CN103275214A - 对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因工程制备与鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因工程的制备与质谱鉴定方法。Serpin家族成员通过调节一系列丝氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应，在调节机体免疫及其它重要生理功能方面发挥着重要作用。我们在前期研究中，从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin,GenBank注册号：DQ318857），初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒（WSSV）引发的对虾先天免疫应答反应。本发明利用基因工程的方法成功获得了重组对虾serpin型蛋白酶抑制剂，其分子量约为45kD，纯化复性后得率为0.3g/L培养基，质谱鉴定结果验证了重组蛋白的正确性。本发明中重组目的蛋白的获得为研究对虾Fc-serpin基因的免疫学功能和调控机制奠定了基础。

Description

对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因工程制备与鉴定方法

本发明得到国家973计划项目（2012CB114405）、国家863计划项目（2012AA092205和2012AA10A401）、国家科技支撑计划项目（2011BAD13B04和2011BAD13B07）、天津市自然科学基金项目（10JCYBJC09200）和天津师范大学博士基金项目（52LX18和52LX19）的资助。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin）的基因工程制备和鉴定方法。

背景技术

中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是具有重要食用和营养价值的我国特有经济虾种。近年来频繁爆发的对虾病害问题严重制约着我国水产养殖业的可持续发展，白斑综合症病毒的高度感染性和致死性，以及中国明对虾自身免疫力低下是两大根本原因。突破这一瓶颈的关键在于病害防治、抗病品种培育等理论与实践两方面工作的结合与深入，对虾先天免疫机制的深入研究以及病害防治手段的创新与改进，是解决问题的根本措施，不仅可以为该物种的病害防治、抗病新品种的培育和对虾健康养殖提供理论指导，同时还可以丰富和加深我们对无脊椎动物先天免疫机制的认识，进而为对虾养殖中的病害防治提供新思路和新方法。

丝氨酸蛋白酶（serine protease, SP）是一类重要的蛋白水解酶，广泛存在于动植物及病原微生物中，介导了机体中很多重要的免疫反应，如血淋巴凝结、补体激活、黑化、吞噬、包囊等，而丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor, SPI）作为分子开关调控着这些反应的进程。SPI通过调控SP活力参与蛋白酶级联反应，它作为精确调节SP活力的控制因子，可以防止蛋白酶的过量激活，从而避免宿主自身组织的损伤和破坏。SPI主要存在于血浆或血细胞的颗粒中，共同参与一系列重要的生理功能，包括参与消化作用、受精作用、血液凝结、纤维蛋白溶解、胚胎发育和免疫过程等。节肢动物血淋巴中已经发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可根据其结构特点、结合机制和功能分为四个家族：Kazal家族、Kunitz家族、α-巨球蛋白家族和Serpin家族，甲壳动物中的SPI则主要分属于Kazal和Serpin家族。Serpin家族结构序列高度同源，C-端为反应中心环区（reactive centre loop, RCL），其P1位点决定成员的抑制专一性，靶酶识别的机制为诱导构象改变模型。节肢动物的SPI在免疫调节与防御中发挥着重要作用，例如凝结作用、proPO级联反应、细胞因子激活和对病原的选择消化抑制真菌和细菌蛋白酶的活性等，从而保护机体免受病原微生物侵害。

目前已从多种动物中分离纯化出Serpin型抑制因子，并对其结构和功能做了初步研究。从经细菌刺激的天蛾幼虫血淋巴中分离到的serpin-6蛋白可以选择性的抑制酚氧化酶原激活酶-3（PAP-3），对该基因进行克隆并原核表达后发现，重组的蛋白在体外可以特定的抑制PAP-3并阻断酚氧化酶原激活系统。目前在甲壳动物的serpin的研究中，仅在鲎（Tachypleus tridentatus）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）和斑节对虾（Penaeus monodon）中有相关报道，主要围绕其基因克隆、组织分布、表达特征和初步的活性分析方面。我们在前期研究中，从中国明对虾（ Fenneropenaeus chinensis ）血细胞中克隆获得一个典型的Serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin），细菌或病毒（WSSV）的感染可诱导血细胞中该基因表达量的显著上调，表明其在先天免疫应答过程中可能发挥着重要作用。

发明内容

本专利在现有技术研究的基础上，将目的基因（Fc-serpin）构建到表达载体后转化宿主菌，进行目的蛋白的诱导表达和纯化复性，最后通过质谱分析对表达产物进行鉴定。利用原核重组表达获得了对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂并对其进行了质谱鉴定，获得的重组目的蛋白为研究对虾serpin型蛋白酶抑制剂基因的免疫学功能和调控机制奠定了基础，也为揭示甲壳动物抗病的分子基础和对虾病害防治药物的开发进行了前期准备。

因此，本发明的一个目的是提供一种重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂，其特征在于该重组的对虾serpin型蛋白酶抑制剂的蛋白分子量约为45kD，纯化复性后得率为0.3g/L培养基。

本发明的另一个目的是提供一种重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂的基因工程制备方法，其特征在于它是将对虾Fc-serpin基因（GenBank注册号：DQ318857；我们前期已克隆并发表了相关文章：Fish & Shellfish Immunology. 2009. 26: 345-351.）与表达载体连接，完成目的表达载体（pCR^®T7/NT TOPO^®TA-Fc-Serpin）的构建，并转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，进行目的蛋白的诱导表达和纯化复性。选阳性克隆进行测序鉴定。对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂的鉴定方法。质谱鉴定结果显示重组目的蛋白中有3条肽段与我们前期克隆的中国明对虾的serpin serine proteinase inhibitor基因推导的氨基酸序列（GenBank: ABC33916）完全匹配。由此可以判定，上述蛋白条带即为重组表达的目的蛋白rFc-serpin，中国明对虾Fc-serpin成熟肽成功地获得了体外重组表达。

本发明采用含有测序正确质粒的菌体，进行重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析，诱导后发现在45kD附近出现了特异性条带，该蛋白的表达量随着诱导时间的延长而显著增加，5小时后表达量达到平台期，通过凝胶成像系统分析发现，目的蛋白谱带的表达量占宿主菌总蛋白含量的30%左右。

本发明对重组目的蛋白进行分离纯化及复性分析，电泳检测显示在45KD附近位置有单一条带，这与rFc-serpin预期分子量（46.55kD）的结果相一致，纯化的目的蛋白复性后得率约为0.3g/L培养基。

本发明将目的蛋白条带进行切胶、胶内酶解和离子阱质谱分析与鉴定，结果显示： rFc-serpin中有3条肽段与我们前期克隆的中国明对虾的serpin serine proteinase inhibitor基因推导的氨基酸序列（GenBank: ABC33916）完全匹配。由此可以判定，上述蛋白条带即为重组表达的目的蛋白rFc-serpin，中国明对虾Fc-serpin成熟肽成功地获得了体外重组表达。

本发明进一步公开了用于对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因原核重组表达的特异性引物：SPI-f：5’-ACGCGGTCTGTTTAGGTG-3’

和SPI-r：5’-AACTTCTGGCGGTGTCG-3’。

本发明也公开了对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂在预防与治疗对虾常见致病菌的高度感染性方面的应用。

本发明更加详细的制备方法如下：

一种对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（Fc-serpin）的基因工程制备和质谱鉴定方法，其特征是包括如下主要步骤：

(1) Fc-serpin原核表达载体的构建：

将测序正确的目的基因成熟肽区域与表达载体质粒pCR®T7/NT TOPO®TA进行连接，构建重组表达质粒pCR^®T7/NT TOPO^®TA-Fc-Serpin，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞后测序。

(2) 重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析：

利用诱导剂IPTG对含有重组表达质粒的菌体进行不同时间的诱导表达，收集样品进行电泳检测，以确定蛋白的最佳诱导时间。

(3) 重组蛋白的分离纯化及复性：

利用固定金属亲和层析（IMAC）和Ni-NTA技术对目的蛋白进行分离纯化，利用梯度尿素透析法进行蛋白的复性处理。

（4）目的蛋白的质谱鉴定：

将目的蛋白进行切胶、酶解和离子阱质谱分析鉴定，发现其有三个肽段与中国明对虾的serpin型蛋白酶抑制剂相匹配，证明对虾Fc-serpin成熟肽成功地获得了体外重组表达。

本发明的有益效果是：

（1）本发明首次对对虾serpin型蛋白酶抑制剂基因进行了体外原核重组表达和质谱鉴定，可以高效、大量的在体外获得对虾serpin型蛋白酶抑制剂蛋白。

（2）对虾serpin型蛋白酶抑制剂蛋白的获得可以为研究该基因的免疫学功能和调控机制奠定基础。

（3）根据后续对该重组目的蛋白的活性和功能研究的结果，有望将其开发为防御病原的抗菌或抗病毒类药物；同时可通过调控作为分子开关的Fc-serpin基因的表达，来调节免疫通路中关键酶的活性，从而提高对虾先天免疫水平，增强抗病力；并能够为进一步了解同类经济水产动物的免疫防御系统及其分子调节机制奠定基础，可为此物种的健康养殖和资源保护做出贡献。

附图说明：

图1为Fc-serpin基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳；

图2为质粒双酶切图谱；其中M：DNA分子量标记DL2000；1：双酶切后的T载体；2：目的条带Fc-serpin（1024bp）；3：未酶切的克隆载体（pMD-18T/serpin）；4：未酶切的表达载体（pCR®T7/NT TOPO®TA）；5：双酶切后的pCR®T7/NT TOPO®TA载体片段；

图3为不同诱导时间对rFc-serpin表达量的影响；

图4为重组蛋白rFc-serpin的纯化结果；

图5为重组目的蛋白中与中国明对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂相匹配肽段的二级质谱图；其中A、B、C分别为三个肽段-LSGNNLR-，和 -DNETNNNLFMGVYR-和-PFLFLIR-的匹配分析结果。

具体实施方式：

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。

实施例 1 ： Fc-serpin 原核表达载体的构建

克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司，表达载体pCR^®T7/NT TOPO^®TA购自Invitrogen公司，大肠杆菌TOP-10F’和表达宿主菌BL21(DE3)plysS感受态细胞购均自北京市天根生化科技有限公司。DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、内切酶BamH

、内切酶Bst B

、dNTP、DNA marker DL2000均购自TaKaRa公司，Plasmid Mini Kit、Agarose gel DNA extraction Kit均购自上海生物工程有限公司；其他试剂为国产或进口的分析纯产品。实验所用引物为SPI-f（5’-ACGCGGTCTGTTTAGGTG-3’）和SPI-r（5’-AACTTCTGGCGGTGTCG-3’），于上海生工合成。

（1）PCR扩增及产物的纯化：

根据中国明对虾基因Fc-SPI的成熟肽编码区cDNA序列（GenBank注册号：DQ318857）和pCR®T7/NT TOPO®TA质粒上存在的多克隆位点（MCS）设计原核表达所需的引物，上游引物SPI-f的5’端含BamH

酶切位点，下游引物SPI-r的5’端含Bst B

酶切位点。以对虾血细胞mRNA反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃变性4 min，1个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10 min，1个循环；4℃保温。

PCR反应体系如下：

PCR产物在1％的琼脂糖凝胶（含EB）上进行电泳，凝胶成像系统观察照相，见图1。切下预期大小处特异性的目的条带，用Agarose gel DNA extraction Kit回收DNA，方法按试剂盒的说明手册进行，最后DNA溶解于适量超纯水中，-20℃保存备用。

（2）PCR产物连接到T-载体：总体系5μL，16℃连接过夜。

（3）CaCl₂法制备感受态细胞：

将实验室保存的E.coli（TOP10）菌株复苏后取70μl接种至3ml LB液体培养基中，37℃ 180rpm振荡培养；培养至OD600约为0.6-0.8时转至冰预冷的1.5ml离心管中，在冰上放置10min；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；弃上清，将管倒置1min，使培养基流尽；离心管中加入100μl冰预冷的0.1MCaCl₂重悬细胞备用；

（4）目的基因转化大肠杆菌TOP-10F’：

取100μl感受态细胞，加10μl连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min；42℃热激90s，冰上放置2min；加500μl LB培养基，37℃ 200rpm振荡培养1h；室温4000rpm离心5min，吸出部分上清，用剩余培养基悬浮细胞；将菌液涂布于含有氨苄青霉素的平板；将平板在37℃正向放置1h吸收多余液体，倒置培养过夜。

（5）单克隆培养和检测：

从长出白色单菌落的平板上面随机挑取5个单菌落分别接种到500μl含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基，37℃培养5-6小时。取1μl培养基作为模板，以SPI-f和SPI-r为引物进行PCR检测，PCR条件同前。将阳性克隆接种到3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜、保种、取菌液送华大基因生物公司进行测序。

（6）质粒提取和酶切反应：

用质粒提取试剂盒，抽提TOP10中含有目的片段的pMDl8-T-serpin质粒，步骤参照说明书。在37℃以BamH

和Bst B

分别对pCR®T7/NT TOPO®TA和pMDl8-T-serpin质粒进行双酶切，酶切过夜。反应体系如下：

（7）连接和转化：将上述两种酶切后的基因片段用T₄DNA连接酶进行连接，16℃恒温水浴过夜，反应体系如下：

连接完成后转化BL21(DE3)plysS感受态细胞（方法同前）；随机挑取5个单克隆接种于500 ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃ 180rpm振荡6-8小时，取菌液进行PCR检测，将检测正确的克隆送公司测序，测序正确后-20℃保种待用。酶切和连接的结果如图2所示。

实施例 2 ：重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析

所需主要试剂：异丙醇、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、甘氨酸、SDS、TEMED、丙稀酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、考马斯亮蓝R-250、溴酚蓝、DTT、甘油、Tris等试剂均购自上海生工生物工程有限公司；蛋白marker购自Fermentas公司；其它试剂均为国产或进口的分析纯级别。

所需主要仪器：蛋白质电泳槽、脱色摇床（北京六一仪器）、低温离心机（Ependdorf）等。

取实施例1中保存的含有表达载体的菌液接种于20ml含有氨苄青霉素（含100μg/mL氨苄青霉素）的新鲜LB液体培养基中，37℃培养至OD600达到0.6-0.8。取1ml未加IPTG诱导的培养液至1.5ml离心管中作为空白组，其余的菌液用终浓度为1mM的IPTG进行诱导，在37℃摇床中180rpm继续培养，在培养1h、2h、3h、4h和5h分别取样（1ml/次），将所有收集到的样品在4℃，10000rpm条件下离心5min，收集沉淀，在每个样品中各加100μl上样缓冲液（1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，1%溴酚蓝，0.154g DTT，10% SDS，10%甘油）处理。当所用时间点的样品都收集后，沸水浴10min使菌体细胞裂解，释放蛋白。利用SDS-PAGE法检测蛋白产物，凝胶配制方法如下：

15% 分离胶（10ml）：

5% 浓缩胶（5ml）：

按照上面的SDS-PAGE凝胶配方，依次灌注分离胶和浓缩胶，注意保证两层胶完全凝固。将上述菌体裂解液低速离心，每一时间点取悬液10μl加样于SDS-PAGE上，其中没有诱导的样品作为0h的对照组。浓缩胶电压80V，分离胶电压120V，电泳完成后用考马斯亮蓝染液染色约2h，用1.8%KCl溶液脱色至凝胶背景清晰透明，观察结果并扫描凝胶，以确定蛋白的最佳诱导时间，以此最佳诱导时间进行目的蛋白的大量表达。

经IPTG诱导后，利用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，结果如图3所示：在预期分子量稍大于45KD附近的位置出现了特异条带，该蛋白的表达量随着诱导时间的延长而显著增加，5h后表达量达到平台期，继续培养，目的蛋白表达量相对稳定。由于重组目的蛋白带有一个组氨酸标签（-MRGSHHHHHHGM-），故分子量略大于其预测理论值，所以推断该谱带处的蛋白可能为重组目的蛋白。

实施例 3 ：重组蛋白的分离纯化及复性

（1）破碎菌体：

将实施例1中保存的菌体发酵至OD600 nm为0.6~0.8，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导培养5 h后，取300ml菌液4 ℃条件下10000 rpm离心10 min收集菌体。按1g湿菌/l0ml破碎缓冲液（1% TritonX-100, 2 mM EDTA）的比例重悬菌体，冰浴条件下超声破碎（工作条件：功率400 W，工作5s，间歇5 s，共15min，反复3次），待破碎完成后4 ℃，10000 r/min离心10min收集包涵体。

（2）包涵体的洗涤：

取超声破碎后收集的菌体沉淀，加入30ml的包涵体洗涤缓冲液（300mM KCL, 50mM KH₂PO₄, 5mM Iminazole, 1M Urea, pH 7.4）洗涤3次，收集沉淀，取50μl上清留做电泳对照样品。上述洗涤获得的包涵体溶于包涵体裂解液（300mM KCL，50mM KH₂PO4，5mM Iminazole，8M Urea，pH 7.4），置于振荡器上振荡20 min，4℃，10000 rpm离心10 min， 取上清。以5h为诱导时间大量发酵菌体，对超声破碎处理及洗涤过程中离心后收集的沉淀和上清进行电泳检测，发现重组蛋白大部分以不溶的包涵体形式存在于破碎后的沉淀中。

（3）目的蛋白的纯化：

采用亲和层析的方法，用Bio-Scale Mini profanity IMAC镍柱将上清溶液应用快速蛋白液相系统（BioLogic DuoFlow, Bio-Rad），通过固定金属亲和层析（IMAC）和Ni-NTA技术进行目的蛋白的分离纯化，具体操作按照Bio-Scale Mini profanity IMAC操作手册进行，所有进入系统的液体都要过0.22μm的微孔滤膜。最后用SDS-PAGE进行检测。包涵体洗涤多次后用高浓度的尿素溶解，利用Ni-IDA技术对目的蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳检测如图4。

（4）目的蛋白的复性：

本研究采用透析复性的方法，通过逐步降低透析液中尿素的浓度，使蛋白在稳定的环境中能够正确折叠，最终恢复蛋白的生物学活性。纯化后的重组蛋白置于处理好的透析袋中，依次放入含有8 mol/L、6mol/L、4 mol/L、3 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0 mol/L尿素的Tris-HCl缓冲液中（50 mmol/L，pH7.4），并在透析液中加入少量的半胱氨酸做还原剂以助于蛋白的折叠，每一浓度梯度均在4℃磁力搅拌器搅拌透析约4h，利用抽真空冻干后对得到的粉末称重，计算重组目的蛋白的得率约为0.3g/L，将复性后的蛋白脱盐后冻干称重，保存于-80 ℃。

实施例 4 ：目的蛋白的质谱鉴定

将SDS-PAGE胶上的目的条带切下，用超纯水反复冲洗3遍后，利用胰蛋白酶进行胶内酶解，取25µl酶解后的样品进行离子阱质谱分析（LCQ DECA XPplusMS, ThermoFirmigan, USA），利用Bioworks软件与SEQUEST数据库进行比对。质谱鉴定结果如图5所示，rFc-serpin中有3条肽段（-LSGNNLR-, -DNETNNNLFMGVYR-和-PFLFLIR-）与我们前期克隆的中国明对虾的serpin serine proteinase inhibitor基因推导的氨基酸序列（GenBank: ABC33916）完全匹配。由此可以判定，上述蛋白条带即为重组表达的目的蛋白rFc-serpin，中国明对虾Fc-serpin成熟肽成功地获得了体外重组表达。

实施例 5 ：对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂在预防治疗对虾常见致病菌的高度感染性方面的应用。

实验中所用到的病原菌主要为：大肠杆菌（菌种保藏号：TJF-101）和鳗弧菌（菌种保藏号：TJF-17）为农业部水生动物病原库赠送，哈维氏弧菌（菌种保藏号：MCCO000015）为中国海洋大学海洋微生物菌种保藏中心赠送，金黄色葡萄球菌（菌种保藏号：10384）、枯草芽孢杆菌（菌种保藏号：21155）、苏云金芽孢杆菌（菌种保藏号：10322）和酿酒酵母菌（菌种保藏号：1012）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，白色念珠菌（菌种保藏号：CAU0037）购自北京北纳创联生物技术研究院；实验所用培养基为：马铃薯葡萄糖培养基（将20g去皮马铃薯切碎，煮烂后取汁，加入2g葡萄糖，加水定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌即可）、LB液体培养基（购自上海生工）、营养肉汤培养基和营养琼脂培养基（购自北京双旋微生物培养基制品厂），所用其它试剂均为国产或进口分析纯级别。所用主要设备耗材为：酶标仪（Bio-Rad iMark）、恒温振荡培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、酶标板（Coster公司）、核酸蛋白检测仪（Bio-Rad）等。

采用液体生长方法（比浊法）检测重组目的蛋白（rFc-serpin）的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC），实验所需菌株鳗弧菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均用营养肉汤培养基培养（培养方法参见菌种保藏说明），大肠杆菌用LB液体培养基培养（培养方法参见菌种保藏说明），酵母菌用马铃薯葡萄糖培养基培养。实验步骤如下：

（1）所用受试菌株在液体培养基中培养过夜，用培养基稀释其浓度至OD600为0.001左右；

（2）在96孔板的每孔中加入50 μL梯度稀释的本发明的重组对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂（参见实施例3）（终浓度分别为：80uM、40 uM、20 uM、10 uM、5 uM、2.5 uM和0uM），对照组为50 μL菌液与50 μL Tris-HCl缓冲液的混合溶液；

（3）然后依次加入50 μL的受试菌悬液；

（4）37℃条件下培养18-24 h；

（5）利用酶标仪通过测定OD595来确定MIC。

本实施例利用液体生长方法检测了rFc-serpin对不同病原菌的最小抑菌浓度（MIC），研究结果发现其对多种革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌的生长均有抑制作用，特别是对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和真菌的生长有明显抑制效果，最小抑菌浓度在5μM以下（表1）。根据该重组目的蛋白对病原菌的抑菌活性分析结果，有望将其开发为预防治疗病原的抗菌类药物，作为抗生素替代药物可应用于经济水产动物的健康养殖和资源环境保护领域。

表1 重组目的蛋白对主要病原菌的抑菌活性及最小抑菌浓度（MIC）

菌株	受试范围内最小抑菌浓度
		革兰氏阳性菌（ G+ ）：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurigiensis)	80μM
		金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)	20μM
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)	2.5μM
革兰氏阴性菌（ G- ）：
		鳗弧菌(Vibrio anguillarum)	80μM
哈维氏弧菌(Vibrio. harveyi)	40μM
		大肠杆菌top10F’(Escherichia coli)	5μM
		真菌：
酵母菌(Saccharomycetes.cerevisiae)	5μM
		白色念珠菌(Candida albicans)	5μM

结论：

（1）本发明获得的重组对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂对多种革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌的生长均有一定抑制作用；

（2）本发明获得的重组对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和真菌的生长有更显著的抑制效果。

（3）有望将本发明所获得的重组对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂开发为预防治疗病原的抗菌类药物，作为抗生素替代药物可应用于经济水产动物的健康养殖。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因工程制备与鉴定方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgcggtctg tttaggtg 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacttctggc ggtgtcg 17

Claims (5)

1.一种重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂，其特征在于该重组蛋白酶抑制剂的蛋白分子量约为45kD，纯化复性后得率为0.3g/L培养基。

2.权利要求1所述重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂的原核重组表达方法，其特征在于它是将对虾Fc-serpin基因与表达载体连接，完成目的表达载体（pCR^®T7/NT TOPO^®TA-Fc-Serpin）的构建，并转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，进行目的蛋白的诱导表达和纯化复性。

3.权利要求2所述的重组对虾Fc-serpin型蛋白酶抑制剂的原核重组表达方法特征在于：

(1) Fc-serpin原核表达载体的构建：

将已知的目的基因Fc-serpin（GenBank注册号：DQ318857）成熟肽区域与表达载体质粒pCR®T7/NT TOPO®TA进行连接，构建重组表达质粒pCR^®T7/NT TOPO^®TA-Fc-Serpin，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞后测序；

(2) 重组蛋白的诱导表达和表达产物的初步分析：

利用诱导剂IPTG对含有重组表达质粒的菌体进行不同时间的诱导表达，收集样品进行电泳检测，以确定蛋白的最佳诱导时间；

(3) 重组蛋白的分离纯化及复性：

利用固定金属亲和层析（IMAC）和Ni-NTA技术对目的蛋白进行分离纯化，利用梯度尿素透析法进行蛋白的复性处理；

(4)目的蛋白的质谱鉴定：

将目的蛋白进行切胶、酶解和离子阱质谱分析鉴定。

4.一种用于对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因原核重组表达的特异性引物SPI-f5’-ACGCGGTCTGTTTAGGTG-3’和SPI-r5’-AACTTCTGGCGGTGTCG-3’。

5.对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂在预防治疗对虾常见致病菌的高度感染性方面的应用。

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