CN103014013A - 三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用。三疣梭子蟹PtPLC基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。重组的PtPLC蛋白对牛胰蛋白酶和牛α-胰凝乳蛋白酶具有显著的抑制活性。当重组蛋白PtPLC浓度为1μM、2μM、3μM时，对牛胰蛋白酶的抑制活性分别为88.73％、90.73％和97.18％；当重组蛋白浓度为2μM、3μM时，对牛α-胰凝乳蛋白酶的抑制活性达到31.1％和99.69％。本发明在药物开发和饲料添加剂生产等方面具有潜在的应用价值，为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育奠定基础。

Description

三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用。 

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制剂是对丝氨酸蛋白酶有抑制活性的一类蛋白质，其通过与靶酶相互结合形成稳定的复合体，来防止机体内丝氨酸蛋白酶的有害水解激活，是生物体内免疫系统的重要组成部分。根据序列特征、拓扑结构和功能的相似性，丝氨酸蛋白酶抑制剂可以被分为74个家族，但在虾蟹等甲壳动物中其结构和功能的报道较少。 

Pacifastin是一类新的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，最初是1987年在淡水螯虾Pacifastus leniusculus的血淋巴中被发现。研究表明该基因只存在于节肢动物中，目前已经在多种昆虫中发现Pacifastin相关基因，但在甲壳动物中只在淡水螯虾和中华绒螯蟹中发现。淡水螯虾的Pacifastin由两条肽链构成，重链和轻链，其中轻链含有一个典型的半胱氨酸排列模式Cys-Xaa_9-12-Cys-Asn-Xaa-Cys-Xaa-Cys-Xaa_2-3-Gly-Xaa_3-4-Cys-Thr-Xaa₃-Cys（Pacifastin light chain domain,PLD）。PLD结构域对Pacifastin的结构和功能至关重要。 

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国重要的海水养殖品种，但随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高，由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重，给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。因此，开展三疣梭子蟹免疫防疫基础研究，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，通过提高蟹自身免疫抵抗力来防止和减少蟹病的发生，是实现其健康养殖的可靠保障。 

到目前为止，未有关于三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂的报道。因此，研究免疫因子—Pacifastin对理解三疣梭子蟹的免疫防御机制和进行病害防治无疑具有十分重要的理论与实践意义，同时将有助于开发天然药物用于人类疾病的治疗。 

发明内容

本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因及其编码蛋白和应用。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因，三疣梭子蟹PtPLC基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。 

三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因编码蛋白，所述三疣梭子蟹PtPLC基因编码蛋白为序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。 

三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因的应用，所述三疣梭子蟹PtPLC基因编码蛋白的重组表达产物用于制备蛋白酶的抑制剂药物、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。 

所述蛋白酶的抑制剂为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的抑制剂。 

本发明所具有的优点： 

本发明利用表达序列标签技术（EST）、RACE技术从三疣梭子蟹中克隆到Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因cDNA全长序列，通过PCR技术扩增编码PtPLC成熟肽的基因片段并将其克隆到pEASY^TM-E1表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)实现体外重组表达。重组蛋白经TALON柱纯化和透析后，对牛胰蛋白酶和牛α-胰凝乳蛋白酶具有显著的抑制活性。当重组蛋白PtPLC浓度为1μM、2μM、3μM时，对牛胰蛋白酶的抑制活性分别为88.73％、90.73％和97.18％；当重组蛋白浓度为2μM、3μM时，对牛α-胰凝乳蛋白酶的抑制活性达到31.1％和99.69％。 

本发明基因及其重组蛋白可作为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类抑制剂药物的生产，应用于人类相关疾病的治疗，或用于饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂的生产等，另外还可以为进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育提供参考。 

附图说明

图1为本发明实例提供的诱导和纯化的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白电泳图（其中1：蛋白marker，2：未诱导菌体中表达的蛋白，3：IPTG诱导后表达的蛋白；4：纯化的重组蛋白）。 

图2为本发明实例提供的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白对牛胰蛋白酶和牛α-胰凝乳蛋白酶的抑制作用图（AEBSF为阳性对照）。 

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。 

本发明中的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC的cDNA序列克隆包括下列步骤： 

a)三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化； 

b)三疣梭子蟹cDNA文库构建； 

c)三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定； 

d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtPLC基因片段的筛选； 

e)RACE扩增获得PtPLC的全序列以及全序列的验证。 

实施例1. 

三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因为SEQ ID No.1中所示的碱基序列。 

序列表SEQ ID No.1为： 

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aaaaaaaaaa aaaa 

（a）序列特征 

●长度：1655bp（有效长度34-1131） 

●类型：碱基序列 

●链型：单链 

●拓扑结构：线性 

（b）分子类型：双链DNA 

（c）假设：否 

（d）反义：否 

（e）最初来源：三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus） 

（f）特异性名称：CDS 

构建具体操作如下： 

1.三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化：利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取三疣梭子蟹总RNA，利用QIAGENE公司的Oligitex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。 

2.三疣梭子蟹cDNA文库构建：利用Clontech公司的Creator SmartcDNA Library Construction Kit试剂盒使用说明构建cDNA文库。以纯化后的mRNA为模板，SMART IV寡聚核苷酸引物（Oligonucleotide）（5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG 3'）和CDS III/3'PCR引物（5'ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N_1N 3'）为引物，在反转录酶（MMLV reverse transcriptase）作用下转录合成cDNA第一链。用5'PCR引物（5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3'）和CDSIII/3'PCR引物（5'ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N_1N 3'）为引物经longdistance（LD-PCR）合成cDNA第二链。双链cDNA（ds cDNA）在45℃条件下经蛋白酶K（0.8mg/ml）消化20min，然后用SfiI酶进行酶切，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose GelExtraction Kit回收1-3kb的片段。将回收的片段与载体pDNR-LIB连接后纯化，通过电转化导入大肠杆菌感受态细胞，37℃条件下220rpm/min培养1h，加入终体积20％的甘油，即为全长cDNA原始文库。 

3.三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定：文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物M13F（5'TGTAAAACGACGGCCAGT 3'）在ABI3730xl测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件（*.ab1，*.abd文件）数据经Phred程序处理转化为序列文件（*.seq）和质量文件（*.seq.qual），依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-match程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13（准确率大于95％）且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体《基因表达序列（EST）数据分析手册》（胡松年著，浙江大学出版社，2005年）。 

4.三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtPLC基因片段的筛选：将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获得的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，结果显示在EST序列中发现了与中华绒螯蟹Eriocheir sinensis Pacifastin基因相似性较高（58％）的序列，根据相似性分析结果确定了三疣梭子蟹PtPLC基因的EST序列。 

5.三疣梭子蟹PtPLC基因cDNA全长序列的克隆：根据与PtPLC基因同源的EST序列设计特异引物F1（5'CCCAATCAGGAGCCAAGAACAC'）和R1（5'GATGATCCGTGACACTCCAA 3'），分别利用载体通用引物M13F（5'TGTAAAACGACGGCCAGT 3'）和M13R（5'CAGGAAACAGCTATGACC 3'）进行3'和5'末端的扩增。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用Axygen胶回收试剂盒进行PCR产物回收和纯化，再与pMD-18T载体（大连宝生物工程有限公司）连接，然后转化大肠杆菌感受态Trans1-T1（北京全式金生物技术有限公司），挑选阳性克隆用载体引物M13-47和RV-M进行测序，所得结果经Phred/Phrap软件进行拼接，得到三疣梭子蟹PtPLC基因全长cDNA序列见SEQ ID No.1。 

6.三疣梭子蟹PtPLC基因cDNA全长的验证：在测序拼接的PtPLC全长序列上设计一对引物F2（5'ATGAAGGCTCAAGTGGTGCTGCT 3'）和R2（5'ATAGCCTTACCGTCTCACCAGT 3'），以cDNA为模板进行全长的验证。测序及分析同5。 

3'RACE扩增反应体系及反应条件： 

25μl反应体系： 

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600（Takara BioInc.）中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，50℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。 

5'RACE扩增反应体系及反应条件： 

25μl反应体系： 

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600（Takara BioInc.）中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，52℃退火50s， 72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min。 

全长验证的PCR反应体系和反应条件为： 

25μl反应体系： 

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600（Takara BioInc.）中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，52℃退火50s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min。 

序列表SEQ ID No.1从三疣梭子蟹中克隆到PtPLC基因cDNA全长1655bp，其中开放阅读框1098bp，5'非翻译区33bp，3'非翻译区524bp，有多聚腺苷酸尾巴。 

实施例2. 

三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC序列表SEQ IDNo.1所述碱基序列，所述的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所述。 

序列表SEQ ID No.2为： 

MKAQVVLLLLGAAVTAATSPPFVELPSDPDAPECEGRPLVDRWRKDCNWCSCNEGRVRCSRQLCPEGQQDP 

EPQCEGSPTWKDDCNTCRCAGGRAVCTAKHCDQLGPEQQIVEVQVESAECKEGSRWRVECNWCTCRGGKGA 

CTEMACLNWDEDQAREDGILECHGSSRWKKDCNWCRCAEGRGFCTKKACPQTGPFDNLPEDMCVPGSRWL 

VDCNWCGCSDDGRSSFCTLMACIPGYVHEGPTCEDGSVWKTDDCNICRCIDGMSACTKRLCATPNQEPRTP 

QVPNEPECQGELGIDRWRQDCNWCNCRNGAGACTKRQCLEGVKDDQPECEGNPSWMKDCNRCHCVDGRVC 

TTKFCGEFRK 

其具有完整的编码蛋白含有365个氨基酸，其中编码序列的1-17个氨基酸为信号肽，成熟肽包含348个氨基酸，预测的分子量为38.86kDa，等电点为4.99。成熟肽具有8个典型的PLD结构域，共有结构为Cys-Xaa_9-12-Cys-Asn-Xaa-Cys-Xaa-Cys-Xaa_2-3-Gly-Xaa_3-4    -Cys-Thr-Xaa₃-Cys，每个结构域能形成3个二硫键，3个β折叠片。 

三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白的获得，具体操作如下： 

根据SEQ ID No.2对应的cDNA序列，设计特异性引物F3（5'ACCAGTCCGCCTTTTGTG 3'）和R 3（5'TCATTTCCTAAACTCACCACAGAACT 3'），通过PCR技术扩增编码PtPLC成熟肽的基因片段，反应在TaKaRa PCRThermal Cycler Dice Model TP600（Takara Bio Inc.）中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。然后通过酶切将其克隆到 pEASY^TM-E1(Transgen)表达载体中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到LB培养基中，37℃振荡培养至O.D.₆₀₀＝0.4-0.6，加入IPTG至终浓度为1mM诱导4小时后离心收集菌体。菌体在冰浴条件下用超声波180W处理30-60min（每次2s，间隔2s），离心去掉上清，收集沉淀（含重组蛋白包涵体）。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON柱纯化重组产物。将纯化的重组蛋白转移到透析袋中，4℃条件下，在含有2mM还原谷胱苷肽、0.2mM氧化谷胱苷肽、1mM EDTA、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、10％甘油和1％甘氨酸的及梯度降低的尿素（6M、4M、3M、2M、1M、0M）的透析复性液（pH=7.0）中透析，使重组蛋白复性，最后在50mM Tris-HCl（pH=7.0）的缓冲液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析复性后的重组蛋白经PALL公司的Microsep Advance超滤离心浓缩管进行浓缩，用碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒测得三疣梭子蟹PtPLC重组蛋白的浓度为3.8mg/ml（参见图1）。 

实施例3. 

三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC重组蛋白的抑制活性试验： 

1.蛋白酶液及试剂的准备：牛胰蛋白酶、牛α-胰凝乳蛋白酶分别溶于1M Tris-HCl溶液（pH=7.0）使蛋白酶浓度达到0.1mg/ml，4℃备用。4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF）溶于1M Tris-HCl溶液（pH=7.0）使AEBSF浓度达到100mM，4℃备用。用pH值为7.2磷酸缓冲液配制质量分数为1％的Azocasein底物溶液，操作在无菌条件下进行，并在4℃冰箱中稳定2-3天备用。取10g三氯乙酸（TCA）溶于50ml双蒸水中，最后定容至100ml，制备成10％TCA，4℃备用。 

2.重组蛋白PtPLC抑制活性测定：在无菌平底96孔板（Costar，Fisher）中加入0.1mg/ml的牛α-胰凝乳蛋白酶或牛胰蛋白酶作为底物，实验组分别加入1μM、2μM、3μM上述实施例所得重组蛋白PtPLC，阴性对照组（blank）加入1M Tris-HCl溶液，阳性对照组加入100mM AEBSF，总体积200μl 32℃孵育10min。然后加入200μl 1％azocasein，32℃孵育45min，加入150μl 10％TCA，冰上10min，13000rpm，4℃离心10min，取上清。将14μl 5M NaOH加到90μl上清中，测405nm吸光值。蛋白酶抑制活性（％）的计算公式如下： 

Inhibitory activity(％)=100-[(Abs _SPI-Abs _blank)/(Abs _control-Abs _blank)]×100 

发现上述实施例重组蛋白PtPLC对牛胰蛋白酶及牛α-胰凝乳蛋白酶有不同的抑制活性（参见图2）。重组蛋白PtPLC浓度为1μM、2μM、3μM时，对牛胰蛋白酶的抑制活性分别为88.73％、90.73％和97.18％；重组蛋白PtPLC浓度为1μM时，对牛α-胰凝乳蛋白酶没有明显的抑制活性，而当重组蛋白浓度达到2μM、3μM时，对牛α-胰凝乳蛋白酶的抑制活性达到31.1％和99.69％。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一种三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因，其特征在于：三疣梭子蟹PtPLC基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

2.一种权利要求1所述的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因编码蛋白，其特征在于：所述三疣梭子蟹PtPLC基因编码蛋白为序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。

3.一种按权利要求1所述的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因的应用，其特征在于：所述三疣梭子蟹PtPLC基因编码蛋白的重组表达产物用于制备蛋白酶的抑制剂药物、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。

4.按权利要求3所述的三疣梭子蟹Pacifastin型丝氨酸蛋白酶抑制剂PtPLC基因的应用，其特征在于：所述蛋白酶的抑制剂为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的抑制剂。

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