CN1325515C - 锯缘青蟹抗菌肽及其基因和基因的克隆方法 - Google Patents
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Abstract
锯缘青蟹抗菌肽及其基因和基因的克隆方法，涉及一种抗菌活性多肽scygonadin及其基因。从锯缘青蟹雄性腺中分离纯化得抗菌肽scygonadin，并以锯缘青蟹的雄性腺总RNA为模板，根据测定的scygonadin抗菌肽N端20个氨基酸序列，设计合成简并引物，利用RT-PCR、RACE等分子生物学技术手段，克隆到锯缘青蟹抗菌肽scygonadin全长cDNA基因序列。该基因可通过构建真核表达载体建立高效表达该抗菌肽的基因工程菌株，体外生产抗菌肽，作为饲料免疫添加剂替代传统饲料中的抗生素，也可以作为抗生素的有效替代品，用于水产养殖业中耐药性细菌的防治药物。另外，还可以用于转基因青蟹的育种研究。
Description
技术领域
本发明涉及从锯缘青蟹(Scylla serrata(forskal))的雄性腺中分离纯化到的一种抗菌活性多肽scygonadin，并据此克隆出的编码该抗菌肽的基因。
背景技术
锯缘青蟹，英文名mud crab，blue crab拉丁名Scylla serrata(forskal)，俗称青蟹、闸蟹、虫寻、蝤蛑，自然分布较广，在温带、亚热带、热带海区均有其踪迹，是重要的海水养殖经济品种。近年来，随着青蟹人工育苗技术的突破，养殖技术的改进，青蟹养殖逐渐由粗放养殖向集约化养殖转变。但随着养殖密度的增加，养殖水体富营养化现象越来越严重，致使养殖环境恶化，病毒病、细菌病、真菌病和寄生虫病等病害不断暴发，既造成巨大经济损失，又严重挫伤了人们的养殖积极性。
抗菌肽(Antibacterial Peptides，ABP)是一类具有很强的广谱抗细菌活性的天然小肽类物质，被认为是鱼类、甲壳类、贝类等动物非特异性免疫防御系统的主要成分之一。当生物体受到损伤或病原微生物侵袭时，能迅速产生抗菌肽，以预防和杀伤病原微生物的入侵，其合成速度快，在体内扩散迅速、灵活等特点是其他大分子蛋白质(如抗体等)和免疫细胞所不具备的，在防御海水性细菌和病毒入侵方面起着重要作用。
甲壳动物的抗菌肽研究较少，在蟹类中，直到1996年Schnapp等(Schnapp D et al.，Eur.J.Biochem.，1996，240：532-539)用离子交换层析和高效液相色谱法(HPLC)，分离岸蟹(Carcinusmaenas)血细胞溶解物获得抗菌肽(6.5KDa)，并测定其N-末端部分序列，结果发现与哺乳动物的bactenecin 7相近，为富含脯氨酸的阳离子抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌活性多肽。1999年Relf等(Relf J.M.et al.，Eur.J.Biochem.，1999，264：350-357)分离岸蟹的颗粒细胞获到一个11.5kDa的抗菌肽，该蛋白对热稳定，耐高盐的两性阳离子多肽，但仅对海洋革兰氏阳性细菌起毒杀作用，其氨基酸序列与已知的抗菌肽序列不同，但与人类的抗白细胞蛋白酶高度同源。1999年V.Jayasankar等(Jayasankar V et al.，Journal ofExperimental Marine Biology and Ecology.1999，236：253-259)分离锯缘青蟹[Scylla serrata(Forskal)]精液获得一种20KDa的抗菌蛋白，首先证明了无脊椎动物精液中存在抗菌活性物质，但并未进一步深入研究。同年，Khoo等(Khoo LH et al.，Mar Biotechnol.，1999，1：44-51)报道了从C.sapidus血细胞中分离到3.7kDa，抗E.coli活性的抗菌肽-Callinectin，并测定其部分氨基酸序列，发现其N-末端富含脯氨酸，不形成Pro-Arg-Pro motif，且与已知抗菌肽没有显著的同源性。
抗菌肽基本的抗菌机理是：抗菌肽分子破坏细菌的细胞膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，导致细菌停止生长或死亡。其抗菌机理不同于传统抗生素，由于分子量小，极易扩散到感染部位，使用后不存在产生耐药性问题，且进入机体后无有害残留。因此，抗菌肽在海水养殖蟹类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌药物；但通过蟹类直接提取或利用化学方法人工合成天然的抗菌肽，受动物来源和化学合成方法的限制，很难获得足够量的抗菌肽，且费用昂贵，因而分离克隆抗菌肽基因，利用基因工程方法体外大量生产抗菌肽，是获得高产量的抗菌肽并保证其在水产养殖业大面积推广应用的前提。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种从锯缘青蟹的雄性腺中分离纯化的抗菌肽scygonadin以及克隆的该抗菌肽基因。该基因可构建真核表达载体建立高效表达锯缘青蟹抗菌肽的基因工程菌株，体外大量生产锯缘青蟹抗菌肽，作为饲料免疫添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素。
本发明所说的从锯缘青蟹的雄性腺中分离纯化的锯缘青蟹抗菌肽scygonadin分子量约为10.8KDa，其N-末端20个氨基酸序列为“Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro LysIle Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly”。
本发明所说的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽基因cDNA共有564nt，其中含有5’端非编码区长56nt(5’UTR)，1个阅读框长378nt，3’非编码翻译区长130nt(3’UTR)，其GenBank系列号为AY864802，其序列如下：
序列表一：锯缘青蟹(Scylla serrata)的scygonadin抗菌肽全长cDNA序列：
acacacccgc aacctctatc accaccacaa catccactcg cctccagacc ctcaca
c 60
gttcatctct cctactcggc cttacagtgg tggtgctgct gggcgtcatc gtgcctccat 120
gcatggcagg ccaggcactc aacaaactta tgcctaaaat cgtcagcgcc ataatttata 180
tggtcgggca acccaatgca ggtgtcactt ttctgggcca ccaatgtctg gtggagtcaa 240
cgaggcaacc agacgggttt tacaccgcaa agatgtcgtg tgcttcctgg actcatgata 300
atcctattgt tggggaagga agaagccggg ttgaacttga ggcgcttaaa ggttccatca 360
caaactttgt ccagacagca tccaattaca agaagttcac catagatgag gtcgaggact 420
ggattgcttc ttac
gac gctcacctga cgtgctctcc gagtccacca aagctgtctt 480
tgctggagcc actaagagtg gtttggttat tgaggacaat aaataacttt ctgaatttta 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 564
序列表二：锯缘青蟹scygonadin抗菌肽cDNA预测编码蛋白氨基酸序列：
Met Arg Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Thr Val Val Val Leu Leu Gly
-20 -15 -10
Val Ile Val Pro Pro Cys Met Ala Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met
-5 -11 5
Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala
10 15 20
Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln
25 30 35 40
Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His
45 50 55
Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala
60 65 70
Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys
75 80 85
Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr
90 95 100
序列表三：锯缘青蟹scygonadin抗菌肽cDNA读码框及预测蛋白氨基酸序列：
acacacccgc aacctctatc accaccacaa catccactcg cctccagacc ctcaca atg 59
Met
cgt tca tct ctc cta ctc ggc ctt aca gtg gtg gtg ctg ctg ggc gtc 107
Arg Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Thr Val Val Val Leu Leu Gly Val
5 10 15
atc gtg cct cca tgc atg gca ggc cag gca ctc aac aaa ctt atg cct 155
Ile Val Pro Pro Cys Met Ala Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro
20 25 30
aaa atc gtc agc gcc ata att tat atg gtc ggg caa ccc aat gca ggt 203
Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly
35 40 45
gtc act ttt ctg ggc cac caa tgt ctg gtg gag tca acg agg caa cca 251
Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro
50 55 60 65
gac ggg ttt tac acc gca aag atg tcg tgt gct tcc tgg act cat gat 299
Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Set Cys Ala Ser Trp Thr His Asp
70 75 80
aat cct att gtt ggg gaa gga aga agc cgg gtt gaa ctt gag gcg ctt 347
Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu
85 90 95
aaa ggt tcc atc aca aac ttt gtc cag aca gca tcc aat tac aag aag 395
Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys Lys
100 105 110
ttc acc ata gat gag gtc gag gac tgg att gct tct tac taagacgctc 444
Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr
115 120 125
acctgacgtg ctctccgagt ccaccaaagc tgtctttgct ggagccacta agagtggttt 504
ggttattgag gacaataaat aactttctga attttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 564
锯缘青蟹scygonadin抗菌肽的分离纯化及其cDNA基因克隆过程如下：
1)锯缘青蟹scygonadin抗菌肽的分离纯化：采用离子交换层析、反相层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术方法，分离纯化锯缘青蟹输精管的酸性萃取液，获得一个分子量约为10.8KDa具有抗革兰氏阳性细菌的活性多肽scygonadin，并由上海基康生物技术有限公司测定其N-末端20个氨基酸序列。
2)锯缘青蟹scygonadin抗菌肽抗菌活性的测定：采用溶壁微球菌(G+)和嗜水气单胞菌(G-)为检测菌，用微量液体培养法测定其抗菌活性。结果表明，Scygonadin抗菌肽具有很强的抗革兰氏阳性细菌和较强的抗革兰氏阴性细菌的活性。
3)锯缘青蟹scygonadin抗菌肽cDNA基因克隆过程
根据已测定的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽N端20个氨基酸序列设计简并引物：F15’-AAYAAR YTN ATG CCN AAR ATH GT-3’；F2 5’-GCN ATH ATH TAY ATG GT-3’(R＝A+G；Y＝T+C；H＝A+C+T；N＝T+C+A+G)，下游引物采用大连宝生物公司的3’-Full RACE Core Set(TaKaRa)的3 site Adaptor Primer(5`-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3`，S2)。以健康锯缘青蟹的性腺总RNA为模板，采用大连宝生物的3’-Full RACE Core Set试剂盒中的oligodT-3sites Adaptor Primer(S1)试剂进行反转录，用F1与S2引物进行PCR扩增，取1μL产物作为模板，再用F2和S2进行PCR得到约400bp特异扩增cDNA条带，经测序得到394bp的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽基因片段；在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过Blast分析证实得到的基因片段为新的基因。
3)根据获得的基因片段设计合成特异引物GSP(密码子ATG下游201bp-227bp)作为下游引物：GSP：5`-GCACACGACATCTTTGCGGTGTAGAAC-3`，利用5′-CDS引物(Clontech.)：5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMARTIIA oligo(SMART RACE cDNAAmplification Kit，Clontech.)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG作为上游引物，以锯缘青蟹性腺总RNA为模板，进行5`race。
4)为进一步获得5’race产物的量，利用UPM(Clontech).：(5′)CTA ATA CGA CTC ACTATA GGG CAA CGC AGA GT、NUPM(Clontech)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT和GSP1进行嵌套PCR扩增得到大约300bp cDNA条带，测序得283bp锯缘青蟹scygonadin抗菌肽含5`端cDNA片段。经5’race和3’race的测序结果拼接而获得锯缘青蟹scygonadin抗菌肽全长cDNA。
本发明以离子交换、反向层析等技术从锯缘青蟹雄性腺中分离纯化到一种新抗菌肽scygonadin，该肽在体外有明显的抑制或杀死溶壁微球菌(Micrococcus lysoleiksicus)等革兰氏阳性细菌和抑制鱼类病原菌——嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等革兰氏阴性细菌等作用。并以锯缘青蟹的雄性腺总RNA为模板，根据测定的scygonadin抗菌肽N端20个氨基酸序列，设计合成简并引物，利用RT-PCR、RACE等分子生物学技术手段，成功地克隆到锯缘青蟹抗菌肽scygonadin全长cDNA基因序列，该基因属于一种新基因。与国外从岸蟹(Carcinus maenas)血细胞中分离获得的6.5KDa、11.5KDa，以及从锯缘青蟹[Scylla serrata(Forskal)]精液分离到一种20KDa的抗菌肽，其分离的组织部位、分子量大小、肽链的一级结构(氨基酸序列)以及核苷酸序列都不同。基因可通过构建真核表达载体建立高效表达该抗菌肽的基因工程菌株，体外大量生产出抗菌肽，作为饲料免疫添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素，用于水产养殖业，实现绿色养殖，减少乃至消除抗生素在水产品中的蓄积，提高水产品质量；也可以作为某些耐药性抗生素的有效替代品，用于水产养殖业中耐药性细菌的防治药物。另外，该基因还可以用于转基因青蟹的育种研究。
附图说明
图1为抗菌肽Scygonadin的反相层析及抗菌活性图。
图2为抗菌肽scygonadin的SDS-PAGE电泳图。
图3为提取的锯缘青蟹性腺总RNA电泳图。
图4为RT-PCR电泳图。
图5为5`race电泳图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作详细说明。
实施例：
1.锯缘青蟹scygonadin抗菌肽的分离纯化：
解剖分离锯缘青蟹的输精管，加入等体积的酸性萃取液[15％乙酸、0.1％三氟乙酸和1mM苯甲酸磺酰氟(PMSF)]，匀浆20min(6000r·min-1)，匀浆液于4℃15000g离心45min，取上清。用等体积萃取液重悬沉淀，超声波破碎(400w 10s破碎15次)后，4℃15000g离心45min，取上清，合并两次上清液，冷冻干燥。用0.05M乙酸钠缓冲液(pH5.0)溶解样品，4℃ 10000g离心10min，取上清，过SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，用1.5M乙酸铵梯度洗脱，0-50％洗脱5个柱体积(CV)，50％-80％洗脱2CV，80-100％洗脱5CV。洗脱的组分为350-410ml抗菌活性最强，用反相Source 5R RPC(Amersham瑞典)纯化。预先用A液(0.065％三氟乙酸，2％乙腈)平衡2CV，用B液(0.05％三氟乙酸，80％乙腈)进行梯度洗脱(0-15％，1.5CV；15-30％，10CV；30-50％，8CV；80-100 1CV)，检测A280，收集峰值为74.89mL处的组分即为scygonadin抗菌肽样品(见图1)，进行TricineSDS-PAGE凝胶电泳鉴定(见图2)，测序(上海基康生物技术有限公司)，获得其N-末端部分序列为“Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr MetVal Gly”。
2.抗菌活性检测：取被检测的细菌(嗜水气单胞菌，G-；溶壁微球菌，G+)斜面一环，划线于MHA平板上，28℃倒置培养16～18h。从上述平板上各挑取1个单菌落接种于MHA斜面培养基中，28℃振荡培养24h。用0.05M HEPES(pH6.8)洗斜面培养物，调整稀释至OD620＝0.1，备用。实验在标准的96孔微量细胞培养板上进行，每个样品分别均设有两个实验和对照孔。根据实验设计在实验孔中分别加入25μL待检测样品和25μL细菌悬液，在阴性对照孔中加入25μL 50mM HEPES和25μL细菌悬液，另外在对照孔中加入25μL待检测样品和25μL 50mM HEPES(空白对照)。而后将细胞培养板置于28℃培养3h，每孔中再加入50μL无菌的MHB培养基，28℃培养2h。每孔中加入10μL MTS-PMS试剂(Promega公司)后，28℃培养1h。在酶标仪上测A492的值。按下列公式计算杀伤指数(KI)。
杀伤指数(％)＝[1-(实验组A492-空白对照A492)/(阴性对照A492-空白对照A492)]×100
结果判定：KI值越大，表示抗菌活性越强。
3锯缘青蟹性腺总RNA的提取
称取100mg锯缘青蟹雄性腺组织，用液氮研磨成粉末状，加到含有1mL Trizol的一无核酸酶离心管中。2～8℃下12000g离心10min，吸出粉红色上清，室温下温育5min，彻底去除核蛋白复合物，然后加200μL氯仿，盖紧盖子。剧烈振荡15sec，室温下温育2～3min，2～8℃下12000g离心15min。取上清至另一无核酸酶离心管，再加500μL异丙醇，轻轻混匀以沉淀RNA。室温温育10min，2～8℃下12000g离心10min，离心管底部可见一胶样沉淀即为RNA。弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，2～8℃下7500g离心5min。凉干RNA沉淀，并用100μL无核酸酶水溶解。测OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm，于1％琼脂糖凝胶电泳上分析(见图3)。
4.RT-PCR扩增目的片段scygonadin抗菌肽基因
4.1反转录反应与3’RACE
根据分离纯化的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽N-末端测定的20个氨基酸序列，设计上游引物F1 5’-AAY AAR YTN ATG CCN AAR ATH GT-3’和F2 5`-GCN ATH ATH TAY ATG GT-3’(简并性为：R＝A+G；Y＝T+C；H＝A+C+T；N＝T+C+A+G)，下游引物采用3’-Full RACE CoreSet(TaKaRa)的3 site Adaptor Primer(5`-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3`，S2)。以健康锯缘青蟹的性腺总RNA为模板，采用3’-Full RACE Core Set试剂盒中(TaKaRa)的oligodT-3sites Adaptor Primer(S1)试剂进行反转录，用F1与S2引物进行PCR扩增，取1μL作为模板，再用F2和S2进行PCR得到约400bp特异扩增cDNA条带，经测序得到394bp的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽基因片段；
在0.2mL离心管中加入以下物质：2μL 10×RNA PCR buffer，4μL MgCl2(25mM)，2μL dNTP Mixture(10mM each)，1μL AMV Reverse Transcriptase XL(5U·μL-1)，0.5μL RNase inhibitor(40U·μL-1)，1μL oligo dT-3sites Adaptor Primer(2.5μM)and 1μL锯缘青蟹性腺总RNA，补充无RNase蒸馏水使总体积达20μL。混合后，稍许离心后置于PCR仪上，运行如下列程序：30℃，10min；48℃，30min；95℃，5min；5℃，5min。
4.2 PCR反应
分别加入10×Mg2+free buffer 10.0μL、MgCl2(25mM)8.0μL、dNTPs(10mM)1.0μL、F1(10μM)2.0μL、S2(10μM)2.0μL、cDNA 4.0μL、Taq DNA聚合酶(1.0U/μL)0.5μL、用无核酸酶水补齐至总体积100μL。94℃预变性2min；94℃变性40sec，60℃复性45sec，72℃延伸60sec，30个循环；72℃延伸5min进行扩增。产物用双蒸水稀释100倍后，取4.0μL到下列反应体系中后加入10×Mg2+free buffer 10.0μL、MgCl2(25mM)8.0μL、dNTPs(10mM)L0μL、F2(10μM)2.0μL、S2(10μM)2.0μL、Taq DNA聚合酶(1.0U/μL)0.5μL，用双蒸水补齐至总体积100μL。94℃预变性2min；94℃变性40sec，60℃复性45sec，72℃延伸60sec，30个循环；72℃延伸5min。扩增获得约400bp特异扩增cDNA条带(见图4)经测序得到394bp的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽基因片段；在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过Blast分析证实得到的基因片段为新的基因。为获得该基因全长cDNA序列，进行5’race。
5.5′RACE
5.1反转录反应
根据获得的基因片段设计合成特异引物GSP(密码子ATG下游201bp-227bp)作为下游引物：GSP：5`-GCACACGACATCTTTGCGGTGTAGAAC-3`，利用5′-CDS引物(Clontech.)：5′-(T25)N，N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMART II A oligo(SMART RACE cDNA AmplificationKit，Clontech.)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做为上游引物。取3.0μL总RNA，1.0μL5′-CDS引物和1.0μL SMART II A oligo加入0.2mL的离心管中，70℃，10min，立即置于冰上，再加入5×First-Strand Buffer 2.0μL、DTT(20mM)1.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、PowerScript Reverse Transcriptase1.0μL至总体积10μL，42℃延伸90min；72℃温育7min灭活酶；5℃，5min。
5.2 PCR反应
加入10×Advantage PCR 5.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、50×Advantage Polymerase mix1.0μL、cDNA 5.0μL、UPM(2.0μM)1.0μL、GSP(10μM)1.0μL，用无核酸酶水补齐至50μL。94℃预变性2min；94℃变性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸2min，28个循环；72℃延伸5min。
5.3嵌套PCR
利用UPM(Clontech.)：(5′)CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAA CGC AGA GT、NUPM(Clontech.)：(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT和GSP进行嵌套PCR。取上步反应产物5.0μL，加入10×Advantage PCR 5.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、50×Advantage Polymerasemix1.0μL、NUMP(2.0μM)5.0μL、GSP 10μM)1.0μL，用无核酸酶水补齐至50μL。94℃预变性2min；94℃变性30sec，68℃复性30sec，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸5min。扩增得到大约300bp cDNA条带，测序得283bp锯缘青蟹scygonadin抗菌肽含5`端cDNA片段(见图5)。
6.序列分析与基因确定
扩增获得的cDNA产物由上海博亚生物技术有限公司进行DNA核苷酸序列测定。序列同源性比对和相似性搜索用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST在线软件进行；多序列比较用DNAssist2.0软件；以BLAST2软件辅助进行序列拼接；信号肽预测用SIGNALP在线查找(
http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/SignalP)。
所扩增获得的锯缘青蟹抗菌肽基因全长cDNA序列提交国际GenBank(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行新基因比较鉴定。
Claims (3)
1.锯缘青蟹抗菌肽，其特征在于所说的从锯缘青蟹的雄性腺中分离纯化的锯缘青蟹抗菌肽scygonadin分子量约10.8kDa，其N-末端20个氨基酸序列为“Gly Gln Ala Leu Asn LysLeu Met Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly”。
2.锯缘青蟹抗菌肽基因，其特征在于所说的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽基因cDNA共有564nt，其中含有5′端非编码区长56nt，1个阅读框长378nt，3′非编码翻译区长130nt，其GenBank系列号为AY864802，其序列如下：
序列表一：锯缘青蟹(Scylla serrata)的scygonadin抗菌肽全长cDNA序列：
acacacccgc aacctctatc accaccacaa catccactcg cctccagacc ctcaca
c 60
gttcatctct cctactcggc cttacagtgg tggtgctgct gggcgtcatc gtgcctccat 120
gcatggcagg ccaggcactc aacaaactta tgcctaaaat cgtcagcgcc ataatttata 180
tggtcgggca acccaatgca ggtgtcactt ttctgggcca ccaatgtctg gtggagtcaa 240
cgaggcaacc agacgggttt tacaccgcaa agatgtcgtg tgcttcctgg actcatgata 300
atcctattgt tggggaagga agaagccggg ttgaacttga ggcgcttaaa ggttccatca 360
caaactttgt ccagacagca tccaattaca agaagttcac catagatgag gtcgaggact 420
ggattgcttc ttac
gac gctcacctga cgtgctctcc gagtccacca aagctgtctt 480
tgctggagcc actaagagtg gtttggttat tgaggacaat aaataacttt ctgaatttta 540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 564
序列表二：锯缘青蟹scygonadin抗菌肽cDNA预测编码蛋白氨基酸序列：
Met Arg Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Thr Val Val Val Leu Leu Gly
-20 -15 -10
Val Ile Val Pro Pro Cys Met Ala Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met
-5 -1 1 5
Pro Lys Ile Val Set Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala
10 15 20
Gly Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln
25 30 35 40
Pro Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His
45 50 55
Asp Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala
60 65 70
Leu Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Ser Asn Tyr Lys
75 80 85
Lys Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Ser Tyr
90 95 100
序列表三：锯缘青蟹scygonadin抗菌肽cDNA读码框及预测蛋白氨基酸序列：
acacacccgc aacctctatc accaccacaa catccactcg cctccagacc ctcaca atg 59
Met
cgt tca tct ctc cta ctc ggc ctt aca gtg gtg gtg ctg ctg ggc gtc 107
Arg Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Thr Val Val Val Leu Leu Gly Val
5 10 15
atc gtg cct cca tgc atg gca ggc cag gca ctc aac aaa ctt atg cct 155
Ile Val Pro Pro Cys Met Ala Gly Gln Ala Leu Asn Lys Leu Met Pro
20 25 30
aaa atc gtc agc gcc ata att tat atg gtc ggg caa ccc aat gca ggt 203
Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly Gln Pro Asn Ala Gly
35 40 45
gtc act ttt ctg ggc cac caa tgt ctg gtg gag tca acg agg caa cca 251
Val Thr Phe Leu Gly His Gln Cys Leu Val Glu Ser Thr Arg Gln Pro
50 55 60 65
gac ggg ttt tac acc gca aag atg tcg tgt gct tcc tgg act cat gat 299
Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Lys Met Ser Cys Ala Ser Trp Thr His Asp
70 75 80
aat cct att gtt ggg gaa gga aga agc cgg gtt gaa ctt gag gcg ctt 347
Asn Pro Ile Val Gly Glu Gly Arg Ser Arg Val Glu Leu Glu Ala Leu
85 90 95
aaa ggt tcc atc aca aac ttt gtc cag aca gca tcc aat tac aag aag 395
Lys Gly Ser Ile Thr Asn Phe Val Gln Thr Ala Set Asn Tyr Lys Lys
100 105 110
ttc acc ata gat gag gtc gag gac tgg att gct tct tac taagacgctc 444
Phe Thr Ile Asp Glu Val Glu Asp Trp Ile Ala Set Tyr
115 120 125
acctgacgtg ctctccgagt ccaccaaagc tgtctttgct ggagccacta agagtggttt 504
ggttattgag gacaataaat aactttctga attttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 564
3.如权利要求2所述的锯缘青蟹抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于克隆过程如下：
1)锯缘青蟹scygonadin抗菌肽的分离纯化：采用离子交换层析、反相层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离纯化锯缘青蟹输精管的酸性萃取液，获到一个分子量约为10.8kDa具有抗革兰氏阳性细菌的活性多肽scygonadin，其N-末端部分序列为“Gly Gln Ala Leu Asn Lys LeuMet Pro Lys Ile Val Ser Ala Ile Ile Tyr Met Val Gly”；
2)锯缘青蟹scygonadin抗菌肽cDNA基因克隆过程
根据已测定的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽N端20个氨基酸序列设计简并上游引物即：F1，5′-AAY AAR YTN ATG CCN AAR ATH GT-3′；F2，5′-GCN ATH ATH TAY ATG GT-3′，其中R＝A+G；Y＝T+C；H＝A+C+T；N＝T+C+A+G。下游引物采用大连宝生物公司的3′-Full RACE CoreSet的3 site Adaptor Primer，序列为5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′，简称为S2，以锯缘青蟹的性腺总RNA为模板，采用大连宝生物的3′-Full RACE Core Set试剂盒中的oligodT-3sites Adaptor Primer，简称S1，进行反转录，用F1与S2引物进行PCR扩增，取PCR扩增产物作为模板，再用F2和S2进行PCR得到约400bp特异扩增cDNA条带，经测序得到394bp的锯缘青蟹scygonadin抗菌肽基因片段；
3)根据获得的基因片段设计合成特异引物GSP为下游引物，其序列为5′
-GCACACGACATCTTTGCGGTGTAGAAC-3′；利用通用5′-CDS引物和SMART II A oligo，均购自Clontech公司，其序列分别为为5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG-3′做为上游引物，以锯缘青蟹性腺总RNA为模板，进行5′race；
4)利用购自Clontech公司的通用引物UPM和NUPM，其序列分别为5′-CTA ATA CGA CTCACT ATA GGG CAA CGC AGA GT-3′和5′-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3′，与特异性引物GSP1进行嵌套PCR扩增得到大约300bp cDNA条带，测序得283bp锯缘青蟹scygonadin抗菌肽含5′端cDNA片段；经5′race和3′race的测序结果拼接而获得锯缘青蟹scygonadin抗菌肽全长cDNA。
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| 锯级青蟹等位酶的生化遗传研究 黎中宝等，中国生态农业学报，第12卷第2期 2004 * |
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