酵纯化出的TrxA-ApSerpin-FA72D融合蛋白对害虫进行抑制生长杀死实验，选取的棉铃虫、茶尺蠖、菜青虫等鳞翅目农业害虫，在对棉铃虫抑制试验中，TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白与TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白对棉铃虫均有杀死作用，且TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白比TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白效果更佳，且TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白剂量为25μg/只及50μg/只时抑制生长效果相似；在对茶尺蠖抑制试验中，涂抹TrxA-ApSerpin-FA72D蛋白饲喂茶尺蠖三龄幼虫处理48h后，实验组虫体全部死亡，对照组无死亡；试验表明，采用本发明提供的融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D对害虫有相应的抑制生长效果，当幼虫龄期越小，对其效果越强烈，且TrxA-ApSerpin-FA72D蛋白对棉铃虫、茶尺蠖、菜青虫的抑制生长作用显著高TrxA-ApSerpin-FA72蛋白；验证了TrxA-ApSerpin-FA72D作为生物农药具有可行性，为研究新型生物农药奠定一定的基础。
附图说明
图1显示为硫酸铵沉淀配比图。
图2显示为发酵转速的优化图。
图3显示为发酵通气量的优化图。
图4显示为发酵pH的优化图。
图5显示为硫酸铵沉淀TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白图。
图6显示为尿素变复性TrxA-ApSerpin-FA72D包涵体蛋白图。
图7显示为TrxA-ApSerpin-FA72D抑杀棉铃虫效果图，图中A为25μg/只TrxA-ApSerpin-FA72D使用剂量图，B为50μg/只TrxA-ApSerpin-FA72D使用剂量图，C为PBS对照图。
图8显示为TrxA-ApSerpin-FA72抑制棉铃虫生长效果图，图中A为25μg/只TrxA-ApSerpin-FA72使用剂量图，B为50μg/只TrxA-ApSerpin-FA72使用剂量图。
图9显示为0h时50μg/只剂量的不同蛋白对棉铃虫抑杀效果图，图中A为0h时50μg/只TrxA对棉铃虫抑杀效果图，B为0h时50μg/只TrxA-ApSerpin-FA72D对棉铃虫抑杀效果图，C为0h时50μg/只TrxA-ApSerpin-FA72对棉铃虫抑杀效果图，D为0h时50μg/只PBS对棉铃虫抑杀效果图。
图10显示为72h时50μg/只剂量的不同蛋白对棉铃虫抑杀效果图，图中A为72h时50μg/只TrxA对棉铃虫抑杀效果图，B为72h时50μg/只TrxA-ApSerpin-FA72D对棉铃虫抑杀效果图，C为72h时50μg/只TrxA-ApSerpin-FA72对棉铃虫抑杀效果图，D为72h时50μg/只PBS对棉铃虫抑杀效果图。
图11显示为各组蛋白抑制棉铃虫生长效果图。
图12显示为不同处理时间蛋白抑杀茶尺蠖对比图，图中A为处理16h蛋白抑杀茶尺蠖图，B为处理40h蛋白抑杀茶尺蠖图，C为饲养40h后的体长图，其中1表示叶片上涂抹PBS缓冲液，2表示叶片上涂抹20μg TrxA-ApSerpin-FA72D。
图13显示为蛋白抑制菜青虫幼虫体重变化图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
主要试验材料与试剂：pEASY-T1-ApSerpin-FA72质粒为本实验室保存；DNAmarker购自上海源叶生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、PCRMix、蛋白质marker试剂购自广州东盛生物科技有限公司；TEMED、NucleicAcid Stain核酸染料、氨苄青霉素(Amp)、IPTG试剂、DNA片段快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；Agarose购自BIO BASIC INC公司；San Prep柱式质粒DNA小量抽取试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司；克隆载体pEASY-T1购自北京全式金生物技术有限公司；表达载体pET-32a购自德国Novagen公司；大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；其余试剂为国产分析纯。
常用培养基的配制：LB培养基：胰蛋白胨l 0g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加琼脂20g/L，蒸馏水1.0L，高压灭菌后使用；TB培养基：酵母提取物25g/L，纯甘油5ml/L，胰蛋白胨13g/L，溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/LKH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液，培养基在接种前加入0.1g/L的氨苄青霉素(AMP)。
主要设备：ECM399型电转化仪(德国BTX公司)；高速冷冻离心机(DIGICEN20-R，西班牙Orto Alresa公司)；核酸蛋白检测仪(Gene Quant，德国GE公司)；梯度PCR仪(MyCycler，美国BIO-RAD公司)。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：重组大肠杆菌表达转化体的构建
(1)根据光滑鳖甲ApSerpin-FA72基因RCL区域的特性，设计带酶切位点的引物F与R并合成，如表1所示。
表1：表达载体构建引物
注：下划线为酶切位点。
(2)将保存在-80℃冰箱的现有技术pEASY-T1-ApSerpin-FA72质粒取出并进行转化，筛选出阳性单克隆，送往外单位测序验证基因完整序列无突变。
(3)活化验证无误的菌种，取二活提取pEASY-T1-ApSerpin-FA72质粒，用ApSerpin-FA72D带酶切位点引物进行扩增，将其构建在克隆载体pEASY-T1上，进行转化，挑取阳性单克隆送往外单位测序。
(4)将测序正确的菌株进行活化，取二活提取pEASY-T1-ApSerpin-FA72D质粒，同时取表达载体pET-32a空载质粒，并对二者进行双酶切；用T4连接酶于16℃水浴锅进行24h连接，得到重组表达质粒pET-32a-ApSerpin-FA72D。
(5)将步骤(4)获得的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。从而获得产光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因工程菌，即获得重组大肠杆菌表达转化体pET-32a-ApSerpin-FA72D。
实施例二：重组光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的高效表达
重组光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的高效表达的发酵工艺，具体发酵方法步骤如下：
(1)菌种活化：将高温灭菌后的牙签用镊子取出从保存含有重组大肠杆菌表达转化体pET-32a-ApSerpin-FA72D的甘油管中蘸取菌液，在固体培养基中进行划线，然后将其置于37℃的恒温培养箱中培养10～14h，挑取菌体于1.5mL含有液体LB培养基的EP管中，37℃220rpm培养4～6h。
(2)摇瓶种子培养：将步骤(1)获得的菌株，接入1L摇瓶种子LB培养基中，于37℃220rpm培养12h，菌液OD值为1.1～1.6，pH为7.1～7.6，培养结束。
(3)发酵罐培养：将10％的步骤(2)获得的种子发酵液，接种于TB培养基的生物发酵罐中，含有重组大肠杆菌表达转化体最佳发酵条件为温度37℃，转速500rpm，通气量为6L/min时，pH值为7.0。取1mL发酵产物进行稀释，当测得的OD值在0.2～0.8之间为合格。
实施例三：融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的纯化
同时，本发明提供了一种重组光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白，即纯化的融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D，通过制备纯化所表达的融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的获得，具体制备方法步骤如下：
使用生物发酵罐发酵得到大量重组大肠杆菌表达转化体，对表达菌体进行离心超声破碎，将所得上清进行硫酸铵沉淀法进行可溶性蛋白的提取，对所得沉淀进行包涵体蛋白的提取。
(1)可溶性蛋白的纯化：量取上清液体积，根据硫酸铵沉淀配比表，如附图1所示，加入硫酸铵进行沉淀，分别用5％、10％、15％、20％的硫酸铵沉淀蛋白进行除杂，再用50％的硫酸铵沉淀TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白，每次加入硫酸铵后在4℃下静置30min，然后4℃下12000rpm离心10min，收集沉淀，即为每步沉淀的蛋白，将上清取出继续下一步沉淀，将收集的蛋白使用PBS溶解。
(2)包涵体蛋白的纯化：用含0.1％Triton和2M尿素的PBS50mL重悬洗涤包涵体沉淀；4℃下11000rpm离心15min，弃上清，用含2M尿素的PBS 50mL重悬洗涤包涵体沉淀；4℃下11000rpm离心15min，弃上清，收集包涵体沉淀，用6mL含8M尿素的Tris缓冲液充分溶解包涵体，室温溶解20min后，4℃下11000rpm离心15min，收集上清，将其移入透析袋中进行梯度透析复性(透析袋的准备过程如下，50％酒精煮沸10min，ddH2O水洗净，里面洗5次，外面洗3次，将透析袋放入去离子水中备用)，首次透析液为含5M尿素的Tris缓冲液，透析8h，再按照浓度4M、3.5M、3M、2.5M、1.5M、0.5M各透析4h，超纯水透析8h；收集透析液，离心，4℃下11000rpm离心10min，收集上清，即得到包涵体溶解复性蛋白，于-80℃保存。
实施例四：重组光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的高效表达发酵罐条件优化
1.试验方法
(1)菌种活化：将高温灭菌后的牙签用镊子取出从保存重组大肠杆菌表达转化体的甘油管中蘸取菌液，在倒好固体培养基的培养皿中进行划线，然后将其置于37℃的恒温培养箱中培养10～14h，挑取单菌落于1.5mL含有液体LB培养基的EP管中，置于37℃，220rpm条件下的摇床中培养4～6h，之后进行菌液PCR鉴定看其是否为正确菌株。
(2)摇瓶种子培养：将步骤(1)获得的菌株，接入1L摇瓶种子培养基(此时为LB培养基)中，于37℃，220rpm条件下的摇床中培养12h。
(3)发酵罐培养：将步骤(2)获得的摇瓶种子培养液(培养液中OD计量为1.1～1.6，pH计量为7.1～7.6)通过10％接菌含量接种到具有20L容量的TB培养基的生物发酵罐中。对发酵罐转速、通气量、pH条件，分别进行试验，确定发酵罐最优发酵参数，所得菌体量均为20L发酵液发酵后所得表达菌体总湿重。
1)发酵罐转速的优化：设定pH值7.0，温度37℃，通气量0.6L/min，转速分别设置为100、200、300、400、500rpm进行试验。
2)发酵罐通气量的优化：设定pH值7.0，温度37℃，转速300rpm，通气量分别设置为2、4、6、8、10L/min进行试验。
3)发酵罐pH条件设定温度37℃，转速300rpm，通气量6L/min，pH分别设置为5.0、6.0、7.0和8.0进行试验。
2.实验结果
为得到尽可能多的表达转化体，本研究主要从调节发酵液通气量、转速及pH值三方面对发酵条件进行优化。
如附图2所示，将生物发酵罐的pH大小调至7.0，将温度设置为37℃，罐体通气总量设定为4L/min，转速为500rpm时，所得表达菌菌体产量较高。如附图3所示，将生物发酵罐的pH大小调至7.0，将温度设置为37℃，转速500rpm，罐体通气总量设定为6L/min时，所得表达菌菌体产量高。如附图4当生物发酵罐设定温度37℃，转速500rpm，通气量为6L/min时，pH值为7.0，所得表达菌菌体产量高。因此，本实验发酵表达菌时最佳发酵条件为温度37℃，转速500rpm，通气量为6L/min时，pH值为7.0。此时发酵罐蛋白诱导条件与小量诱导时温度及转速条件相同，诱导时间为24h。
实施例五：融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的纯化
通过实施例四发酵获得的重组大肠杆菌表达转化体，不能判断表达出的蛋白可溶性多还是包涵体多，通过对TrxA-ApSerpin-FA72D表达菌体进行离心超声破碎，将所得上清进行硫酸铵沉淀法进行可溶性蛋白的提取，对所得沉淀进行包涵体蛋白的提取。
(1)可溶性蛋白的纯化：使用硫酸铵沉淀的方法进行蛋白的纯化，根据硫酸铵沉淀配比表，如附图1所示，量取上清液体积，对应硫酸铵沉淀表，加入硫酸铵进行沉淀，分别用5％、10％、15％、20％的硫酸铵沉淀蛋白进行除杂，再用30％、40％、50％、60％的硫酸铵沉淀目的蛋白，每加入硫酸铵后在4℃下静置30min进行沉淀，然后进行离心(12000rpm，10min，4℃)，收集沉淀，即为每步沉淀的蛋白，将上清取出继续下一步沉淀，将收集的蛋白进行PBS溶解。所有收集的蛋白用Bradford法测定蛋白含量，进行15％的SDS-PAGE电泳及Westernblotting检测。
(2)包涵体蛋白的纯化：处理包涵体蛋白用含0.1％Triton和2M尿素的PBS 50mL重悬洗涤包涵体沉淀；离心(11000rpm，15min，4℃)，弃上清，用含2M尿素的PBS 50mL重悬洗涤包涵体沉淀；离心(同上)收集包涵体沉淀，用6mL含8M尿素的Tris缓冲液充分溶解包涵体，室温溶解20min，离心(11000rpm，10min，4℃)。透析袋的准备：50％酒精，煮沸10min，ddH2O水洗净，里面洗5次，外面洗3次，将透析袋放入去离子水)中备用。然后收集上清，将其移入处理好了的透析袋中进行梯度透析复性，最初的透析液为含5M尿素的Tris缓冲液，透析8h，再按照浓度4M、3.5M、3M、2.5M、1.5M、0.5M各透析4h，超纯水透析8h；收集透析液离心(11000rpm，10min，4℃)，收集上清，于-80℃保存，并取50μL样品，标记为“纯化和复性后的蛋白”，做SDS-PAGE蛋白电泳检测。所有收集的蛋白用Bradford法测定蛋白含量，进行15％的SDS-PAGE电泳及Westernblotting检测。
根据硫酸铵沉淀配比表使用低浓度硫酸铵对TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白洗杂，高浓度硫酸铵对它们进行可溶性蛋白的沉淀。如附图5所示，收集不同硫酸铵浓度下沉淀出的蛋白，进行SDS-PAGE电泳鉴定后可知50％硫酸铵浓度沉淀出的TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白最多。如附图6所示，使用尿素变复性方法对TrxA-ApSerpin-FA72D包涵体蛋白进行纯化，进行SDS-PAGE电泳鉴定后可知，TrxA-ApSerpin-FA72D包涵体蛋白浓度相对较低，杂质多。最后都要将所收集得到的蛋白进行PBS洗脱，每12h换一次洗脱液，共进行48h，此时得到的蛋白为最后收集蛋白。
实施例六：TrxA-ApSerpin-FA72D融合蛋白对害虫抑制性研究
1.实验材料
(1)虫体棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫为实验室人工饲养、茶尺蠖(Ectropis oblique hypulina Wehrli)幼虫为采集于浙江杭州茶园、菜青虫(PierisrapaeLinne)采集于四川自贡农田。
(2)实验材料数片生长状况相同的新鲜青菜叶子(每片约1g、1dm2)、数只生长状况一致且健康的幼年害虫(取二龄至三龄)、一次性细胞培养皿、网格纸、其余材料如前。
2.实验方法
将幼虫分为对照组和实验组，将纯化好的TrxA-ApSerpin-FA72与TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白和包涵体蛋白，并且分别做三组浓度为2mg/L，1mg/L，0.5ml/L的浓度梯度，选取体长、龄期基本一致虫体，每组幼虫为30只，记录其体长，保证每组虫体初始体重基本一致，记下每组虫体的初始体重，置于相同培养皿中，记录每个皿中的叶片重量。每隔2h观察其生长状况，记录死亡及成蛹状况，并及时补加叶片，补加叶片前记录每组虫体体重。害虫致死实验在其最适生长环境下进行。其中，菜青虫(Pieris rapaeLinne)杀死实验在25℃，60％湿度条件下进行。
3.实验结果
(1)抑杀棉铃虫根据丝氨酸蛋白酶抑制剂的性质，推测其具有杀死昆虫的作用。因此选取TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白与TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白对棉花地常见害虫棉铃虫3龄幼虫进行害虫抑杀实验。TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白选取量为25μg/只及50μg/只两个浓度，对照组使用等量PBS缓冲液，TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白选取条件相同。结果证明，TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白与TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白对棉铃虫均有抑杀作用，且50μg/只浓度下效果相对较好。由附图7、附图8可以看出，TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白比TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白效果更佳。
棉铃虫抑杀实验证明TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白与TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白对其可能具有杀死作用，因此选取大量棉铃虫3龄幼虫进行抑杀性验证。此时选取12.5μg/只、25μg/只及50μg/只三个剂量的TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白与TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白，每组进行6只生物学重复，3个技术重复。每两个小时观察虫体死亡情况，共进行72h。此时选取TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白与TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白50μg/只的剂量对幼虫抑制生长在0h，4h，8h，12h，72h观察结果，其中TrxA蛋白为阴性对照，PBS缓冲液为阳性对照，附图9所示为0小时时50μg/只剂量不同蛋白对棉铃虫抑杀效果，附图10所示为72小时时50μg/只剂量不同蛋白对棉铃虫抑杀效果，附图11所示根据观察结果统计量可得，TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白与TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白对棉铃虫均有杀死作用，且TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白比TrxA-ApSerpin-FA72可溶性蛋白效果更佳，且TrxA-ApSerpin-FA72D可溶性蛋白剂量为25μg/只及50μg/只时抑制生长效果相似。
(2)抑制茶尺蠖茶尺蠖(Ectropis oblique hypulina Wehrli)是茶园中发生最普遍、为害最严重的害虫种类之一，因此选取茶尺蠖进行害虫抑杀实验。选取1g左右的茶叶叶片涂抹20μgTrxA-ApSerpin-FA72D蛋白饲喂茶尺蠖三龄幼虫为对照组，对照组叶片涂以相同量PBS，每2h观察一次。随着蛋白作用时间的增加，可以观察到实验组对茶尺蠖具有一定的致死效果，由附图12图中A可以看出，经16h处理后，实验组基本死亡，叶片并无太多咬食，对照组叶片咬食明显，无茶尺蠖死亡；由附图12图中B可以看出，处理48h后，发现实验组虫体全部死亡，对照组无死亡。对处理后茶尺蠖体长进行测量比较，由附图12图中C可以看出，实验组虫体体长基本无增长，对照组虫体体长均生长。
(3)抑制菜青虫菜粉蝶(Pieris rapae)，别名菜白蝶，幼虫又称菜青虫，其喜食十字花科食物，是我国分布最普遍，危害最严重，经常成灾的害虫，本试验在野外大量采集菜青虫不同龄期幼虫进行害虫抑制生长实验，将其分为2龄、3龄以及4龄组，饲喂TrxA-ApSerpin-FA72D及TrxA-ApSerpin-FA72的可溶性蛋白与沉淀蛋白处理作为实验组，以PBS缓冲液作为空白对照，每2h观察菜青虫生长情况。处理40h后，将每组幼虫体重增长情况进行统计，附图13可以看出，TrxA-ApSerpin-FA72D上清蛋白对2龄菜青虫幼虫作用时，部分幼虫化蛹，剩余幼虫随着时间的增长虫体体重均有所增加。TrxA-ApSerpin-FA72D上清蛋白对3龄菜青虫幼虫作用时，组内幼虫随着时间的增长虫体体重并无明显变化。TrxA-ApSerpin-FA72D沉淀蛋白对3龄菜青虫幼虫作用时，由于幼虫进食快，于28h补加叶片0.857g，组内幼虫随着时间的增长虫体体重均有所增长。TrxA-ApSerpin-FA72D沉淀蛋白对4龄菜青虫幼虫作用时，组内幼虫随着时间的增长虫体体重均有所增加。TrxA-ApSerpin-FA72上清蛋白对2龄菜青虫幼虫作用4h时，组内幼虫67％已经死亡，剩余幼虫随着时间的增长虫体体重并无明显变化。TrxA-ApSerpin-FA72上清蛋白对3龄菜青虫幼虫作用28h时，部分幼虫提前化蛹，剩余幼虫随着时间的增长虫体体重并无明显变化。TrxA-ApSerpin-FA72沉淀蛋白对3龄菜青虫幼虫作用时，个别幼虫提前化蛹，剩余幼虫随着时间的增长虫体体重有所增加。TrxA-ApSerpin-FA72沉淀蛋白对4龄菜青虫幼虫作用28h时，组内幼虫已基本化蛹完成。对照组PBS缓冲液对3龄及4龄幼虫无抑制作用，组内幼虫体重均有增加。当幼虫龄期较小时，TrxA-ApSerpin-FA72D蛋白对其抑制效果明显。
本试验中，将发酵纯化出的蛋白对害虫进行抑制生长杀死实验，选取的害虫有棉铃虫、茶尺蠖、菜青虫等鳞翅目农业害虫。通过观察结果发现，融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D及TrxA-ApSerpin-FA72对害虫都有相应的抑制生长效果，且TrxA-ApSerpin-FA72D比TrxA-ApSerpin-FA72的抑杀效果显著，当幼虫龄期越小，对其效果越强烈。产生这种现象的原因可能是害虫幼虫越小，其免疫系统还未发育成熟，当受到融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D处理时，其抑制了机体的免疫通路中的活性Serine，过量的活性Serine会持续的激活下游免疫应答，不断的造成害虫幼虫体内营养的大量消耗。而Serpin又会抑制消化道中的酶，使得害虫幼虫产生厌食反应，从而造成害虫幼虫停止生长甚至死亡。
上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 四川理工学院
刘忠渊
<120> 一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白及制备与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacccaacaa gtggaatggc gcttgccttc atttttacaa ctagtaaagc caatttcaga 60
gggatgatgc acatcgattt gtatttcagt gagagagtgc agaaggcgtt catcgaagtg 120
aatgaagagg gcgctgaggc tgccgccgcc actgcgatta tcatagattc ttacatgctc 180
gtaccatccg ctgatttcac agcaaattat cctttcgtta tttgcttatt gaatgaggat 240
ttggtactct tcatgggaag aattgcatcg ttttaa 276

Claims (7)

1.一种光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D，其特征在于，所述的光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的光滑鳖甲丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体的载体骨架为pET-32a原核表达载体。
4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含核苷酸序列或权利要求2～3任一项所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达转化体，其特征在于，其为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.一种融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的制备方法，培养诱导权利要求4所述的重组表达转化体，获得融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D，其特征在于，所述的融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D具体制备方法如下：
（1）菌种活化：将高温灭菌后的牙签用镊子取出从保存重组大肠杆菌表达转化体pET-32a-ApSerpin-FA72D的甘油管中蘸取菌液，在固体培养基中进行划线，然后将其置于37℃的恒温培养箱中培养10~14 h，挑取菌体于1.5mL含有液体LB培养基的EP管中，37℃220 rpm培养4~6h；
（2）摇瓶种子培养：将步骤（1）获得的菌株，接入1 L摇瓶种子LB培养基中，于37℃220rpm培养12h，菌液OD值为1.1～1.6，pH为7.1～7.6，培养结束；
（3）发酵罐培养：将10%的步骤（2）获得的种子发酵液，接种于TB培养基的生物发酵罐中，重组大肠杆菌表达转化体最佳发酵条件为温度37℃，转速500 rpm，通气量为6L／min时，p H值为7.0；取1 m L发酵产物进行稀释，当测得的OD值在0.2～0.8之间为合格；
（4）融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D的纯化：对步骤（3）获得的大量表达转化体进行离心超声破碎，将所得上清进行硫酸铵沉淀法提取可溶性TrxA-ApSerpin-FA72D蛋白，对所得沉淀进行包涵体蛋白的提取的获得包涵体TrxA-ApSerpin-FA72D蛋白。
7.如权利要求6所述融合蛋白TrxA-ApSerpin-FA72D在抑制害虫中的应用。
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