CN112094848A - 一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因及其应用，所述小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。添食重组蛋白Serpin7可强烈抑制小菜蛾酚氧化酶PO活力；添食Serpin7的多克隆抗体anti‑Serpin7能显著提高酚氧化酶PO活力；RNAi沉默Serpin7基因表达后，小菜蛾酚氧化酶PO活力升高，小菜蛾幼虫产生强烈黑化反应，导致大部分小菜蛾不能正常化蛹，能化蛹者也不能成功羽化。说明小菜蛾Serpin7是昆虫体内一种先天性免疫的负调节因子，可以作为新型生物防治的分子靶标，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。

Description

一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，更具体地，涉及一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因及其应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitors，Serpins)是一类分布广泛于植物、动物、微生物等中，是丝氨酸蛋白酶活性的调节剂。根据其序列的同源性、半光氨酸残基和分子中二硫键的数目，丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为Kunitz、Kazal、Bowman-Birk、Serpin、TIL(Trypsin Inhibitor Like Cysteine Rich Domain)等几个家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂参与生物体内一系列的生理和病理过程的调控，如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等发挥着关键性的调控作用，从而维持生命体内稳态。丝氨酸蛋白酶抑制剂在在医学上具有很好的应用价值，丝氨酸蛋白酶抑制在临床上用于胃炎、胰腺炎等疾病的治疗已有报道。

小菜蛾(Plutella xylostella)，俗称小青虫、两头尖，英文名为Diamondbackmoth(DBM)，属鳞翅目菜蛾科，是世界性迁飞害虫，在北美南部、南美洲、亚洲东部非洲南部以及澳大利亚东南部均有分布，而在我国中部及东南沿海地区的危害较为严重。小菜蛾主要危害芥兰、甘蓝、白菜等十字花科蔬菜，每年因小菜蛾危害而损失的经济可高达40至50亿美元，对于小菜蛾危害情况的严重性，我国每年花费约7.7亿美元于小菜蛾生物学、生态学以及管理方面的研究上。随着化学农药的广泛使用，越来越多的农业害虫对其产生严重抗性，小菜蛾就是其中抗性较强的农业害虫，甚至对生物农药Bt都产生了抗性。因此，研究小菜蛾免疫系统寻找新的害虫分子防治靶标尤为重要。专利CN107523572A公开了菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用，主要是关于小菜蛾寄生蜂天敌畸形细胞胞外分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂的相关报道；另外，祝妮(2013)公开了小菜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因的克隆、转录及其酶活的研究，但是并未涉及小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂；目前，关于小菜蛾自身含有的与其免疫相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究还鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因。

本发明的第二个目的在于提供小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7。

本发明的第三个目目的在于提供小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7的重组蛋白。

本发明的第四个目的在于提供含有所述Serpin7基因的重组表达载体或抑制Serpin7基因表达的RNAi载体。

本发明的第五个目的在于提供所述上述Serpin7基因、小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7、重组蛋白、含有所述Serpin7基因的重组表达载体或抑制Serpin7基因表达的RNAi载体的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明首先从小菜蛾中克隆得到了一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列大小为1026bp。其所编码的小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，序列长度为401aa。

一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7的重组蛋白，其特征在于，是将SEQ IDNO:2所示小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7蛋白去除信号肽(1-22aa)前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

含有所述小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因的重组表达载体或抑制Serpin7基因表达的RNAi载体。

优选地，所述重组表达载体为pET-32a-Serpin7，用于表达重组蛋白Serpin7，含有去除SEQ ID NO:1所示Serpin7基因信号肽之后的核苷酸序列。

优选地，所述RNAi载体为L4440-Serpin7。

本发明还提供含有所述重组表达载体或RNAi载体的重组菌或细胞系。

优选地，含有所述重组表达载体的细菌为大肠杆菌BL21，含有RNAi载体的为HT115(DE3)菌株。

本发明发现，添食重组蛋白Serpin7可强烈抑制小菜蛾酚氧化酶PO活力；添食Serpin7的多克隆抗体anti-Serpin7能显著提高酚氧化酶PO活力；RNAi沉默Serpin7基因表达后，小菜蛾酚氧化酶PO活力升高，小菜蛾幼虫产生强烈黑化反应，导致大部分小菜蛾不能正常化蛹，能化蛹者也不能成功羽化。Serpin7具有调控小菜蛾的酚氧化酶(PO)的活力的功能。由于酚氧化酶(phenoloxidase，PO)是酚氧化酶原激活系统的产物，是衡量机体免疫功能的重要指标。说明小菜蛾Serpin7是昆虫体内一种先天性免疫的负调节因子，表明小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7具有调控小菜蛾天然免疫的功能。可以作为新型生物防治的分子靶标，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。

因此，本发明还提供所述Serpin7基因或所述丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7或所述重组蛋白或所述抑制Serpin7基因表达的RNAi载体在调控十字花科蔬菜害虫天然免疫中的应用。

还提供Serpin7基因或所述丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7作为十字花科蔬菜害虫防治靶点的应用。

因此，本发明还提供所述Serpin7基因或所述丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7或所述重组蛋白或所述抑制Serpin7基因表达的RNAi载体在防治十字花科蔬菜害虫或制备防治十字花科蔬菜害虫的药剂中的应用。

具体地，所述防治是将丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7添食给害虫，强烈抑制害虫体内酚氧化酶(PO)的活力，使害虫丧失对细菌、绿僵菌、病毒的黑化作用，显著提高细菌、绿僵菌、病毒等对害虫的致死率；或将丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7的基因的RNAi载体的重组细菌喂食害虫，降解或者阻断害虫Serpin7的翻译，致使害虫体内的Serpin7蛋白显著降低，进一步能强烈激活害虫体内的酚氧化酶(PO)的活力，造成害虫免疫的过激反应，使害虫黑化增强，可以导致害虫畸形，不能化蛹死亡，从而预防害虫的危害。即可利用Serpin7基因或蛋白，通过免疫抑制或免疫过激两种不同的途径，防治害虫。

本发明还提供权所述Serpin7基因或所述丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7在制备抗十字花科蔬菜害虫的转基因植物中的应用。构建小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因的转基因植物，将小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因或者功能区域导入到相应的植物中，当害虫吃这些植物到体内后，Serpin7蛋白能抑制害虫的先天性免疫，即强烈抑制害虫体内的酚氧化酶(PO)的活力，使害虫对于病原物的敏感性显著提高，从而预防害虫对于植物的危害。

本发明还一种用于防治十字花科蔬菜害虫的药剂，包含小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7。所述药剂通过Serpin7蛋白抑制害虫的先天性免疫，即强烈抑制害虫体内的酚氧化酶(PO)的活力，使害虫对于病原物的敏感性显著提高，从而预防害虫对于植物的危害。

优选地，包含小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7重组蛋白。

优选地，所述重组蛋白为将去除信号肽的Serpin7基因编码序列，连接到表达载体，获得重组表达质粒，利用大肠杆菌原核表达系统，经诱导表达小菜蛾Serpin7，用His-tag层析柱一步纯化上清表达的重组蛋白，然后使用超滤管进行去离子浓缩得到重组蛋白。将重组蛋白添食给小菜蛾，强烈抑制害虫体内酚氧化酶(PO)的活力，使害虫丧失对细菌、绿僵菌、病毒的黑化作用，显著提高细菌、绿僵菌、病毒等对害虫的致死率。

一种用于防治十字花科蔬菜害虫的药剂，包含抑制Serpin7基因表达的制剂。所述药剂可降解或者阻断小菜蛾Serpin7的翻译，致使害虫体内的Serpin7蛋白显著降低，进一步能强烈激活害虫体内的酚氧化酶(PO)的活力，造成害虫免疫的过激反应，使害虫黑化增强，可以导致害虫畸形，不能化蛹死亡，从而预防害虫的危害。

优选地，所述制剂为小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7的RNAi重组细菌，将丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7的基因或者功能区域编码导入到相应的RNAi载体，如L4440中，表达出沉默Serpin7基因表达的dsRNA，在害虫吃到带有沉默Serpin7基因表达的dsRNA的HT115细菌时，降解或者阻断小菜蛾Serpin7的翻译，致使害虫体内的Serpin7蛋白显著降低，进一步能强烈激活害虫体内的酚氧化酶(PO)的活力，造成害虫免疫的过激反应，使害虫黑化增强，可以导致害虫畸形，不能化蛹死亡，从而预防害虫的危害。

优选地，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因，所述小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。添食重组蛋白Serpin7可强烈抑制小菜蛾酚氧化酶PO活力；添食Serpin7的多克隆抗体anti-Serpin7能显著提高酚氧化酶PO活力；RNAi沉默Serpin7基因表达后，小菜蛾酚氧化酶PO活力升高，小菜蛾幼虫产生强烈黑化反应，导致大部分小菜蛾不能正常化蛹，能化蛹者也不能成功羽化。说明小菜蛾Serpin7是昆虫体内一种先天性免疫的负调节因子，可以作为新型生物防治的分子靶标，用于十字花科蔬菜害虫的防控，具有很好的生物防治潜力和应用前景。

附图说明

图1为Serpin7基因全长cDNA序列及推演的氨基酸序列。注：图中黄色区域分别是Serpin7基因5’UTR与3’UTR；划线部分为信号肽区域；红色方框为RCL区域；紫色区域为Hinge region；蓝色圆圈为P1酶切位点。

图2为Serpin7蛋白的SDS-PAGE及Western blot检测。注：图a、b分别为PxSerpin-7原核表达SDS-PAGE图及Western blot图；泳道M为Marker(10-180kDa)，1为未诱导的带有PET-32a空载体的菌体，2为诱导后的带有PET-32a空载体的菌体，3为未诱导的带有Serpin7重组质粒的菌体，4为诱导后的带有PxSerpin-7重组质粒的菌体，5为诱导后的带有Serpin7重组质粒的菌体破碎后上清的可溶性蛋白，6为诱导后的带有Serpin7重组质粒的菌体破碎后的沉淀，泳道7-15为Ni柱纯化过程中洗脱液，分别为柱后流出液FT以及不同咪唑浓度柱后洗脱液(5，10，100，150，200，250，300，500)；WB所用抗体为6×His单克隆抗体，稀释倍数为1：3000；SDS-PAGE染色方法为考马斯亮蓝染色，WB显色方法为DAB显色法；红色箭头指向为目标蛋白Serpin7重组蛋白。

图3为小菜蛾PO活力测定。采用DOPA法对小菜蛾血浆中PO活力进行测定，不同浓度的重组蛋白Serpin-7和不同浓度的多克隆抗体anti-Serpin7分别与小菜蛾血浆孵育10min，每孔加入200μL 2mM L-DOPA，轻轻震荡10s，使用酶标仪测定10min內，490nm波长下吸光值的变化，每30s测定一次。1.小菜蛾的血浆，2.注射GFP dsRNA的血浆；3.注射dsRNA后的血浆，4.小菜蛾的血浆和重组蛋白Serpin7温育，5.小菜蛾的血浆和多克隆抗体anti-Serpin7的温育。每min吸光值的变化0.01为1U；作图数值为平均值±SEM(n＝3)，柱上字母表示通过SPSS 25对组内数值进行LSD及Duncan差异显著性分析，显著水平p≤0.05。

图4为小菜蛾Serpin7 RNAi现象。注：图中L4440-GFP(CK)表示添食表达dsGFP对照组HT115细菌，dsPxSerpin-7表示添食表达L44440-Serpin-7处理组HT115细菌；处理组预蛹阶段出现畸形，蛹阶段出现畸形且有黑化紊乱现象。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

供试昆虫：小菜蛾P.xylostella L.华南农业大学教育部生物教育部工程研究中心保存，并在广东省生物农药创制与应用重点实验室中推广应用，光周期14L：10D，温度25±1℃，相对湿度60％～70％。

质粒与菌株：克隆载体pMD18-T，购自TaKaRa宝生物工程有限公司，大肠杆菌E.coli DH5α、BL21和原核表达载体pET32a由本实验室保存。表达外源dsRNA的HT115菌株和L4440质粒由本实验保存。大肠杆菌E.coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus由本实验室保存，苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis(Bt)菌株(HD73)由中国农业科学院植物保护研究所张杰研究员馈赠。

主要试剂药品：限制性内切酶EcoRⅠ和XhoI购自New England Biolab(NEB)公司；二抗羊抗兔-IgG-AP购自武汉博士德生物工程有限生物公司；显色试剂盒HRP-DAB底物显色购自天根生化科技公司；PVDF膜购自Bio-Rad公司。TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司；HIFiTaq PCR StarMix、Color Prestained protein Marker购自GenStar公司；RACE试剂盒

RACE 5’/3’Kit购自Clontech公司；DL2000 Marker、定量反转录试剂盒PrimeScript^TMRT Master Mix、定量试剂

Premix Ex Taq^TMII和dNTP Mixture购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Omega公司，GST融合蛋白纯化树脂购自GE Healthcare公司；DEPC，IPTG和EB Free均购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。

实施例1小菜蛾Serpin7基因的克隆及序列分析

1、小菜蛾总RNA的提取和cDNA第一链的合成

取小菜蛾4龄幼虫50～100mg，用液氮研磨后，使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，具体操作按照说明书进行。

检测抽提的RNA质量和浓度，标浓度定后分别参照反转录试剂盒(TaKaRa公司)说明书合成第一链cDNA和RACE试剂盒(Clontech公司)说明书合成5’-cDNA和3’-cDNA。

2、小菜蛾Serpin7全长cDNA序列的克隆

根据小菜蛾转录组获得的Serpin7的Unigene片段序列设计引物Serpin7-F和Serpin7-R(引物见表1)。25μL反应体系：HIFiTaq PCR StarMix 5μL，cDNA1μL，上/下游引物各1μL，ddH₂O 17μL。反应条件：94℃预变性2min；然后94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，共进行35个循环；72℃延伸8min。

将PCR产物切胶回收目的片段，克隆到T质粒载体(pMD18-T)(TaKaRa公司)，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR鉴定克隆子。抽提PCR检测为阳性克隆子的质粒DNA，双酶切和测序鉴定。

表1小菜蛾Serpin7基因克隆、表达检测的引物信息

3、小菜蛾Serpin7基因的克隆及序列分析

根据步骤2中获得Serpin7的cDNA序列信息设计引物，通过RT-PCR扩增，结果得到1391bp的Serpin7基因的cDNA全长序列，如SEQ ID NO:1所示。小菜蛾Serpin7基因的cDNA全长1391bp含有5’端非编码区(UTR)103bp和3’端非编码区82bp。该基因具有完整的开放阅读框(ORF)1206bp，编码401个氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。另外，通过SignalIP在线查找，含有22个氨基酸的信号肽(图1下划线部分)，379个氨基酸的成熟肽，预测成熟肽的蛋白分子质量44.121kDa，等电点为4.98；Serpin7含有一个RCL区(图1红色方框部分)，一个Hinge region区域(图1紫色区域)，含有P1酶切位点(图1蓝色圆圈)。

实施例2小菜蛾Serpin7的原核表达质粒的构建

根据小菜蛾Serpin7基因的ORF(open reading frame)序列设计一对特异性引物(表1)。为了便于将PCR产物克隆到表达载体pET32a上，在上游引物设计了EcoRⅠ酶切位点，下游引物中有XhoI酶切位点。PCR产物用EcoRⅠ和XhoI双酶切，经割胶回收纯化，与经同样酶切EcoRⅠ/XhoI的表达质粒pET32a连接，构建原核表达质粒pET32a-Serpin7，转化大肠杆菌DH5α中，酶切和测序鉴定序列和酶切位点的准确性。将酶切和测序鉴定正确的单克隆子，抽提质粒，转化到表达宿主菌BL21(DE3)中，测序鉴定，将测序正确的菌种，保存甘油菌。

实施例3小菜蛾Serpin7的原核表达以及多克隆抗体的制备

将单克隆接种于10mL LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素Amp)过夜培养，次日以1∶100稀释继续37℃培养，当A₆₀₀＝0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导融合蛋白的表达。37℃培养4h后，12000rpm，4℃离心收集培养物，弃上清。沉淀物用细菌裂解液(1.5％十二烷基氨酸钠，1mM PMSF，1％TritonX-100，1mg/mL溶菌酶)，冰上裂解30min后，间歇超声至菌液清亮；12000rpm，4℃离心收集上清，按照Ni-NTA Sefinose Resin(Sangon Biotech)一步纯化目的蛋白，纯化过程包括填柱、结合和洗涤。填柱：0.5mL的Ni-NTA珠子悬液，静止30min，待其沉降完全，10倍柱体积的PBS清洗柱子；结合：将裂解上清液上柱；洗涤：10倍柱体积Wash buffer清洗纯化柱，然后3倍柱体积Elution buffer洗脱蛋白，利用SDS-PAGE电泳和Western blot检测蛋白的纯化情况。结果如图2所示，由图2可知，SDS-PAGE电泳结果与预计融合蛋白分子量大小吻合。融合蛋白带有6His标签，进一步利用不同浓度咪唑进行蛋白纯化，SDS-PAGE和Western blot检测结果显示融合蛋白Serpin7在100mM咪唑浓度下的洗脱，浓度约为0.5mg/mL，结果如图2b。经透析、冷冻干燥并最终溶解于PBS(pH7.4)使其终浓度为1mg/mL，置于-70℃冰箱保存。将纯化后的融合蛋白pET32-Serpin7作为抗原，免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗血清anti-Serpin7。

实施例4小菜蛾Serpin7蛋白抑制PO活力

取正常健康的4龄幼虫，分别添食重组蛋白Serpin7(1μg，3μg，6μg，20μg)，多克隆抗体anti-Serpin7(1μg，3μg，6μg，20μg)24小时后，取小菜蛾血淋巴，4℃3000g离心10min，取上清，即为正常血浆备用；室温孵育10min，再加200μl 2mM L-DOPA，轻轻震荡10s，使用酶标仪测定10min内，490nm波长下吸光值的变化，每30s测定一次。PO活力测定结果如图3所示。添食重组蛋白Serpin7的小菜蛾血浆，出现PO活力极具下降，且具有明显的浓度效应，重组蛋白添食越多，PO活力越低，但是一旦饱和就不再下降了(20μg)；添食多克隆抗体anti-Serpin7的小菜蛾血浆，PO活力显著升高，也具有明显的浓度效应，加入的抗体含量越高，PO活力越高，但是一旦加入抗体的量足够大时(20μg)，PO活力不在变化。

实施例5小菜蛾Serpin7的RNA干扰载体的构建

以含有Serpin-7基因片段的cDNA为模板，设计一对带有酶切位点的特异性引物(L-Serpin-7F和L-Serpin-7R)对Serpin-7蛋白的功能区(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)扩增，利用高保真酶KOD PLU在25μL体系中进行扩增。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，回收PCR产物，用Xho I和Bgl II进行双酶切，回收酶切产物，放-20℃备用。

将保存的L4440空质粒的甘油菌接种于5mL的LB液体培养基中，放置于37℃，240rpm/min的摇床中过夜培养种子菌。将过夜培养的种子菌按1:100的比例分别接种于4mL含有Amp(100mg/L)和Tet(100mg/mL)双抗性的新鲜LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.6左右后提取质粒，质粒用Xho I和Bgl II进行双酶切切胶纯化回收。

将Serpin-7基因酶切回收产物与L4440酶切回收产物进行连接，反应体系如下：酶切后L4440质粒，3μL；Serpin-7表达片段，14μL；T4 DNA Ligase，1μL；T4 DNA LigaseBuffer，2μL；16℃生化培养箱中过夜连接。

将连接产物L4440-Serpin7转化到大肠杆菌感受态细胞DH 5α中，摇菌，抽提质粒。用Xho I和Bgl II进行双酶切鉴定，将菌体送广州艾基生物技术有限公司测序，将测序正确的菌体保存甘油菌，-80℃保存备用。

实施例6小菜蛾Serpin7的dsRNA的表达及功能验证

将带有L4440-Serpin7表达质粒的重组菌株HT115(DE3)，接种于含有Amp+(100mg/L)和Tet+(100mg/mL)双抗性的LB液体培养基中，37℃、240rpm/min摇菌6h，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导表达4h。将菌体离心12000rpm/min离心1min，收集菌体入液氮，研磨，研磨完全后，加入1000μL RNAiso Plus，以L4440空载体对照作为对照，同样进行RNA抽提，DNA凝胶电泳检测RNA的表达。

将带有L4440-Serpin7质粒转进HT115，进行培养，IPTG诱导后，收集菌体，原始摇菌体积与重悬体积为1：250。挑选龄期一致的健康4龄幼虫小菜蛾进行饲喂实验，每个处理100头，三个重复。饲料配制方法：将制备好的菌体，按照4g饲料加1mL菌体的比例拌饲料，饲喂空载作为阴性对照，将小菜蛾幼虫人工饲料饲养24h，取虫子的血淋巴，4℃3000g离心10min，取上清，测定血浆的PO活力。一直观察注射后虫子外表变化直至死亡，记录每天死亡率和变化。

利用添食法饲喂小菜蛾进行RNAi实验，结果如图4所示。观察表型发现饲喂Serpin7基因dsRNA的小菜蛾4龄幼虫大多数不能成功化蛹，少数即使化蛹也出现畸形，蛹体黑化紊乱等现象以致不能成功羽化。而饲喂L4440空载体dsRNA的小菜蛾4龄幼虫能正常发育，没有黑化，成功羽化。图3中血浆PO活力测定发现，RNAi后，小菜蛾PO的活力强烈提高，与对照比达到极显著水平。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因及其应用

<141> 2020-06-30

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1391

<212> DNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella )

<400> 1

ctatctctca ctgggagccg aacaatgctg ataaaaccct cccgactaaa atcgagaatt 60

tcgactatca gttccaacat cctttttgcg ctgtgcagta caaatggcta cttacacagt 120

tgtgtttctg tctctgttag ccttaatacc tctggctgca tcacaatgct cggtggaaaa 180

ggcgaagccg ggccttcgga gggccatcta cgacttcgca acagaactca cgaccagagt 240

cgccatcgac tctgaaaacc acttcgtgat gtcgcccctg tctttgtgga ctcttctggc 300

ggctgtgtct gaaggagctg actccgaaac cctcgttcaa ctgaagaggg cgctgcggct 360

acatccacga aagtgcttca acagcaaata ctacgagatt ttaaggggag tcgttgagag 420

tcaaggtgaa acgattctcg aaagaggtgg agctgttgta atagacgaag ggttttctgt 480

caagaaggct ttcaaaagcc ggatcgatgc ggctggtgtc tgcaaagtcc tgacgacgca 540

gttcgctgcg gcagaagacg cggcttctgc tataaattcc tacgttagtc gcgcgaccca 600

cggagcggtg gaagaaataa catcgccaga agatttggac ggcaagagtc ttctgctcct 660

agacacgata tacttcaaag gcaaatggac tgttccattc tccacagcgg atactgaggt 720

cagcactttc tacgacgagt tcggaggagc ggcaggggac gtgaacctta tgtttataac 780

tggagacttc aatgttgcac agatagataa aatccaggcg aaggttctag aactgccgta 840

tgccggcggg aagtactcta tgctcgtgtt tttgccgtac acagacgtgc cgcttgtcca 900

agtgattgaa gctcttaact tgattaattt acagtctata ttccacctct atgagaagaa 960

acccgcaagg actgtgatgg tgcaactgcc gaggtttaaa atcgaatcta acttggactt 1020

tttggtggag ttactgcaag atatgggcct cacgcatatg tttgatgaac aagccagttt 1080

ccctcttata tctgatcagg cactgtatgt gtccacttta ctgcagaagg ctaatattga 1140

agtgacagag gagggcaccg tggccagcgc agtgtctgaa gccggattct cttcacgatt 1200

gatgccagaa cagtttgtag ctcaaaagcc cttcttatac atgattgtgg ataaagttaa 1260

tgaagtggtc ctgtttactg gtgcctactc taaacctagt gtttattaag tacataaatt 1320

aattggtctg aattgtataa tgtttgtggt ttgagtaatg atctcacttg aggtaaattt 1380

tgcatcaatt c 1391

<210> 2

<211> 401

<212> PRT

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella )

<400> 2

Met Ala Thr Tyr Thr Val Val Phe Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ile Pro

1 5 10 15

Leu Ala Ala Ser Gln Cys Ser Val Glu Lys Ala Lys Pro Gly Leu Arg

20 25 30

Arg Ala Ile Tyr Asp Phe Ala Thr Glu Leu Thr Thr Arg Val Ala Ile

35 40 45

Asp Ser Glu Asn His Phe Val Met Ser Pro Leu Ser Leu Trp Thr Leu

50 55 60

Leu Ala Ala Val Ser Glu Gly Ala Asp Ser Glu Thr Leu Val Gln Leu

65 70 75 80

Lys Arg Ala Leu Arg Leu His Pro Arg Lys Cys Phe Asn Ser Lys Tyr

85 90 95

Tyr Glu Ile Leu Arg Gly Val Val Glu Ser Gln Gly Glu Thr Ile Leu

100 105 110

Glu Arg Gly Gly Ala Val Val Ile Asp Glu Gly Phe Ser Val Lys Lys

115 120 125

Ala Phe Lys Ser Arg Ile Asp Ala Ala Gly Val Cys Lys Val Leu Thr

130 135 140

Thr Gln Phe Ala Ala Ala Glu Asp Ala Ala Ser Ala Ile Asn Ser Tyr

145 150 155 160

Val Ser Arg Ala Thr His Gly Ala Val Glu Glu Ile Thr Ser Pro Glu

165 170 175

Asp Leu Asp Gly Lys Ser Leu Leu Leu Leu Asp Thr Ile Tyr Phe Lys

180 185 190

Gly Lys Trp Thr Val Pro Phe Ser Thr Ala Asp Thr Glu Val Ser Thr

195 200 205

Phe Tyr Asp Glu Phe Gly Gly Ala Ala Gly Asp Val Asn Leu Met Phe

210 215 220

Ile Thr Gly Asp Phe Asn Val Ala Gln Ile Asp Lys Ile Gln Ala Lys

225 230 235 240

Val Leu Glu Leu Pro Tyr Ala Gly Gly Lys Tyr Ser Met Leu Val Phe

245 250 255

Leu Pro Tyr Thr Asp Val Pro Leu Val Gln Val Ile Glu Ala Leu Asn

260 265 270

Leu Ile Asn Leu Gln Ser Ile Phe His Leu Tyr Glu Lys Lys Pro Ala

275 280 285

Arg Thr Val Met Val Gln Leu Pro Arg Phe Lys Ile Glu Ser Asn Leu

290 295 300

Asp Phe Leu Val Glu Leu Leu Gln Asp Met Gly Leu Thr His Met Phe

305 310 315 320

Asp Glu Gln Ala Ser Phe Pro Leu Ile Ser Asp Gln Ala Leu Tyr Val

325 330 335

Ser Thr Leu Leu Gln Lys Ala Asn Ile Glu Val Thr Glu Glu Gly Thr

340 345 350

Val Ala Ser Ala Val Ser Glu Ala Gly Phe Ser Ser Arg Leu Met Pro

355 360 365

Glu Gln Phe Val Ala Gln Lys Pro Phe Leu Tyr Met Ile Val Asp Lys

370 375 380

Val Asn Glu Val Val Leu Phe Thr Gly Ala Tyr Ser Lys Pro Ser Val

385 390 395 400

Tyr

<210> 3

<211> 379

<212> PRT

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella )

<400> 3

Ser Val Glu Lys Ala Lys Pro Gly Leu Arg Arg Ala Ile Tyr Asp Phe

1 5 10 15

Ala Thr Glu Leu Thr Thr Arg Val Ala Ile Asp Ser Glu Asn His Phe

20 25 30

Val Met Ser Pro Leu Ser Leu Trp Thr Leu Leu Ala Ala Val Ser Glu

35 40 45

Gly Ala Asp Ser Glu Thr Leu Val Gln Leu Lys Arg Ala Leu Arg Leu

50 55 60

His Pro Arg Lys Cys Phe Asn Ser Lys Tyr Tyr Glu Ile Leu Arg Gly

65 70 75 80

Val Val Glu Ser Gln Gly Glu Thr Ile Leu Glu Arg Gly Gly Ala Val

85 90 95

Val Ile Asp Glu Gly Phe Ser Val Lys Lys Ala Phe Lys Ser Arg Ile

100 105 110

Asp Ala Ala Gly Val Cys Lys Val Leu Thr Thr Gln Phe Ala Ala Ala

115 120 125

Glu Asp Ala Ala Ser Ala Ile Asn Ser Tyr Val Ser Arg Ala Thr His

130 135 140

Gly Ala Val Glu Glu Ile Thr Ser Pro Glu Asp Leu Asp Gly Lys Ser

145 150 155 160

Leu Leu Leu Leu Asp Thr Ile Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Thr Val Pro

165 170 175

Phe Ser Thr Ala Asp Thr Glu Val Ser Thr Phe Tyr Asp Glu Phe Gly

180 185 190

Gly Ala Ala Gly Asp Val Asn Leu Met Phe Ile Thr Gly Asp Phe Asn

195 200 205

Val Ala Gln Ile Asp Lys Ile Gln Ala Lys Val Leu Glu Leu Pro Tyr

210 215 220

Ala Gly Gly Lys Tyr Ser Met Leu Val Phe Leu Pro Tyr Thr Asp Val

225 230 235 240

Pro Leu Val Gln Val Ile Glu Ala Leu Asn Leu Ile Asn Leu Gln Ser

245 250 255

Ile Phe His Leu Tyr Glu Lys Lys Pro Ala Arg Thr Val Met Val Gln

260 265 270

Leu Pro Arg Phe Lys Ile Glu Ser Asn Leu Asp Phe Leu Val Glu Leu

275 280 285

Leu Gln Asp Met Gly Leu Thr His Met Phe Asp Glu Gln Ala Ser Phe

290 295 300

Pro Leu Ile Ser Asp Gln Ala Leu Tyr Val Ser Thr Leu Leu Gln Lys

305 310 315 320

Ala Asn Ile Glu Val Thr Glu Glu Gly Thr Val Ala Ser Ala Val Ser

325 330 335

Glu Ala Gly Phe Ser Ser Arg Leu Met Pro Glu Gln Phe Val Ala Gln

340 345 350

Lys Pro Phe Leu Tyr Met Ile Val Asp Lys Val Asn Glu Val Val Leu

355 360 365

Phe Thr Gly Ala Tyr Ser Lys Pro Ser Val Tyr

370 375

Claims (10)

1.一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.由权利要求2所述蛋白制得的重组蛋白，其特征在于，是将所述蛋白去除信号肽(1-22aa)前体后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.含有权利要求1所述Serpin7基因的重组表达载体或抑制Serpin7基因表达的RNAi载体。

5.权利要求1所述Serpin7基因或权利要求2所述丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7或权利要求3所述重组蛋白或权利要求4中所述抑制Serpin7基因表达的RNAi载体在调控十字花科蔬菜害虫天然免疫中的应用。

6.权利要求1所述Serpin7基因或权利要求2所述丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7或权利要求3所述重组蛋白或权利要求4所述抑制Serpin7基因表达的RNAi载体在防治十字花科蔬菜害虫或制备防治十字花科蔬菜害虫的药剂中的应用。

7.权利要求1所述Serpin7基因或权利要求2所述丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7在制备抗十字花科蔬菜害虫的转基因植物中的应用。

8.一种用于防治十字花科蔬菜害虫的药剂，其特征在于，包含小菜蛾丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin7。

9.一种用于防治十字花科蔬菜害虫的药剂，其特征在于，包含抑制Serpin7基因表达的制剂。

10.根据权利要求5或6所述的应用、8或9所述的药剂，其特征在于，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。

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