CN103589735A - 野生茄子StoWRKY6基因及其表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，公开了野生茄子StoWRKY6基因及其表达载体和应用。野生茄子StoWRKY6基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。采用农杆菌介导法将StoWRKY6基因过表达及RNAi载体转入马铃薯中，分别获得9株过表达及14株RNAi转基因植株。过表达转基因马铃薯的发病率和病情指数均明显地低于野生型对照；而RNAi转基因马铃薯的发病率和病情指数均高于野生型对照，几乎全部发病。这表明StoWRKY6基因在植物对黄萎病的防卫反应中起重要作用。本发明可以用于在植物中表达以增强植物对黄萎病的抗病能力，因而具有重要的育种价值。

Description

野生茄子StoWRKY6基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于生物领域，涉及野生茄子StoWRKY6基因及其表达载体和应用。

背景技术

黄萎病（Verticillium Wilt）是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）侵染引起的茄子重要病害之一,使植株果实小、质硬，且内部有褐色维管束病变，茎和根部的维管束变成褐色或棕褐色。植株在各个生长期均可发病，病害多在座果后开始表现症状，自下而上、或从一侧向全株扩展，是一种危害性很大的植物维管束病害。发病初期，叶缘或叶脉间褪绿变黄，逐渐发展到半边叶或整叶变黄，或黄化斑驳，或呈掌状黄斑。随着病情的发展，病株上的病叶由黄渐变成黄褐色向上卷曲，凋萎下垂以致脱落。重病株叶片往往落光，植株呈光杆或仅剩几张心叶，整株死亡。黄萎病严重影响着番茄、茄子、棉花、马铃薯等重要农作物的产量和品质，造成巨大的经济损失。

WRKY是一种植物特有的含有锌指结构的转录因子，同时也是植物体中最大转录因子家族之一。到目前为止，在拟南芥和水稻的基因组中分别发现了72和109个WRKY转录因子(Eulgemand Somssich,2007;Zhang and Wang,2005)。所有的WRKY转录因子都含有一个或者两个由60个氨基酸组成的WRKY结构域及一个锌指结构(Cx_4-5Cx_22-23HxH or Cx₇Cx₂₃HxC)组成，其中WRKY结构域为一个高度保守的多肽序列(WRKYGQK)(Rushton et al.,2010)。基于WRKY结构域的数量和锌指结构，WRKY转录因子又被划分为三类(I,II及III)，其中II类又可以细分为IIa,IIb,IIc,IId,Iie等(Eulgem et al.,2000)。

目前关于WRKY转录因子的研究主要集中在植物生长、发育，对生物逆境及非生物逆境的响应。大量实验结果表明，WRKY转录因子参与了这些过程，是植物体中一种重要的转录因子。在拟南芥中，检测的72个WRKY基因中有49个对细菌侵染和水杨酸处理出现了响应(Dong etal.,2003)，而且大部分第III类WRKY基因对SA和病菌处理都出现了瞬速的响应(Kalde et al.,2003)。用病菌处理时水稻(Kim et al.,2000;Wen et al.,2003;Liu et al.,2005)、马铃薯(Dellagi et al.,2000)、甘蔗(Lambais,2001)和甘菊(Ashida et al.,2002)中的一些WRKY基因也出现了上调表达。相对于植物体中其他多基因转录因子家族而言，WRKY基因家族中响应逆境的成员比例比较高，这表明WRKY转录因子在植物响应逆境中起到非常重要的作用(Ulker and Somssich,2004)。

通过基因工程，一些模式植物和其他少量经济作物中的WRKY转录因子的功能已经被验证。比如，过表达AtWRKY41的拟南芥植株对丁香假单孢杆菌（Pseudomonas syringae）的抗性得到增强，但对软腐欧氏杆菌却变的易感(Higashi et al.2008)。AtWRKY70是SA和JA防御信号途径中的一个重要成员，受到SA的诱导和JA的抑制，处于NPR1基因的下游，可以激活SA诱导基因，抑制JA响应基因，从而参与植物的防御反应。过表达AtWRKY70时，可以增加拟南芥对Pst抗性，抑制其表达则会增加拟南芥对E.c.carotonora的敏感性(Li et al.2004)。AtWRKY6的表达受到一些植物体内或者体外信号分子的诱导，参与植物衰老过程和抗性反应(Robatzek and Somssich2001)。通过系统表达分析，水稻与稻瘟病（Magnaporthe grisea）互作时，检测的45基因中15个的表达量出现了显著的增加。其中12个受M.grisea诱导的OsWRKY基因也不同程度的受到细菌性病害白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）的影响。在防御信号分子实验中，在SA处理的叶片中OsWRKY45和OsWRKY62的表达量受到诱导，OsWRKY10,OsWRKY82和OsWRKY85的表达受到JA的诱导，OsWRKY30和OsWRKY83在SA及JA处理时都有变化(Ryu et al.2006)。而作为水稻甲壳素低聚糖响应子的OsWRKY53参与了水稻的抗性响应过程(Chujo et al.2009)。水稻的等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2是水稻对M.grisea抗性的正调控子，而前者和后者分别是水稻对Xoo和Xoc抗性的负调控子和正调控子。这对等位基因对水稻病害的不同作用主要取决于它们参与的信号通路(Tao et al.2009)。在大豆中鉴定出了64个在非生物逆境下差异表达的GmWRKY基因，其中转GmWRKY13,GmWRKY21和GmWRKY54的拟南芥的抗逆性得到了增强(Zhou et al.2008)。棉花的GhWRKY15受到病菌、水杨酸、茉莉酸及甲基精的强烈诱导，相对于野生对照，过表达GhWRKY15的烟草表现出对病毒性和真菌性病害更强的抗性(Yu et al.2012)。烟草的CaWRKY58编码的蛋白属于第一类WRKY转录因子，负调控烟草对青枯病的抗性(Wang et al.2013)。

茄子(Solanum melongena)是一种世界性的茄科蔬菜作物，大部分茄子栽培品种的抗病性不高，常常受到自然界中病菌的侵害，导致产量损失。它的野生种托鲁巴姆（Solanum torvumSwartz）对许多植物病害都有很强的抵抗能力，是一种重要的种质资源(Gousset et al.2005)。从托鲁巴姆中克隆WRKY6基因并对其黄萎病抗病性评价，将为茄科作物育种提供抗性基因资源，同时将有利于加快茄子抗黄萎病品种选育进程。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供一种野生茄子StoWRKY6基因，该基因具有较高的抗黄萎病能力，可以被用于植物抗黄萎病新品种的培育。

本发明是通过如下技术方案实现的：

提供一种野生茄子StoWRKY6基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。StoWRKY6基因cDNA的全长为882bp。

所述的野生茄子StoWRKY6基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白分子量为33.44kDa,理论等电点为5.71。

本发明还提供含有所述的StoWRKY6基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选以pCMBIA1304为出发载体，将野生茄子StoWRKY6基因插入pCMBIA1304载体的Spe I和Bgl II酶切位点所得。

本发明还提供含有所述的StoWRKY6基因或所述的重组表达载体的宿主细胞。

本发明还提供所述的StoWRKY6基因在构建抗黄萎病转基因植株中的应用。

本发明还提供所述的含StoWRKY6基因的重组表达载体在构建抗黄萎病转基因植株中的应用。

有益效果：本发明克隆获得了一种新的野生茄子StoWRKY6基因，采用农杆菌介导法将StoWRKY6基因过表达载体转入马铃薯中，获得PCR阳性转基因植株。转基因马铃薯的黄萎病抗性分析表明，过表达转基因马铃薯的发病率和病情指数均明显地低于野生型对照，而StoWRKY6基因的RNAi转基因马铃薯的发病率和病情指数均高于野生型对照。这表明StoWRKY6基因在植物对黄萎病的防卫反应中起重要作用，可以被用于植物抗黄萎病育种研究。

附图说明

图1StoWRKY6组织表达，a图:1～3泳道分别表示：根、茎、叶;b图,1～3泳道分别表示：b,衰老叶、成熟叶、幼叶。

图2SA和JA处理下StoWRKY6的表达分析

图36叶期野生茄子接种大丽轮枝菌指定时间下，半定量RT-PCR分析。

图4pCAMBIA1304-StoWRKY6的表达载体结构及酶切位点

图5pGSA1285-StoWRKY6的表达载体结构及酶切位点

图6转基因株系的PCR检测

P：质粒；WT:野生型植株；M：分子量标记；O4,O5,O8,O11,O13,O14,O17,O18,O19,O20分别代表:过表达转基因株系4,5,8,11,13,14,,17,18,19,20

图7转基因株系的PCR检测

P：质粒；WT:野生型植株；M：分子量标记；R1,R2,R4,R5,R6,R7,R8,R10,R12,R13,R14,R15,R20和R24分表代表:RNAi转基因株系1,2,4,5,6,7,8,10,12,13,14,15,20和24

图8不同转基因株系中StoWRKY6表达的半定量RT-PCR分析

WT：野生型马铃薯；O4,O5,O8,O11,O13,O14,O17,O18,O19,O20:过表达转基因株系4,5,8,11,13,14,,17,18,19,20

图9不同转基因株系中StoWRKY6表达的qRT-PCR分析

WT：野生型马铃薯；O4,O5,O8,O11,O13,O14,O17,O18,O19,O20:过表达转基因株系4,5,8,11,13,14,17,18,19,20

图10不同转基因株系中StoWRKY6表达的半定量RT-PCR分析

WT：野生型马铃薯；R1,R2,R4,R5,R6,R7,R8,R10,R12,R13,R14,R15,R20和R24:RNAi转基因株系1,2,4,5,6,7,8,10,12,13,14,15,20和24

图11不同转基因株系中StoWRKY6表达的qRT-PCR分析

WT：野生型马铃薯；R1,R2,R4,R5,R6,R7,R8,R10,R12,R13,R14,R15,R20和R24:RNAi转基因株系1,2,4,5,6,7,8,10,12,13,14,15,20和24

图12V.dahliae侵染14天后转基因马铃薯及其野生型对照植株的表型

具体实施方式

实施例1StoWRKY6基因的克隆

采用Trizol试剂盒法提取野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）总RNA。使用宝生物工程公司的反转录酶体系进行合成cDNA第一链。

设计中间保守序列引物P1(正向引物W1:5’-ATATGGGTAACTCATCGAMTSATC-3’（SEQ IDNO.3）（M代表A或C；S代表C或G）和反向引物W2:5’-TGTTTTTGTCCATCTTGTCC-3’（SEQID NO.4）)，以合成的cDNA第一链PCR扩增得到StoWRKY6cDNA中间保守区域。PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳后用宝生物公司的胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测单克隆，阳性克隆送华大基因进行测序，测序得到长约382bp的中间片段。

根据上述测序的野生茄子StoWRKY6cDNA中间片段序列在NCBI上的blastn比对结果，设计全长引物p2(正向引物W3:5’-ATGGGAAACTCATCGWATCA-3’（SEQ ID NO.5）（W代表A或T），反向引物W4:5’-AATTCGTACACCATCTCTAT-3’（SEQ ID NO.6）)。利用引物P2进行扩增，PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳后用宝生物公司的胶回收试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，转化大肠杆菌DH5α，PCR检测单克隆，送阳性克隆到华大基因进行测序，用DNAssist软件对测序结果进行分析，该基因ORF大小为882bp，如SEQ ID NO.1所示，起始密码子ATG；终止密码子TAG；氨基酸序列长度为294aa，如SEQ ID NO.2；蛋白分子量为33.44kDa；理论等电点为5.71，氨基酸序列分析表明，该基因含有WRKY家族转录因子所特有的结构域，属于第三类WRKY转录因子，将它命名为StoWRKY6。

实施例2StoWRKY6基因组织表达分析

分别提取6叶期野生茄子根、茎、叶、衰老叶、成熟叶、幼叶总RNA，反转录后得到的cDNA作为模板,利用引物QW(正向引物5’-TGAAGCCTCTGGTAGCCGT-3’（SEQ ID NO.7）和反向引物5’-CAAAATTCCAAAGACCCTCC-3’（SEQ ID NO.8）),进行半定量RT-PCR分别检测StoWRKY6基因在野生茄子不同组织的表达。PCR扩增条件94℃预变性4min，然后94℃40s；58℃40s；72℃30s，进行30个循环，最后72℃10min。PCR产物点样,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。内参采用组成型表达的EF1α基因，引物分别为EF1α1：5′-GTGGTGGAGTCAATAATGAGGAC-3′（SEQ ID NO.9）和EF1α2：5′-TCGACAACAGAAACATCAGCAGT-3′（SEQ ID NO.10）。PCR条件为：94℃预变性4min，然后94℃40s；58℃30s；72℃30s，最后72℃10min，循环数为30个。结果表明该基因在所有检测的叶组织中都有表达，在根、茎中未检测到，但出现差异性。其中，StoWRKY6在衰老中表达量最高，成熟叶中表达次之，幼叶最低（图1）。

实施例3SA、JA及大丽轮枝菌诱导下StoWRKY6基因表达半定量分析

研究水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）来胁迫下StoWRKY6的表达情况。取生长整齐、健康无病的6叶期幼苗进行化学处理如下：水杨酸和茉莉酸的终浓度分别为300mM和200μm，对照处理为Tween20/水，以使其与相应的化学处理条件相似。所有植株在处理后于0h、2h、4h、12h、48h采样叶片并全部冻存与-70冰箱中。提取RNA用于半定量反转录PCR（RT-PCR）分析，内参采用组成型表达的EF1α基因。利用引物QN进行半定量RT-PCR分别检测在SA和JA处理下，野生茄子植株中StoWRKY6基因的表达。PCR产物点样,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。半定量结果显示：StoWRKY6在未处理的野生茄子叶子中有一定量的表达，在SA处理2h后表达开始上升，在12h时达到最大，随后出现下降。经JA处理2h后，StoWRKY6的表达出现下降，在12h出现稍微回升，但低于本底水平（图2）。

取茄子黄萎病病原菌（Verticillium dahliae Kleb）强致病菌株，用以下两种方法培养：①在PDA固体培养基上25℃恒温培养2周，用灭菌水收集孢子制成孢子悬浮液（浓度5×10⁷/mL）；②菌落在PDA培养基上长至直径为3～5cm，从边缘打取直径0.4cm的菌片，移入Czapeck’s液体培养基中，每瓶移入2个菌片，于25℃恒温下振荡（120rpm）培养2周后，用8层纱布过滤，以考马斯亮蓝法测定并调整粗毒素浓度至8mg/mL。混合两种液体进行植株侵染以达到最强致病效果。侵染过程：从基质中小心取出整株幼苗用自来水洗净，将第1片真叶以下部分置于5mL离心管中，加入上述混合液直至与管口平，用封口膜密封管口，以防止液体蒸发。以无菌水处理为对照，接种苗置于25℃恒温生长箱，12h/12h光照/黑暗，光照度为200mmol/(m·s)。接种后于0d、1d、2d、3d、4d采样叶片并全部冻存与-70冰箱中，提取RNA用于半定量反转录PCR（RT-PCR）分析，内参采用组成型表达的EF1α基因。半定量结果显示：StoWRKY6在未处理的野生茄子叶子中有一定量的表达，经大丽轮枝菌侵染1d后表达显著上升，在第2d时出现下降最高，最后第4天时表达又剧烈上升（图3）。

实施例4StoWRKY6表达载体构建与转基因植株的获得

（1）StoWRKY6过表达载体的构建

设计引物p3(正向引物5’

GAAGATCTTCCTATGGGAAACTCATCGAATCA-3’（SEQ IDNO.11），反向引物5’

GACTAGTCCACAATTCGTACACCATCTCTAT-3’（SEQ ID NO.12）)，下划线分别为Spe I和Bgl II酶切位点序列。以野生茄子cDNA为模板，p3为引物进行PCR扩增StoWRKY6基因，琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物，在37℃进行Spe I和Bgl II双酶切；同时，将提取pCAMBIA1304载体（购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心）37℃进行Spe I和Bgl II双酶切5h后，电泳回收pCAMBIA1304载体大片段，此即为带有SpeI和Bgl II酶切位点粘性末端的质粒，可以用于连接；将上述两种酶切产物按照3～10：1摩尔比混合，在T4DNA连接酶的作用下16℃连接12h，连接产物直接用于对转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR检测抗生素抗性单克隆，扩大培养阳性单克隆，提取重组质粒，测序验证。测序正确，表达载体构建成功，命名为pCAMBIA1304-StoWRKY6。StoWRKY6插入载体位置见图4。

（2）StoWRKY6RNAi载体的构建

分别设计引物P4(正向引物5’-CATGCCATGGCATGATCCAAGACAATCCACAACG（SEQ IDNO.13）和反向引物5’-GGATTTAAATCCATGACATAACATCGGGCG-3’（SEQ ID NO.14），下划线分别为NcoI和SwaI酶切位点)和P5(正向引物5’-GACTAGTCATCCAAGACAATCCACAACG-3’（SEQ ID NO.15）和反向引物5’-CGGGATCCCGATGACATAACATCGGGCG-3’（SEQ ID NO.16），下划线分别为SpeI和BamHI酶切位点)用于扩增StoWRKY6基因部分正义片段和反义片段。以野生茄子cDNA为模板，P4及P5为引物，分别进行PCR扩增，得到StoWRKY6基因部分正义片段和反义片段，琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物，进行相应的双酶切。构建RNAi载体时，首先，将提取pGSA1285载体在37℃用NcoI和SwaI进行对应的双酶切5h后，电泳回收pGSA1285载体大片段，与双酶切后的正义片段相连，连接产物直接用于对转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR检测后，提取质粒后再用SpeI和BamHI进行双酶切，回收后与与双酶切后的反义片段相连，将StoWRKY6基因部分正义和反义片段部分分别插入到表达载体pGSA1285（invitrogen）360bp GUS内含子两端，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR检测抗生素抗性单克隆，扩大培养阳性单克隆，提取重组质粒，送北京六合华大生物公司测序。测序正确，表达载体构建成功，命名为pGSA1285-StoWRKY6。StoWRKY6插入载体位置见图5。

（3）农杆菌转化

将构建好的pCMBIA1304-StoWRKY6和pGSA1285-StoWRKY6RNAi两种重组载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404(购买自北京天恩泽基因科技有限公司)，采用冻融热激法进行农杆菌的转化。

（4）StoWRKY6转化马铃薯Désirée

预培养与共培养：选取生长期20d左右的马铃薯组培苗，将无菌苗剪切成长约0.5cm不带叶片和腋芽的茎段，接种于预培养基Y₂(MS+0.2mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L2,4-D)上，在25℃黑暗条件下预培养2d。然后用OD₆₀₀=0.6的农杆菌菌液侵染茎段，侵染时间为5～10min，用滤纸吸干多余菌液后，将外植体置于共培养基Y₂(MS+0.2mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L2,4-D)上，25℃黑暗条件下共培养2d。

芽的分化再生：将共培养后的茎段用MS液洗去外植体周围的农杆菌，在滤纸上吹干，转到愈伤分化培养基MGT(MS+0.3mg/L GA₃+0.1mg/L TDZ+250mg/L Cef+10mg/L Hyg B)上，在光下培养，进行愈伤诱导及芽分化培养。每15天换一次培养基。对于RNAi实验组，就是将培养基中的10mg/L Hyg B替换为2mg/L Geneticin（G418）。

再生植株的抗性筛选：一个月后，当抗性分化芽长到约1～2cm高时，剪下转入生根筛选培养基(MS+10mg/L Hyg B+250mg/L Cef)中，RNAi组将培养基中的10mg/L Hyg B替换为2mg/LG418。当幼苗生长4周左右后，具有Hyg B和G418抗性的再生植株将生根生长，保持翠绿，将抗性苗转入MS培养基，进行壮苗培养一个月，转移到基质塑料杯中炼苗半个月，最后被移栽在盆中，置于大棚内生长。

（5）转基因马铃薯植株的分子鉴定

提取转pCMBIA1304-StoWRKY6的抗性植株总DNA，用半基因半载体特异引物P6(正向引物5’-CCACGACGATTTAGAACAAC-3’（SEQ ID NO.17）和反向引物5’-AAGAAGATGGTCCTCTCCTG-3’（SEQ ID NO.18）)对过表达StoWRKY6马铃薯转基因组进行PCR检测，以转化植株的总DNA为模板，pCMBIA1304-StoWRKY6质粒为阳性对照，野生型植株总DNA作为阴性对照。采用PCR对25株Hyg B抗性植株进行检测，有9株得到了与阳性质粒同样的目的基因片段扩增条带(742bp)，对照马铃薯植株没有产生条带(图6)，图中为PCR阳性的电泳图。

提取转pGSA1285-StoWRKY6的抗性植株总DNA，用特异引物P7(正向引物5’-TACAGCGAAGAGGCAGTCAAC-3’（SEQ ID NO.19）和反向引物5’-GCGCTCTATCATAGATGTCGCT-3’（SEQ ID NO.20）)对RNAi马铃薯转基因组进行PCR检测，以转化植株的总DNA为模板，pGSA1285-StoWRKY6质粒为阳性对照，野生型植株总DNA作为阴性对照。采用PCR对32株G418抗性植株进行检测，有14株得到了与阳性质粒同样的目的基因片段扩增条带(570bp)，对照马铃薯植株没有产生条带(图7)，图中为PCR阳性的电泳图。

（6）转基因马铃薯植株StoWRKY6mRNA的表达分析

分别提取植物总RNA，反转录成cDNA，用EF-1a基因做内参。用目的基因引物QW（SEQ IDNO.7/SEQ ID NO.8）对转基因马铃薯过表达组和RNAi组PCR阳性植株进行PCR，比较不同转基因株系间的表达情况。在上述均一化的模板中加入基因特异引物QW，按照以下PCR程序进行扩增。取相同体积扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，通过目标条带的亮度来大致判断目标基因的表达量。分别选取苗龄约为一个月的PCR阳性盆栽转StoWRKY6基因马铃薯株系和野生型马铃薯为材料，分别提取RNA，进行半定量PCR分析。结果表明，其中O4,O8,O11,O13和O17五个株系的表达量高于野生型对照，我们随机选择O8,O13这两个株系进行实时荧光定量PCR检测。

将反转录的cDNA稀释6倍后用作qRT-PCR的模板，以QW为引物。以EF-1a为内参，在AppliedBiosystems7300实时荧光定量PCR仪(ABI公司)上进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，一次平行实验设3次重复。扩增程序：94℃4min，40×(95℃20s，57℃20s,72℃40s)

相对表达量的计算：在进行完qRT-PCR后，可根据得到的CT值计算目标基因在不同株系，不同组织中的相对表达量，即2^-△△CT。其中：

ΔΔCT=(C _T.Target-C_T.EF-1α)×X-(C_T.Target-C_T.EF-1α)×T.

X表示各物种的不同组织，T表示经GAPDH校正后一倍量的目标基因表达量。

结果显示O8和O13两个株系中StoWRKY6mRNA的表达量分别比对照高2.0和5.5倍。半定量PCR和实时荧光定量PCR结果基本一致(图8和图9)。

选取苗龄约为一个月的PCR阳性盆栽RNAi转基因马铃薯株系和野生型马铃薯为材料，分别提取RNA，进行半定量PCR分析（方法同上）。结果表明，转基因株系StoWRKY6mRNA表达量均比对照低，其中R12的表达量最低。随后，选择其中四个表达量较低的株系进行实时荧光定量PCR检测。结果显示R1、R2、R12和R20四个株系中StoWRKY6mRNA的表达量分别是对照的4/10,8/100,6/100,5/10倍。半定量PCR和实时荧光定量PCR结果基本一致(图10和图11)。

实施例5转StoWRKY6基因株系的抗病性鉴定

（1）病原菌与粗毒素液的制备

取茄子黄萎病病原菌(V.dahliae)强致病菌株，用以下两种方法培养：(1)接种大丽轮枝菌于新鲜的PDA固体培养基上，25℃培养14天。用灭菌的蒸馏水收集病原菌孢子获得孢子悬浮液，浓度为5×10⁷个mL^-1。(2)菌落在PDA培养基上长至直径为3～5cm，从边缘打取直径0.4cm的菌片，移入Czapeck’s液体培养基中，每瓶移入2个菌片，于25℃恒温下振荡(120rpm·min^-1)培养2周后，用8层纱布过滤，以考马斯亮蓝法测定并调整粗毒素浓度至8mg·ml^-1，混合两种液体进行植株侵染以达到最强致病效果，备用。

（2）病原菌与粗毒素液的侵染

将转基因植株与对照种于营养土中，放置于大棚，常规管理。取苗龄40天的转基因植株与对照植株，分为两组，一组用孢子浓度为5×10⁷个mL^-1的病原菌和粗毒素的混合液侵染根部，另一组用水处理做对照。

（3）病情指数调查分析

选取转基因马铃薯过表达株系O8、O13，RNAi株系R2、R12及其野生型Désirée进行黄萎病菌V.dahliae接种试验并进一步调查其病情指数。采用浓度5×10⁷个mL^-1浓度的大丽轮枝菌孢子悬浮液对40天苗龄期的转基因马铃薯和其野生型马铃薯进行侵染，每个株系各10株。接种后2d～12d内进行发病调查，以无新增发病植株时的最后一次调查结果计算病情指数和发病率。分级标准计算方法：0级：叶片上无病斑；1级：1～2枚叶片出现萎凋；2级：3～5枚叶片出现萎凋；3级：大部分叶片出现萎凋；4级：植株萎凋枯死或即将萎凋枯死(叶鹏盛，2006)。

病情指数计算方法采用反应型记载标准：免疫(I)：病情指数为0；高抗(HR)：病情指数在15以下；抗病(R)：病情指数在15～30；中抗(MR)：病情指数在30～40；感病(S)：病情指数在40～60；高感(HS)：病情指数在60以上。病情指数＝[∑(病级株数×代表数值)／(株数总和×发病最高级的代表数值)]×100。发病率的计算公式为发病率＝发病株数／调查总株数×100％。

如图12和表1所示，无论病情指数还是发病率，过表达StoWRKY6的转基因株系都明显地低于对照植株，其中O13的病情指数和发病率最低，病情指数和发病率只有45和60%，而对照株系的这两个指标分别为67.5和80%。对于RNAi株系，特别是R12，其病情指数和发病率分别达到87.5和100%。而R11株系的这两个指标也达到了70和90%，都高于对照植株。在表型上，接种V.dahliae14天后，O8、O13叶片基本保持绿色，特别是O13株系只有个别叶片变黄，而野生型马铃薯植株叶片枯黄，落叶较多。而两个RNAi株系的叶片基本都变成枯黄色，特别是R12株系整株都葳焉，茎段也出现腐烂。

表1转基因马铃薯抗病性鉴定统计结果

Claims (7)

1.一种野生茄子StoWRKY6基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的野生茄子StoWRKY6基因编码的蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的StoWRKY6基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体是将所述的StoWRKY6基因插入pCAMBIA1304表达载体CaMV35S启动子和NOS终止子之间所得。

5.含有权利要求1所述的StoWRKY6基因或权利要求3所述的重组表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的StoWRKY6基因在构建抗黄萎病转基因植株中的应用。

7.权利要求3所述的重组表达载体在构建抗黄萎病转基因植株中的应用。

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