CN102191194A

CN102191194A - 一种枯草芽孢杆菌及其抗菌蛋白

Info

Publication number: CN102191194A
Application number: CN 201110064625
Authority: CN
Inventors: 张晓喻; 黄春萍; 刘刚; 张宏
Original assignee: Sichuan Normal University
Current assignee: Sichuan Normal University
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2031-03-17
Also published as: CN102191194B

Abstract

一种枯草芽孢杆菌及其抗菌蛋白，本发明涉及生物农药领域，特别涉及一种抗植物病原真菌的枯草芽孢杆菌及其抗菌蛋白。本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M 2011017的菌株。还提供了该枯草芽孢杆菌产生的抗植物病原真菌的蛋白质。本发明提供的枯草芽孢杆菌的抑菌效果显著，其产生的抗菌蛋白性质非常稳定，具有很宽的温度适应范围、耐酸碱、紫外稳定性，以及对有机溶剂和蛋白酶耐受等优点，能够适应多种自然条件，可用于制备防治植物病原真菌的农药，具有极好的应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其抗菌蛋白

技术领域

本发明涉及生物农药领域，特别涉及一种抗植物病原真菌的枯草芽孢杆菌及其抗菌蛋白。

背景技术

植物病害一直是农作物优质高产的重要制约因素之一，据估计，全球主要农作物的平均损失约占总产量的10～15％，每年直接经济损失高达数千亿美元。在植物病害中，70～80％的病害是病原真菌侵染导致的。植物病原菌不仅直接造成农作物产量下降，部分病原真菌在侵染农作物过程中，还会分泌产生多种对人畜有害的毒素与代谢产物，对农作物的安全性构成极大威胁。

农作物真菌病害的控制往往依赖化学防治。然而，化学有机农药的使用不仅生产成本高，而且会带来环境污染、农产品农药残留以及各种疾病等问题。

微生物农药是指微生物及其代谢产物加工而成的具有杀虫、杀菌、除草、杀鼠或调解植物生长活性的物质，其具有不危害人畜、无土壤残留、不污染环境等优点，可代替化学农药用于防治植物病害。

此前，已有使用微生物拮抗植物病原真菌的报道：李炳学等，“以综合能力为标准筛选草莓灰霉病生防细菌”，微生物学杂志，2005年，第25卷第4期公开了平板对峙法检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1、B17、B18对草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的抑菌实验，在牛肉膏蛋白胨与PDA混合培养基上，将枯草芽孢杆菌菌苔接种于距离培养皿边1cm的正三角形的3个角上，取灰霉病的孢子点在中心，置21～23℃下培养观察，7天后测量三种菌的平板对峙抑菌距离分别为6.6、7.0和6.7mm，结果显示枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1、B17、B18的抑菌效果不显著；赵妍等，“枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B10对采后草莓果实病害的抑制效果”，果树学报，2007年，第24卷第3期等公开了平板打孔法检测枯草芽孢杆菌B10及其发酵液对灰葡萄孢的抑制实验，取1×10⁴个/mL的灰霉孢子悬浮液0.1mL，涂布于PDA平板上，在平板的中心打直径为8mm的孔，分别注入0.1mL枯草芽孢杆菌B10的活菌液、菌悬液、热处理液和过滤液，分别在15℃或25℃下培养7d后测定抑菌圈直径，实验结果显示枯草芽孢杆菌B10的活菌液在25℃下的抑菌活性最高，其抑菌圈为18.8mm，然而，本领域技术人员公知地，平板打孔法检测到的拮抗菌的抑菌圈直径显著大于平板对峙法检测到的拮抗菌的抑菌圈直径，枯草芽孢杆菌B10的抑菌效果也不显著。

综上，现有的抗菌微生物的抑菌效果均不显著，因此，寻找抑菌效果更好的微生物从而得到新的微生物农药是一个亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的拮抗植物病原真菌的微生物。

本发明提供了一种新的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis)，命名为Loq18，并将其保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2011017。

本发明还提供了一种抗植物病原真菌的蛋白质，命名为LP18，它是由上述枯草芽孢杆菌菌株产生的。

前述蛋白质：是多亚基蛋白，且亚基分子量为4283.7Da；由如下14种氨基酸组成：Leu、Glu、Asp、Thr、Ser、Gly、Cys、Val、Met、Ile、Tyr、Phe、His、Pro；不含脂质和糖基。

前述蛋白质：在温度≤140℃和1≤pH≤13的条件下具有抗菌活性；经过碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶处理，和/或紫外照射，和/或有机溶剂处理后仍具有抗菌活性。该蛋白质在pH＝6.8时抗菌活性最高，且在5≤pH≤6.8的抗菌活性为蛋白质在pH＝6.8的抗菌活性的98.89～100％。

前述蛋白质是由如下方法制备得到：

a，取保藏号为CCTCC NO：M 2011017的枯草芽孢杆菌菌株发酵，制备得到发酵液；

b，将步骤a得到的发酵液离心分离纯化，即得到目的蛋白。

前述植物病原真菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。

本发明还提供了一种制备上述蛋白质的方法，其包含如下步骤：

b，将步骤a得到的发酵液分离纯化，即得到目的蛋白。

本发明又提供了上述枯草芽孢杆菌菌株或者上述蛋白质在制备防治植物病原真菌的农药中的用途。

本发明又提供了一种防治植物病原真菌的农药，该农药的主要成分为上述枯草芽孢杆菌菌株或者上述蛋白质。

本发明提供的枯草芽孢杆菌Loq18的抑菌效果显著，其产生的抗菌蛋白的性质稳定，具有热稳定性、pH稳定性、紫外稳定性等优点，可用于制备防治植物病原真菌的农药。

附图说明

图1 枯草芽孢杆菌Loq18培养时间和抗菌活性的关系图，横坐标为发酵时间，单位为小时，纵坐标为抑菌圈直径，单位为毫米

图2 枯草芽孢杆菌Loq18发酵产物毒力方程图

图3 硫酸铵沉淀的枯草芽孢杆菌Loq 18发酵粗提物上Sephadex G-75层析柱的活性峰

图4 DEAE Fast Flow离子交换层析图谱

图5 Sephadex G-25脱盐层析图谱

图6 抗菌蛋白LP18的MALDI-TOF-TOF-MS分析图谱

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

一、实验材料和仪器

实验菌株：灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，可致草莓灰霉病，购买于中国农业微生物保藏中心，保藏编号为ACCC36415；小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、禾谷类镰刀菌(Fusarium graminearum)、玉米弯孢菌(Curvularia lunata)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)由本实验室保存。

培养基：NA培养基；PDA培养基。

仪器：THZ-98A恒温振荡培养箱，上海恒科仪器有限公司；高速冷冻离心机，Beckman公司；Wizard2.0冷冻干燥机，天美科学仪器有限公司；LRH-250S恒温恒湿培养箱，广东省医疗设备厂。

实施例一枯草芽孢杆菌的分离鉴定

1、菌株分离

从四川省成都市龙泉驿区的农田土壤中采集样品，制备牛肉膏蛋白胨培养基(NA)，稀释涂布法与挑单菌落平板划线法进行菌株的纯化培养并保存。制备马铃薯培养基(PDA)，采用对峙法进行拮抗菌的筛选，即平板中央接种直径为6mm指示菌菌丝块，等距离点接种分离得到的菌株于指示菌菌落前3cm处，28℃恒温培养3天，测量并计算抑菌圈的直径。获得一株对灰葡萄孢、水稻稻瘟病菌、玉米弯孢菌、小麦赤霉病菌和禾谷类镰刀菌、立枯丝核菌均有较强抑菌活性的菌株，命名为Loq18，其抗菌活性如表1所示：

表1 菌株Loq18对供试植物病原菌的抑制作用

病原菌	抑菌圈直径(mm)
		灰葡萄孢(Botrytis cinerea)	21.54
水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)	19.56
		玉米弯孢菌(Curvularia lunata)	20.74
小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)	21.13
		禾谷类镰刀菌(Fusarium graminearum)	20.35
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)	3.42

2、鉴定和保藏

经鉴定，Loq18菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并于2011年1月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2011017，其具体的鉴定特征如下：

(1)形态特征

菌株在NA培养基上呈乳白色半透明菌落，表面光滑，粘稠，凸起，边缘不整齐，不产色素。菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，可形成内生孢子，芽孢囊不膨大，芽孢椭圆形，中生到次端生。

(2)生理生化特性

其生理生化特性见表2：

表2 菌株Loq18的生理生化特征

(3)16S rDNA的序列分析

将Loq18菌株进行16S rDNA测序，序列长度为923bp，具体序列如下：

GGCCGTGGGGGCCTGGCTTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGA

GCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAA

CCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG

ATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTAC

CACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGG

CTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC

ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG

GAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGT

GATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGT

GCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCAC

GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT

GTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTG

ATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGG

AACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAA

ATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGT

CTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGGAGCGAACAGGATT

AGATACTCTGGTAGTCCACGCCCGTAAAACGATGAGTGCTAAAGTGTTA

GGGGGTTTCCGCCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC

CCTGGGGAGTACGGCCGCAAAGACTGAAACTCAAAGGAATTTGACGG

GGGGCCCGCACA

在NCBI网站上使用BLAST工具在基因库中对该序列进行同源性比对，结果显示Loq18的16S rDNA与多株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)的16S rDNA序列相似性达99％以上，结合形态学和生理生化特征，鉴定菌株Loq18为一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实验证明，本发明分离得到了一株枯草芽孢杆菌Loq18，且该枯草芽孢杆菌对保藏编号为ACCC36415的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)以及其他病原真菌的具有较强的抑制作用，且抑菌强度明显优于现有技术报道的枯草芽孢杆菌。

实施例二枯草芽孢杆菌Loq18的抑菌实验

1、活菌抑菌实验

取直径6mm保藏号为ACCC36415的灰葡萄孢菌丝块于装有20mL土豆液体培养基的50mL锥形瓶中，同时接入两环Loq18菌株，28℃恒温振荡培养72小时。

经检测，灰葡萄孢菌丝块不生长，且其孢子不萌发，活菌抑制率为100％。

2、枯草芽孢杆菌Loq18培养时间和抗菌活性的关系

用接种环挑取一个Loq18单菌落斑接种到15mL试管中，装液量为30％，置37℃，180r/min振荡培养18h。按5％接种量接种于250mL发酵瓶中，空白对照接种等体积无菌水，37℃，180r/min条件下振荡培养。每隔8h取4mL培养液，8000r/min，4℃，离心10min，取上清液过0.22μm细菌滤膜。

采用徐积恩等主编，科学出版社，1982出版的《抗生素》第152页记载的管碟法测定活性，即在平板中央接种直径为6mm灰葡萄孢菌丝块，距离中心15mm位置放置内径6mm的牛津杯，牛津杯内加无菌发酵液150μL，每板设等距离的三个平行。28℃恒温培养箱中连续培养3～10天，游标卡尺测定抑菌圈直径。以培养时间为横坐标，除菌发酵液的抑菌圈直径为纵坐标作图，分析Loq18的培养时间与抗菌物质抑菌活性的关系，结果如图1所示，在Loq18培养时间为60～80h时，其抑菌活性较高。

3、枯草芽孢杆菌Loq18发酵产物毒力方程测定

接种10％Loq18菌株种子液于大量NA液体培养基中，37℃，180r/min，振荡培养72h。发酵液经4℃6000r/min离心30min，上清液即除菌发酵液，冷冻干燥，备用。

用发酵液冻干粉分别配置20、15、10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL NA固体培养基，每个浓度三个重复，以不加发酵液冻干粉的三个平板为空白对照。在平板中央接种直径为6mm的保藏编号为ACCC36415的灰葡萄孢菌丝块，22℃恒温培养72小时，用游标卡尺，十字交叉法测量菌丝块直径，计算抑菌率。

D₀＝D1-D2

D₀为菌落增长直径，D1为菌落直径，D2为菌饼直径

I = \frac{D_{0} - D_{t}}{D_{0}} \times 100

I为菌丝生长抑制率，D₀为空白对照菌落增长直径，D_t为药剂处理菌落增长直径

测定结果如图2所示，枯草芽孢杆菌Loq18发酵产物毒力方程为：y＝0.444x+0.903，R²＝0.9748，由此得出枯草芽孢杆菌Loq18发酵产物最小抑菌浓度为20mg/mL。

实验证明枯草芽孢杆菌Loq18的抑菌效果显著。

实施例三抗菌蛋白的制备及其性质

1、枯草芽孢杆菌Loq18抗菌粗提物的制备

将枯草芽孢杆菌Loq18在NA培养基上划线培养18小时，取单菌落到NA液体培养基37℃、200r/min下振荡培养24h，然后以10％接种量，接种到1000mL三角烧瓶中30℃，160r/min发酵72h获得发酵液。

将发酵液于4℃，6000r/min离心30min除菌体，收集上清液。采用盐析法，向发酵液中加入30％的固体硫酸铵，4℃静置过夜。4℃，12000r/min离心10min，分别收集上清和沉淀，以保藏编号为ACCC36415的灰葡萄孢为指示菌分别检测上清和沉淀的抑菌活性，结果显示沉淀部分具有抑菌活性，该硫酸铵处理发酵液得到的沉淀物即为抗菌粗提物。

同时，检测该沉淀在280nm下的紫外吸收情况以及茚三酮显色情况，结果显示该沉淀在280nm下有紫外吸收，且茚三酮实验呈阳性，证明具有抑菌活性的沉淀物为蛋白质。

2、抗菌蛋白的分离纯化

(1)Sephadex G-75柱层析

将Sephadex G-75超纯水溶胀72小时装柱(2cm×80cm)，将抗菌粗提物溶液上样，超纯水洗脱，流速为6.5mL/(cm²·min)，280nm下检测，每5mL收集一管。根据洗脱曲线，分别取各收集峰液体，以保藏编号为ACCC36415的灰葡萄孢为指示菌，管碟法检测抑菌活性，分别收集活性峰的洗脱液，冷冻干燥备用。

抗菌粗提物上Sephadex G-75层析柱的紫外检测结果如图3所示，峰Ⅰ和Ⅱ分离度极低，合并收集，峰Ⅲ单独收集，测定各部分抑菌活性。峰Ⅰ和Ⅱ具抑菌活性，峰Ⅲ没有活性。

(2)DEAE Fast Flow离子交换层析

称量步骤(1)收集的活性峰冻干粉100mg，溶于1mL pH为8.2的Tris-HCl buffer，100℃沸水浴下保持20min，1200r/min离心10min，取上清液。上HiTrap DEAE FF 1mL预装柱，buffer prep tris 8.2，0～1.0mol/L NaCl，30CV，150cm/h，280nm下检测，每1mL收集一管。根据洗脱曲线，分别取各收集峰液体，以保藏编号为ACCC36415的灰葡萄孢为指示菌，管碟法检测抑菌活性，将活性峰收集液冷冻干燥备用。

DEAE FF离子交换层析图谱如图4所示，用0～1.0mol/L的NaCl洗脱至c(NaCl)＝0.5mol/L时获得的洗脱峰Ⅱ，经检测具有抗菌活性。

(3)Sepahdex G-25柱层析除盐

将步骤(2)收集的活性峰冻干粉溶解，过Sephadex G-25 1mL预装柱除盐，根据洗脱曲线收集洗脱液，以保藏编号为ACCC36415的灰葡萄孢为指示菌，管碟法检测抑菌活性，将活性峰收集液冷冻干燥备用。

经Sephadex G-25脱盐，层析图谱如图5所示，得到2个洗脱峰，其中第1个洗脱峰具有抗菌活性，即得到本发明抗菌蛋白LP18。

3、抗菌蛋白LP18的理化性质

(1)抗菌蛋白LP18分子量

抗菌蛋白LP18的MALDI-TOF-TOF-MS分析图谱如图6所示，结果显示该抗菌蛋白是多亚基蛋白，亚基分子量为4283.7Da。

(2)抗菌蛋白LP18氨基酸组成分析

抗菌蛋白LP18含如下14种氨基酸：Leu、Glu、Asp、Thr、Ser、Gly、Cys、Val、Met、Ile、Tyr、Phe、His、Pro。

(3)抗菌蛋白LP18双缩脲反应和茚三酮反应

双缩脲反应和茚三酮反应均呈阳性，抗菌蛋白LP18中含肽键及α-氨基酸。

(4)抗菌蛋白LP18脂质和糖基检测

脂质和糖基检测均呈阴性，表明抗菌蛋白LP18中不含脂质和糖基。

(5)稳定性及敏感性检测

a、热稳定性：将抗菌蛋白LP18分别在40℃、60℃、80℃、100℃水浴中处理30min，121℃高温高压灭菌20min、硅油加热至140℃或者160℃保持20min。20mmol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH6.8)缓冲液悬浮至浓度20mg/mL，保藏编号为ACCC36415灰葡萄孢为指示菌，管碟法测定活性，每孔加液50μL。

与未经加热处理的抗菌蛋白LP18相比，抗菌蛋白LP18经40℃、60℃、80℃、100℃水浴处理及121℃高温高压灭菌处理后，其活性为前者的98％以上，几乎没有变化。硅油加热至140℃，活性才基本丧失。也就是说，抗菌蛋白LP18对热不敏感，具有很好的热稳定性。

b、对pH稳定性：

将抗菌粗蛋白溶液用乳酸和5mol/L氢氧化钠分别调至pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0，置4℃过夜，用乳酸和氢氧化钠将各pH值调回中性后以保藏编号为ACCC36415灰葡萄孢为指示菌，管碟法检测活性。

结果如表3所示，pH值在4～11之间，其活性基本保持稳定，pH为5～6时，其抑菌活性最高，pH为9～10时其抑菌活性较高。抗菌蛋白LP18的最适pH范围为5～6。抗菌蛋白LP18对酸碱的耐受范围较宽。

表3 pH对抗菌蛋白抑菌活性的影响

pH	抑菌圈直径(mm)	抑菌率％
			CK(pH＝6.8)	21.64	100.00％
pH＝1	0.70	3.23％
			pH＝2	5.16	23.84％
pH＝3	7.36	34.00％
			pH＝4	16.73	77.31％
pH＝5	21.60	99.82％
			pH＝6	21.40	98.89％
pH＝7	19.31	89.23％
			pH＝8	18.36	84.84％

pH＝9	20.20	93.34％
			pH＝10	20.04	92.61％
pH＝11	16.69	77.13％
			pH＝12	4.72	21.81％
pH＝13	4.6	21.25％
			pH＝14	0	0.00％

c、对有机溶剂的敏感性：

以1∶8的固液比，在抗菌粗蛋白中加入乙醚、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、丙酮和甲醇，浸泡30min后，热水浴(约50℃)去除有机溶剂。20mmol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH6.8)缓冲液悬浮至浓度20mg/mL，以保藏编号为ACCC36415灰葡萄孢为指示菌，管碟法检测活性。

以未经处理的抗菌蛋白LP18作为对照，经乙醚、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、丙酮和甲醇处理后的抗菌蛋白LP18的拮抗活性略有下降，抑菌率分别为对照组的93.22％、96.51％、97.45％、90.25％、94.41％和95.10％，表明抗菌蛋白LP18对有机溶剂不敏感。

d、对紫外线的稳定性：

将抗菌粗蛋白放置在20W紫外灯下距离10cm分别照射0、2、4、6、8、10、12h后，以保藏编号为ACCC36415灰葡萄孢为指示菌，管碟法检测活性。

随着紫外光照射时间的增长，抗菌蛋白LP18的抑菌活性无明显降低，紫外光照射12h后抑菌活性为未被紫外照射抗菌蛋白LP18抑菌活性的96.45％。表明抗菌蛋白耐紫外光。

e、对蛋白酶的稳定性：

将抗菌粗蛋白分别用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶在各自最适酶促条件下处理后，以保藏编号为ACCC36415灰葡萄孢为指示菌，管碟法检测活性。

以未经处理的抗菌蛋白LP18作为对照，抗菌蛋白LP18经碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶处理后抗菌活性分别为对照的93.53％、87.29％、61.51％、28.16％。表明抗菌蛋白LP18对碱性蛋白酶、胰蛋白酶具有很好的耐受性，对胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶部分敏感。

实验证明本发明纯化得到了抗菌蛋白，该抗菌蛋白的热稳定性、pH稳定性、有紫外稳定性、蛋白酶稳定性均很好，且对有机溶剂不敏感。

综上，本发明提供的枯草芽孢杆菌Loq18的抑菌效果显著，其产生的抗菌蛋白的性质非常稳定，具有很宽的温度适应范围、耐酸碱、紫外稳定性，以及对有机溶剂和蛋白酶耐受等优点，能够适应多种自然条件，可用于制备防治植物病原真菌的农药，具有极好的应用前景。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号为CCTCC NO：M 2011017的菌株。

2.一种抗植物病原真菌的蛋白质，其特征在于：它是由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株产生的。

3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质：

是多亚基蛋白，且亚基分子量为4283.7Da；

由如下14种氨基酸组成：Leu、Glu、Asp、Thr、Ser、Gly、Cys、Val、Met、Ile、Tyr、Phe、His、Pro；

不含脂质和糖基。

4.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质：

在温度≤140℃和1≤pH≤13的条件下具有抗菌活性；

经过碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶处理，和/或紫外照射，和/或有机溶剂处理后仍具有抗菌活性。

5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质在pH＝6.8时抗菌活性最高，且在5≤pH≤6.8的抗菌活性为蛋白质在pH＝6.8的抗菌活性的98.89～100％。

6.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：其由如下方法制备得到：

b，将步骤a得到的发酵液分离纯化，即得到目的蛋白。

7.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述的植物病原真菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。

8.一种制备权利要求2～7任意一项所述的蛋白质的方法，其特征在于：包含如下步骤：

b，将步骤a得到的发酵液分离纯化，即得到目的蛋白。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株或者权利要求2～7任意一项所述的蛋白质在制备防治植物病原真菌的农药中的用途。

10.一种防治植物病原真菌的农药，其特征在于：所述农药的主要成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株或者权利要求2～7所述的蛋白质。