CN107936106B - 长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4、制备方法及应用 - Google Patents

长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP‑4，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制备方法依次按照如下步骤进行：用引物P1和P2对长牡蛎CgDM9CP‑4基因编码区片段进行PCR扩增；将PCR扩增产物与pET30a载体经Nde1和Xho1酶切后通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；将上述重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白。长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP‑2可制备抑制毕赤酵母菌和鳗弧菌的药物。

Description

长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4、制备方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4、制备方法及应用。
背景技术
长牡蛎是一种重要的海水养殖贝类。由于长牡蛎缺乏适应性免疫防御系统，主要依赖固有免疫系统抵御外源病原微生物的侵染，因此细菌、真菌和病毒引起的多种疾病在长牡蛎的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。包含DM9结构域的蛋白首先在果蝇中被发现。之后，Magalhaes等在鱼类中发现了一些具有DM9结构域的毒素，并将其命名为“natterin”，此类毒素含有N-端的DM9结构域和C-端毒素/细菌毒素（ETX/MTX2）结构域。natterin可以在人体组织中产生细胞毒性作用，从而导致细胞坏死、水肿、局部疼痛等现象。最新的研究表明，natterin具有穿孔素的功能。近几十年中，越来越多的含有DM9结构域的蛋白质（DM9CPs）在包括节肢动物、扁形动物等无脊椎动物中被发现，并且证明DM9CPs参与机体的免疫反应。例如，在冈比亚按蚊中，一种名为“引起疟原虫唾液腺反应”的DM9CPs(PRS1) ，唾液腺侧叶上的表达量在疟原虫入侵后显著升高，并随感染孢子虫数量的增加而增加。
但是，迄今为止并没有关于长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4、制备方法及在制备抑制毕赤酵母菌和鳗弧菌药物中应用的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4、制备方法及应用。
本发明的技术解决方案是：一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种上述长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 用引物P1和P2对长牡蛎CgDM9CP-4基因编码区片段进行PCR扩增；
b. 将PCR扩增产物与pET30a载体经Nde1和Xho1酶切后通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
c. 将上述重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白。
一种上述长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2在制备抑制毕赤酵母菌和鳗弧菌药物中的应用。
本发明利用体外重组表达技术获得了长牡蛎含DM9结构域的蛋白CgDM9CP-2，该重组蛋白在机体外对毕赤酵母菌和鳗弧菌具有较强的抑制作用，作为一种有效的模式识别受体，在制备抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有应用价值。
附图说明
图1是本发明长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4对毕赤酵母菌抑制效果示意图。
图2是本发明长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4对鳗弧菌抑制效果示意图。
具体实施方式
本发明的长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4的制备方法，依次按照如下步骤进行：
1. 重组载体的构建
用引物P1和P2对长牡蛎CgDM9CP-4基因编码区片段进行PCR扩增，；
PCR反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94 ℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用Nde1和Xho1两个酶酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经Nde1和Xho1两个酶酶切的表达载体pET-30a连接，完成载体的构建。
2. 重组蛋白CgDM9CP-4的表达
将构建好的重组载体转化表达宿主菌Transetta (DE3)中，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200 mL的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至OD 600 = 0.4~0.8。加入IPTG，使终浓度达到1 mmol L-1，继续培养4小时。 4℃，5000rpm，离心10分钟，收集菌体，于-20 ℃冻存备用。取1mL菌液离心，弃去上清后，加入80 μL水和20 μL的 5倍蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。
3. 重组蛋白CgDM9CP-4的纯化与复性
重组蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：
（1）镍琼脂糖凝胶 FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10 ml；
（2）用缓冲液I（50 mmol L-1 Tris-Hcl缓冲液， pH = 7.4, 50 m mol L-1 NaCl,8 mol L-1 尿素）平衡2~5个床体积，流速为2 ml min-1；
（3）取经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150 W超声破碎30 min，12000rmp，4 ℃离心30 min，上清液用0.45 μm 滤膜过滤后，过柱，流速为1 ml min-1；
（4）用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2 ml min-1；
（5）用有50 mmol L-1咪唑的缓冲液I再洗2~5个柱床体积，流速为2 ml min-1；
（6）用400 mmol L-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，收集。
（7）用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；
（8）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2 ml min-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2 mM的还原谷胱甘肽、0.4 mM氧化谷胱甘肽、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6 M逐渐替换到4 M、3 M、2 M、1M、0 M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油，每次在4 ℃透析12 h。即得到长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
长度：145个氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
特性：分子量为15.8kDa，等电点为5.93，具有2个保守的DM9结构域。
实验例：本发明的长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4抑菌活性检测
具体步骤如下：
1. 微生物的培养及制备
毕赤酵母（Pichia pastoris GS115，购自Invitrogen公司）用YPD培养基28℃，220rpm，鳗弧菌（Vibrio anguillarum，购自北京微生物菌种保藏中心）用2216E培养基28℃，220 rpm，培养到对数生长期时，用Tris-HCl （50 mmol L-1, pH = 8.0）分别稀释菌体，使每毫升菌液中的菌落数约为1×103CFU。
2. 重组蛋白CgDM9CP-4抑菌活性测定
对数生长期的毕赤酵母和鳗弧菌离心收集后分别用TBS（50mM Tris-Hcl, 150 mMNaCl）清洗重悬（1×104 CFU）。50 μL的本发明实施例的长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4与等体积的毕赤酵母或鳗弧菌室温孵育2 h。取20 μL上述混合物于平底 96 孔板（Costar，Fisher）中，每孔分别加入200 μL YPD和2216E液体培养基，于酶标仪中37℃振荡培养，每隔1 h分别检测记录各孔 OD600 值。另设 rTrx 蛋白对照组。每个样品设三个重复，根据3次测定结果取平均值作图，研究数据采用SPSS6.0软件进行统计学分析，显著差异（P < 0.05）用*标记。
图1是本发明长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4对毕赤酵母菌抑制效果示意图。
图2是本发明长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4对鳗弧菌抑制效果示意图。
实验结果表明本发明的长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4能够抑制毕赤酵母和鳗弧菌的生长。
序列表
<110>大连海洋大学
<120>长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4、制备方法及应用
<160>1
<170>SIP0SequenceListing 1.0
<210>1
<211>145
<212>PRT
<213>长牡蛎（Crassostrea gigas）
<400>1
Met Ala Val Trp Val Thr Thr Thr Asp Cys Tyr Ile Pro Glu His Ala
Ile Arg Ala Gly Tyr Glu Ala Asp Gly Arg Pro Leu Phe Ile Ala Arg
Ala Ser Ile Glu Gly Asp Leu Thr Pro Gly Lys Cys Gly Phe His Leu
Gln Gly Ala His Ile Pro Tyr Gly Cys Lys Glu Val Val Val His Gln
Tyr Glu Val Leu Val His Ala Asn Asn Ala Ser Gly Phe Tyr Asp Trp
Gln Arg Ala Ser Arg Gly Arg Val Pro Asn Asp Ala Val Ser Ser Asp
Thr Asp Leu Tyr Val Gly Arg Ala Tyr Phe Ser Gly Gly Leu Ile Pro
Cys Lys Val Ala Thr Ala Ser Ser His Met Cys Ala Tyr Ile Gly Cys
Glu Gly Val Glu His Ser Ser Met Asp Tyr Glu Val Leu Cys Lys Ile
Lys 145

Claims (1)

1.一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4在制备抑制毕赤酵母菌和鳗弧菌药物中的应用，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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