CN104117059A - 三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶（PtcSP）基因的应用。三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因编码蛋白的重组表达产物可作为制备免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂、保鲜剂、蛋白酶药物或抗菌药物中的应用。本发明在药物开发和饲料添加剂生产等方面具有潜在的应用价值，为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育奠定基础。

Description

三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶（PtcSP）基因的应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶（Serine protease,SP）广泛存在于生物界中，是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白酶家族，在生物有机体中起着重要而广泛的作用。丝氨酸蛋白酶拥有共同的保守催化结构域，在该结构域的活性中心有3个保守的氨基酸残基，组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和丝氨酸（Ser），它们构成了催化三联体结构（catalytic triad），负责催化肽链的断裂。根据丝氨酸蛋白酶的序列特征、拓扑结构和功能的相似性，丝氨酸蛋白酶可分为72个家族，包括胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳铁传递蛋白、粘液素家族和其它相关酶类。

近年来的研究表明，丝氨酸蛋白酶是无脊椎动物先天免疫过程中至关重要的蛋白酶家族。丝氨酸蛋白酶主要通过丝氨酸蛋白酶级联反应实现其功能，在其调控因子的协同作用下，不但直接调控免疫信号的转导和级联放大，还可激活不同的免疫防御机制，如血液凝结、黑化反应和抗菌肽的合成等。目前已在多种物种如烟草天蛾、东北大黑鳃金龟、淡水螯虾中鉴定丝氨酸蛋白酶基因。这些酶大多是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，除保守的催化结构域外，其N-端含有由6个保守的半胱氨酸残基（可形成三个二硫键）组成的特殊Clip结构域。研究认为带有Clip结构域的丝氨酸蛋白酶（cSP）在无脊椎动物的免疫和发育过程中起重要作用。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养价值丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。但随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的各种疾病日趋严重，给梭子蟹养殖业造成巨大的经济损失。因此，开展三疣梭子蟹免疫防疫基础研究，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，通过提高蟹自身免疫抵抗力来防止和减少蟹病的发生，是实现其健康养殖的可靠保障。

到目前为止，关于三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶的研究尚少。因此，开展三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因的重组表达与应用的研究，将对研究三疣梭子蟹的免疫防御机制和进行病害防治具有重要的理论和实践意义，同时将有助于开发天然药物用于人类疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因的应用，三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因编码蛋白的重组表达产物可作为制备免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂、保鲜剂、蛋白酶药物或抗菌药物中的应用。

所述三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因编码蛋白的重组表达产物用于制备胰蛋白酶或革兰氏阴性菌的抑菌药物。

所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌或铜绿假单胞菌。

三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因编码蛋白的重组表达产物为，利用带有限制性酶切位点的引物P1和P2通过PCR扩增三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因编码区片段；再将pET30a载体与上述PCR扩增产物经BamHI和XhoI双酶切，连接后转化表达菌株BL21(DE3)-pLysS；(表达菌株进行诱导培养，超声波破碎处理菌体收获重组蛋白，经TALON柱纯化、复性后得到具有活性的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶。所述P1为5'GGATCCCAAGCTCGCCAGTGTTCATCTG3'；P2为5'CTCGAGCTAGGGCTTGATGCTGCTTG3'。

本发明所具有的优点：

本发明通过PCR技术扩增编码三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP成熟肽的基因片段并将其克隆到pET30a(+)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)-plysS实现体外重组表达。重组蛋白PtcSP经TALON柱纯化和透析后，具有显著的胰蛋白酶活性，当重组蛋白PtcSP浓度为4μM时，对胰蛋白酶底物N-苯甲酰-苯丙氨酰-缬氨酰-精氨酰-对-硝基苯胺的具有明显的水解活性，与阴性对照组相比达到了显著差异水平，而对胰凝乳蛋白酶底物N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对-硝基苯胺没有明显的水解作用；重组蛋白PtcSP对革兰氏阴性菌溶藻弧菌、铜绿假单胞菌具有显著的抑菌活性，最小抑菌浓度均为10.55μM，而对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌、真菌毕赤酵母没有明显的抑制作用。

本发明基因及其重组蛋白主要在药物生产、免疫增强剂、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中应用，另外还可以为进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育提供参考。

附图说明

图1为本发明实例提供的纯化的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP编码成熟肽的基因扩增产物电泳图（其中，M：DNA marker，1：成熟肽的基因扩增产物）。

图2为本发明实例提供的诱导和纯化的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP重组蛋白电泳图（其中M：蛋白marker；1：未诱导菌体中表达的蛋白；2：IPTG诱导后表达的蛋白；3：纯化的重组蛋白）。

图3为本发明实例提供的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP重组蛋白对底物N-苯甲酰-苯丙氨酰-缬氨酰-精氨酰-对-硝基苯胺和N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对-硝基苯胺的水解作用图（Tris-HCl为阴性对照组）。

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。

实施例1.

三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因编码区（信号肽除外）重组蛋白的获得，具体操作如下：

1.重组载体的构建

根据三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP的cDNA序列，设计含有限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点的特异性引物P1（5'GGATCCCAAGCTCGCCAGTGTTCATCTG3'）和P2（5'CTCGAGCTAGGGCTTGATGCTGCTTG3'），通过PCR技术扩增编码三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶成熟肽的基因片段（参见图1），反应在TaKaRa PCR ThermalCycler Dice Model TP600（Takara Bio Inc.）中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性45s，57℃退火50s，72℃延伸1min30s，30个循环；最后72℃延伸10min。将扩增片段纯化回收，与pMD19-T简单载体（Takara）连接。转化到大肠杆菌Trans1-T1（TransGen）后筛选阳性克隆，提取质粒。使用BamHI和XhoI两种酶酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经BamH I和XhoI两种酶酶切的表达载体pET30a连接，完成重组载体的构建。

2.重组蛋白PtcSP的表达

将构建的重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)-plysS，筛选阳性克隆并测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种到200ml含卡那霉素（50μg/ml）的LB液体培养基中，220rmp37℃振荡培养至O.D.₆₀₀=0.4-0.6。加入IPTG至终浓度为1mM诱导4小时后，在4℃，4000rmp离心15分钟，收集菌体，与-20℃冻存备用。取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μl水和20μl的蛋白上样缓冲液（5倍稀释），100℃沸水中煮10min后离心，取上清，SDS-PAGE电泳检测表达产物。

3.重组蛋白PtcSP的纯化与复性

菌体在冰浴条件下用超声波180W处理20-30min（每次2s，间隔2s），离心去掉上清，收集沉淀（含重组蛋白包涵体）。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON柱纯化重组产物。将纯化的重组蛋白转移到透析袋中，4℃条件下，在含有2mM还原谷胱苷肽、0.2mM氧化谷胱苷肽、1mMEDTA、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、10%甘油和1%甘氨酸的及梯度降低的尿素（6M、4M、3M、2M、1M、0M）的透析复性液（pH=8.0）中透析，使重组蛋白复性，最后在50mM Tris-HCl（pH=8.0）的缓冲液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析复性后的重组蛋白经PALL公司的Microsep Advance超滤离心浓缩管进行浓缩，用碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒测得三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶重组蛋白的浓度为1.90mg/ml（参见图2）。

三疣梭子蟹PtcSP基因为SEQ ID No.1中所示的碱基序列。

序列表SEQ ID No.1为：

gggggtctcc gccgagccag tctgttggtg gtttccaggt gttctcgtgc gcgccagaaagaggaacaag atg aag tgg aga gtg tgt tgc agc ctg gtg gtg atg gcg gcg gtg gtg gcgtca gtg act gag gga gca gtg agg aca gcc agg caa gct cgc cag tgt tca tct ggt gag gag tgc ctg tcg ctg agg gtg tgc agg tcg atc cag gac gtg gtg tcg agt cgg cgg tct ggt tgg gag att att gtg agg gag gcg ata tgt ggg caa gac aac ggt ggc ttc aga gtg tgc tgc cca gac tct gac ccc ggc tcc aac aac ccc gtc gtc tcc ggc agc agc tcc acc act tcc cag cct act gtg gac gga gaa aca ctg ctg ccg aag ggg agt gag tgc ggg caa tcc ggt aac cac agg gtc gtg ttc ggg gaa gat gct cct ctc tat gcc tat cct tgg atg gtg ctg ctc gga tac aga gac aga gcc aac cca tcc tgg aag tgt ggc ggc gcc ctc atc aac gac cgc tac gtg ctc acc gct gct cac tgc gtc cac cgt aac ttc acc atc ccc tct ggc aac ggc gat gta gtg gcc ctg cga gtg gga gaa cac acc ata tcc atc gac cca gac tgc gcc ctg acc gat gcc gtg ccg tgt tcc tcc ccc gag gac ttc gac cca gaa gag gtg atc gtt cac cct cag ttc aac aag cga gct cct gtg agt gac gac atc gcc ctc att cgc ctc aac aag aag gtc acg ttt ggc ttt tcc gct aag cca gtg tgc ctt ccc gct gcg ggc ttg gac gtg aag agc ttc ctg ggt gcg cgc gac gcc gtg gtg gca ggt tgg ggc gcc aca gag acc acc tcc acc tct gac gtc ctg cag gct gcg aag gtt cca ttc gca gag aag tcc acg tgc gag cct ttc tat cgc aac cag ctg gtg gac gag cag gtg tgc ttc ggc ggg aga ggc aac gta gac tcc tgc ttc gga gat tct ggt ggc cca gtc ttc caa acc cac aac gaa ctc cct cgc ttc acc gtg ctg ggc atc gtg tcc cgc ggc gtg cgt gag tgc ggg act cct ggg gtt cct gct gtc tac acc aac gtc gcc ttc tac agg cag tgg ata gca agc agc atc aag ccc tag gatctctcct ttctcttcag ggacatctga gtccttcctt cacacagccc caaagatgacctcctccttg tggtgttccc tacatcccca tggcgctgct tccctccccg cggctccaag tgcccgtgtccctctccaat agtcactttc ctagttcagt attacaacaa ttttttcgcg actcttcttg ccacaattaggaagccagat atgggtcctt cattagcggg gaaagtattt atatgtagtg acaatgatat gtgataagccagtatggcgc taataataaa atatttaagt tctaaaaaaa aaaaaaaaaa

（a）序列特征：

●长度：1530bp，有效长度137-1210

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：双链DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶

（f）特异性名称：gene

三疣梭子蟹PtcSP基因为SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列

序列表SEQ ID No.2为：

MKWRVCCSLVVMAAVVASVTEGAVRTARQARQCSSGEECLSLRVCRSIQDVVSSRRSGWEII VREAICGQDNGGFRVCCPDSDPGSNNPVVSGSSSTTSQPTVDGETLLPKGSECGQSGNHRVV FGEDAPLYAYPWMVLLGYRDRANPSWKCGGALINDRYVLTAAHCVHRNFTIPSGNGDVVALR VGEHTISIDPDCALTDAVPCSSPEDFDPEEVIVHPQFNKRAPVSDDIALIRLNKKVTFGFSA KPVCLPAAGLDVKSFLGARDAVVAGWGATETTSTSDVLQAAKVPFAEKSTCEPFYRNQLVDE QVCFGGRGNVDSCFGDSGGPVFQTHNELPRFTVLGIVSRGVRECGTPGVPAVYTNVAFYRQW IASSIKP

（a）序列特征：

●长度：379bp，有效长度23-379

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）假设：否

（c）反义：否

（d）最初来源：三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶

（e）特异性名称：PRT

其具有完整的编码蛋白含有379个氨基酸，其中编码序列的1-22个氨基酸为信号肽，成熟肽包含357个氨基酸，预测的分子量为40.6kDa，等电点为6.11。成熟肽具有典型Clip结构域和Tryp_SPc催化结构域，其催化结构域包含保守的催化三联体残基（His,Asp和Ser）。

实施例2.

三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP重组蛋白的蛋白酶活性试验：

1.蛋白酶液及底物的准备：上述实施例所得重组蛋白PtcSP用50mMTris-HCl溶液（pH=8.0）稀释到0.4μM和4.0μM，4℃备用。牛胰蛋白酶、牛α-胰凝乳蛋白酶分别溶于50mM Tris-HCl溶液（pH=8.0）使蛋白酶浓度分别达到0.005μM和0.003μM，4℃备用。蛋白酶底物N-苯甲酰-苯丙氨酰-缬氨酰-精氨酰-对-硝基苯胺(N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide,Sigma)和N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对-硝基苯胺(N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide,Sigma)分别溶于50mMTris-HCl溶液（pH=8.0），使其浓度分别达到293.6μM和147.3μM，4℃备用。

2.重组蛋白PtcSP蛋白酶活性测定：在无菌平底96孔板（Costar，Fisher）中加入293.6μM的N-苯甲酰-苯丙氨酰-缬氨酰-精氨酰-对-硝基苯胺或147.3μM N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对-硝基苯胺作为底物，实验组分别加入0.4μM和4.0μM上述实施例所得重组蛋白PtcSP，阴性对照组加入50mM Tris-HCl溶液，阳性对照组加入0.005μM牛胰蛋白酶或0.003μM牛α-胰凝乳蛋白酶，总体积100μl，30℃孵育15分钟。然后加入20μl50%的乙酸终止反应。将反应后的96孔板在波长为405nm的可见光下读数，测定反应释放产物对-硝基苯胺的增加量。

发现上述实施例重组蛋白PtcSP对胰蛋白酶底物N-苯甲酰-苯丙氨酰-缬氨酰-精氨酰-对-硝基苯胺有明显的水解作用，而对胰凝乳蛋白酶底物N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对-硝基苯胺没有明显的水解作用，表明重组蛋白PtcSP是一种具有胰蛋白酶样活性的丝氨酸蛋白酶（参见图3）。当重组蛋白PtcSP在浓度为4μM时，对底物N-苯甲酰-苯丙氨酰-缬氨酰-精氨酰-对-硝基苯胺的水解活性是阴性对照组的1.69倍，达到了显著差异水平（P<0.05）。

实施例3.

三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP重组蛋白的体外抑菌试验：

1.微生物的培养及制备：溶藻弧菌用TSB培养基28℃，铜绿假单胞菌用TSB培养基37℃，金黄色葡萄球菌用LB培养基37℃，藤黄微球菌用LB培养基37℃，毕赤酵母用YPD培养基28℃，上述各菌株用摇床220rpm培养使菌浓度达到对数生长期时，分别用50mM Tris-HCl（pH=8.0）缓冲液稀释菌体，分别使其每毫升菌液中的菌落数约为1×10³。

2.重组蛋白PtcSP抑菌活性测定：利用上述实施例所得重组蛋白PtcSP用Tris-HCl（50mM，pH=8.0）梯度稀释（1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64）后，取50μl加到无菌平底96孔板（Costar，Fisher）中，50μlTris-HCl（50mM，pH=8.0）设为对照，然后加入50μl稀释好的菌悬液，并且混匀。只加入50μl菌液的孔为空白孔。96孔板在菌液的培养温度下孵育3小时后，加入相应的培养基150μl，空白孔加入培养基200μl，孵育过夜。加溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、毕赤酵母的96孔板在波长为560nm的可见光下读数，加金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的96孔板在波长为600nm的可见光下读数。发现上述实施例重组蛋白三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶对革兰氏阴性菌溶藻弧菌和铜绿假单胞菌有明显的抑制作用，最小抑菌浓度均为10.55μM；而对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌真菌毕赤酵母没有明显的抑制作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因的应用，其特征在于：三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因编码蛋白的重组表达产物可作为制备免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂、保鲜剂、蛋白酶药物或抗菌药物中的应用。

2.按权利要求1所述的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因的应用，其特征在于：所述三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因编码蛋白的重组表达产物用于制备胰蛋白酶或革兰氏阴性菌的抑菌药物。

3.按权利要求2所述的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因的应用，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌或铜绿假单胞菌。

4.按权利要求1或2所述的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因的应用，其特征在于：三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因编码蛋白的重组表达产物为，利用带有限制性酶切位点的引物P1和P2通过PCR扩增三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因编码区片段；再将pET30a载体与上述PCR扩增产物经BamHI和XhoI双酶切，连接后转化表达菌株BL21(DE3)-pLysS；(表达菌株进行诱导培养，超声波破碎处理菌体收获重组蛋白，经TALON柱纯化、复性后得到具有活性的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶。

5.按权利要求4所述的三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶PtcSP基因的应用，其特征在于：所述P1为5'GGATCCCAAGCTCGCCAGTGTTCATCTG3'；P2为5'CTCGAGCTAGGGCTTGATGCTGCTTG3'。