CN101121935B

CN101121935B - 栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN101121935B
Application number: CN2007100166967A
Authority: CN
Inventors: 宋林生; 王波; 赵建民
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2007-07-06
Filing date: 2007-07-06
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2027-07-06
Also published as: CN101121935A

Abstract

本发明涉及栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因克隆及体外重组表达技术，栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因，具有序列表SEQ ID No.1中碱基序列。本发明利用构建的栉孔扇贝cDNA文库，采用RACE技术及体外重组表达技术，对栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI进行了研究，从栉孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA全长序列，该基因具有序列表中所示的序列，并利用原核重组技术表达了具有较强胰蛋白酶抑制活性的重组蛋白。

Description

栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因及其部分序列体外重组表达技术，具体地说是从栉孔扇贝cDNA文库中克隆出栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的全长cDNA序列，并对其编码的一个Kazal结构域进行了原核重组表达；还涉及到该重组产物对胰蛋白酶的抑制活性，以及作为多种蛋白酶的抑制剂在人类相关疾病的治疗及饲料添加剂生产中的潜在应用价值。

背景技术

无脊椎动物天然免疫一般经过三个步骤：一是非己的识别，二是信号的调整和放大，三是产生各种目的基因的转录以激活细胞和效应物反应系统来杀死和清除病原体。丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂是信号调整和放大的载体，在无脊椎动物的天然免疫中起着核心作用。丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂的协同作用不但直接调控免疫信号转导和级联放大，还可激活无脊椎动物的一些其它免疫防御体系，如黑化反应、血液凝结等。

扇贝养殖是我国海水养殖和沿海地区经济发展的支柱性产业，但从1994年以来，养殖贝类开始出现大规模死亡现象，经济损失十分惨重。养殖贝类病害的不断爆发及病因的多样性迫切要求从扇贝自身的免疫防御机制入手研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施。鉴于丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂在无脊椎动物的天然免疫中起的核心作用，对其研究将有助于阐明扇贝免疫级联反应的机制，为扇贝天然免疫机理的阐明奠定基础，从而服务于我国的扇贝养殖产业。

同时，丝氨酸蛋白酶抑制剂在医学上也具有很好的利用价值。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较强的抑制丝氨酸蛋白酶的功能，如从药用水蛭中发现的胰蛋白酶抑制剂hirudin，及从昆虫Rhodnius prolixus中发现的包括两个Kazal型结构域的凝血酶抑制剂rhodniin，都具有较强的抑制凝血酶的功能。水蛭来源的胰蛋白酶抑制剂LDTI，能够抑制HIV-1的复制，可以用于艾滋病的防治。从人体中发现的具有15个Kazal结构域的LEKTI基因变异将导致Netherton综合症的发生，患者患有先天性鱼鳞癣，头发干燥，免疫缺陷，IgE升高，精神萎靡。近几年的研究还发现，人体内Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的减少与胰腺癌、胃癌及肺癌等疾病的发生密切相关。因此，从栉孔扇贝中克隆出Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，并对其重组表达蛋白的抑制活性进行深入研究，将有助于开发天然的海洋药物用于人类疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的是从栉孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，为进一步研究栉孔扇贝防御机制提供基础，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育及进一步开发医药产品和饲料添加剂奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI基因，具有序列表SEQ ID No.1中碱基序列。其是从栉孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA序列，该序列全长1788bp，包括1527bp的开放阅读框，编码509个氨基酸，5’非编码区长97bp，3’非编码区长164bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在栉孔扇贝免疫防御方面发挥着重要作用。利用pET-32a(+)表达载体在大肠杆菌Rosetta-gami表达菌株中重组表达了该蛋白的一个Kazal结构域，表达产物对胰蛋白酶具有明显的抑制活性。当重组蛋白与胰蛋白酶以分子摩尔比为1∶1比例混合时，接近90％的胰蛋白酶活性被抑制。

其编码蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，分子量为52961.68Da，等电点为7.02，其中编码序列的1-22位为信号肽序列，成熟肽分子量为50647.78Da，等电点为7.30，具有12个典型的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构域。每个结构域都能形成3对二硫键，一个α-螺旋结构和3个β-折叠结构。

本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从栉孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码C-末端Kazal型结构域的基因片断并将其克隆到pET32a表达载体中，在大肠杆菌Rosetta-gami中实现了原核体外重组表达。重组产物经His-tag融合蛋白纯化试剂盒MagExtractor His-TagNPK-700(TOYOBO公司)纯化和透析复性后，对胰蛋白酶具有明显的抑制活性。当重组蛋白与胰蛋白酶以分子摩尔比为1∶1比例混合时，接近90％的胰蛋白酶活性被抑制。本发明可为进一步研究栉孔扇贝免疫防御机制提供基础，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育奠定基础，同时为进一步开发医药产品提供了更多的选择。

本发明利用构建的栉孔扇贝cDNA文库，采用RACE技术及体外重组表达技术，对栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI进行了研究，从栉孔扇贝中克隆到丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA序列，该基因具有序列表中所示的序列，并利用原核重组技术表达了具有较强蛋白酶抑制活性的重组蛋白。

附图说明

图示为本发明栉孔扇贝Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂一个结构域的重组蛋白rCfKZSPI对胰蛋白酶的抑制作用图。

具体实施方式

下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实施例1.

一种克隆得到的栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI，具有以下序列(见序列表)

本发明的栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂及其C末端一个kazal结构域的体外重组表达，包括下列步骤：

a)栉孔扇贝总RNA的提取及mRNA的纯化；

b)栉孔扇贝cDNA文库构建；

c)栉孔扇贝cDNA文库EST序列的大规模测定；

d)栉孔扇贝EST序列的同源性分析及丝氨酸蛋白酶抑制剂基因片段的筛选。

e)用基因特异性引物ATGTGGCTGTTGCATGTAATGG和ATGGTAATTGCCCTTGTAGA进行3’和5’RACE克隆得到栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA全长序列。

f)栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂C末端一个Kazal结构域的体外重组表达及其活性分析。

具体操作如下：

1.栉孔扇贝总RNA的提取及mRNA的纯化：将栉孔扇贝注射50μl OD600＝0.4的鳗弧菌暂养12小时后，利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取栉孔扇贝血淋巴中总RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。

2.栉孔扇贝cDNA文库构建：构建cDNA文库的扇贝提取总RNA后，根据ZAP-

Synthesiskit及ZAP-

Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene)试剂盒使用说明书分离纯化mRNA，合成第一链、第二链，补平cDNA末端，连接EcoR I接头并磷酸化，Xho I限制酶消化，获得了两端具有不同粘性末端的完全单向cDNA。将该cDNA片段插入Uni-ZAP XR Vector(lambdaphage，Invetrogen)。经包装，滴度测定和扩增，利用Helper Phage和SOLR菌株从Uni-

XR Vector上体外切割成为质粒文库。

3.栉孔扇贝cDNA文库EST序列的大规模测定：文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MegaBACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*.abi，*.abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*.seq)和质量文件(*.seq.qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95％)且长度大于100bp的序列作为EST数据，具体的操作参照《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。

4.栉孔扇贝EST序列的同源性分析及丝氨酸蛋白酶抑制剂基因片段的筛选：将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，具体的操作参照《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。根据相似性分析结果寻找出与丝氨酸蛋白酶抑制剂基因同源的EST序列。

5.栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长序列的克隆：根据与丝氨酸蛋白酶抑制剂基因同源的EST序列设计基因特异性引物F1(ATGTGGCTGTTGCATGTAATGG)和R1(ATGGTAATTGCCCTTGTAGA)，分别利用载体通用引物T3(AATTAACCCTCACTAAAGGG)、T7(GTAATACGACTCACTATAGGGC)进行3’和5’末端的扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖电泳进行检测，用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌XL1-blue，挑选阳性克隆提取质粒，用载体引物M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)、RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)进行PCR检测，确认插入片段大小后进行序列测定，测得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。

3’端PCR PCR扩增所用体系以及反应条件：

25μl反应体系：

2.5μl 10×PCR buffer

1μl MgCl₂(2.5mM)

2μl dNTP(2.5mM)

1μl引物CfKZSPIF(10pmol/μl)

1μl引物T7 primer(10pmol/μl)

16.3μl of PCR-grade water

0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)

1μl cDNA文库模板

反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中进行，反应条件为：首先94℃预变性5分钟；然后进入下列循环：94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。

5’端PCR扩增所用体系以及反应条件：

25μl反应体系：

2.5μl10×PCR buffer

1μl MgCl₂(2.5mM)

2μl dNTP(2.5mM)

1μl引物CfKZSPIR(10pmol/μl)

1μl引物T3 primer(10pmol/μl)

16.3μl of PCR-grade water

0.2μl(1U)Taq polymerase(Promega)

1μl cDNA模板。

反应在PTC-100 Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中进行，反应条件为：首先94℃预变性5分钟；然后进入下列循环：94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸90秒，共进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。

将3’RACE和5’RACE的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌XL1-blue，挑选阳性克隆提取质粒，送上海鼎安生物科技有限公司测序，测得的序列经CLUSTER分析拼接后得到全长序列。

6.栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的体外重组表达：通过PCR技术，在正向引物(TGGCCACCATCATCATCATCATTGTATATGTCCAAAAATATTGGC)中引入MscI酶切位点(阴影部分所示)及一个6×His的蛋白标签(下划线所示)，在反向引物(AAGCTTTCAACCTCTACAAGGGCAA)中引入Hind III酶切位点(阴影部分所示)扩增丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI中的C端Kazal结构域，反应在PTC-100Programmable Thermal Controller Cycler(MJ Research)中进行，反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。按照《分子克隆第三版》的方法先将其克隆到pMD-18T载体，转化感受态细胞Top10，将阳性克隆扩大培养后提取质粒，MscI-HindIII双酶切后，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)纯化酶切后的目的基因产物，连入同样经MscI-HindIII双酶切过的pET-32a(+)表达载体中，转化大肠杆菌Rosetta-gami，测序确认表达框的正确性。将表达菌株在SOB液体培养基中培养至OD值达到0.6-1.0，加入终浓度为1mM的IPTG诱导4小时，取1ml菌液离心，弃去上清后，加入80μl水和20μl 5X蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。离心保存剩余菌体沉淀，利用His-tag融合蛋白纯化试剂盒MagExtractor His-TagNPK-700(TOYOBO公司)，按照其操作步骤纯化蛋白，SDS-PAGE检测纯化的表达产物。变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、1mM EDTA、50mMTris-HCl、50mM NaCl、10％甘油、1％甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油。复性后的重组产物采用先将重组蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶孵育，再测量剩余酶活的方法，来检测重组Kazal型胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制作用(参考文献：Hergenhahn HG，Aspan A，

K.Purification and characterization of a high-Mr proteinase inhibitor ofprophenol oxidase activation from crayfish plasma.Biochem J 1987；248(1)：223-8)。

实施实例2：重组表达产物在蛋白酶抑制剂药物生产，人类各种相关疾病如胃癌，胰腺癌，肺癌等疾病的治疗，及饲料添加剂的生产中存在的潜在应用。附图说明：图示为本发明栉孔扇贝Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂一个结构域的重组蛋白rCfKZSPI对胰蛋白酶的抑制作用图。

序列表

(1)SEQ ID No.1的信息

序列特征：

长度：1788碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线形

分子类型：DNA

特性名称：CDS(98-1624)

来源：栉孔扇贝(Chlamys farreri)

序列描述：

GGCACGAGGGTCGCTCACAAGTTTGAAGAGTACGAAGCTATTTGTTCGAGTATAAAGTAAGCCTTTGC

TTTACTCAGAACTACATTTGATGTCAGCGATGATGTCAAATATCTTGAGTGTGGTCGGATTGTCACTCA

TTCTAACACCTCTGGTTGTTGAGTGTCAAAAATCCTGTAACGCAACAAGTGGAAGGGTCTGCGGTGC

CAAATTTGTTACAAAGACGTTTAAGAATGAATGTAAAGTTAAAAGGAAGTTCAACGTCATCCATTCTG

GGAAATGTATAGCTGATGATGATTGCGTGTGCCAGCAGGATTACACCCCAGTGTGTGGAGTAGATGGC

AAGACGTACAGCAACGACTGTTTTGCTGGCTGCAAGGGTGTTGCAGTAGCTTGTATCGGGAAATGTC

CATGTGACTGTATCTGTACCCAACAGTTTGATCCCGTATGTGGTGTGGACGGAGAGACATATGGGAAT

GCATGTGTTGCAGGATGTCATGGTGTCGCAATCGACTGTAAAGGGACGTGTCCGTGTCCGTGTATTATT

GACCTACAGTTTAACCCAGTATGTGGCGCGGACAACGTAACCTACAGTAACCCGCGTGCCGCAAAGT

GTGCTAATGTTCCAGTAAATTGCCTTGGTAAATGTCCATGTGAATGTGTTTGTACCCTTCAATACGATCC

TGTTTGTGGAACAGACGGGAAGAATTACGGTAACGAATGCTTCCCAATAAAGTGTCATGGCGTTGGG

GTTGCCTGTAAAGGAAAATGTCCCTGTCCATGTATCTGTACAGCAGATTTTAACCCAGTGTGTGGAGT

GGACGGCAAAACCTACAGTAACAAATGTCTCGCTGGCTGTGCTGGTGTTGATGTGCAGTGTGCAGGT

AAATGTCCGTGTGACTGTATATGTACCTTAGAATACGCTCCTGTTTGTGGAACAGATGGGAACACTTAC

GGTAACGCATGCTTCGCAACAAAGTGTCACGGGGTTGGAATCGAGTGCAAGCAGAAGTGCCCTTGTC

CATGTTTCTGCCCAGCAGTGTTTATCCCGGTATGTGGGGTGGACGGAAAAACATACGGAAATGCATGT

GAAGCAGCTTGTGAGAAAGTACCCGTGGCATGTGCAGGTGAATGTCCCTGTGGATGCGCTTGTACTA

AAGAATATAACCCTGTGTGTGGGTCCGATGGTAACACGTACGGGAACCCATGTATGGCAAAATGTCAA

GGCGTAGCCATACAATGCAAACAAAGGTGTCCCTGTCCTTGTATATGCACGGAGGAGTTCCAACCTGT

CTGTGGTGCTGATGGGGAAACGTATGATAATAAATGTTTCGCAGCTTGCGAGAATGTCCCTGTCGCGT

GTGCCGGTCGATGTCCTTGTAATTGTCATTGCCCAAAAATATACAAACCAGTGTGTGGAAAAAACGGG

GAAACGTATGGAAACGCATGCGTAGCTAAATGTCTAGGCATATCTGTTCGCTGTGAAGGGAAGTGTCC

ATGTCCCTGTATATGTCCAAAAATATTGGCGCCAGTATGTGGTGTAGATGGACAAACGTACGCCAATGA

ATGTCTTGCCAAATGCGAGTATGTGGCTGTTGCATGTAATGGTAATTGCCCTTGTAGAGGTTGACCTAT

ACCAACACATGATCTCAACGCGAGATCCAGGAATCCCAGGGTTCTTGGCGTTCTTATCTTGGGACAAC

AGTTGGAAAATTTGGAATTACATGTAAATTATACAAAATCGCTTATTAAAAATAAACATTTATTTTAATTT

AAAAAAAAAAAAAAAAA

(2)SEQ ID No.2的信息

序列特征：

长度：509个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线形

特性：分子量为52961.68Da，等电点为7.02，其中编码序列的1-22位为信号肽序列，成熟肽分子量为50647.78Da，等电点为7.30，具有12个典型的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构域。每个结构域都能形成3对二硫键，一个α-螺旋结构和3个β-折叠结构。

来源：栉孔扇贝(Chlamys farreri)

序列描述：

MMSNILSVVGLSLILTPLVVECQKSCNATSGRVCGAKFVTKTFKNECKVKRKFNVIHSGKCIADDDCVCQQDYTPVCGVDGKTYSNDCFAGCKGVAVACIGKCPCDCICTQQFDPVCGVDGETYGNACVAGCHGVAIDCKGTCPCPCIIDLQFNPVCGADNVTYSNPRAAKCANVPVNCLGKCPCECVCTLQYDPVCGTDGKNYGNECFPIKCHGVGVACKGKCPCPCICTADFNPVCGVDGKTYSNKCLAGCAGVDVQCAGKCPCDCICTLEYAPVCGTDGNTYGNACFATKCHGVGIECKQKCPCPCFCPAVFIPVCGVDGKTYGNACEAACEKVPVACAGECPCGCACTKEYNPVCGSDGNTYGNPCMAKCQGVAIQCKQRCPCPCICTEEFQPVCGADGETYDNKCFAACENVPVACAGRCPCNCHCPKIYKPVCGKNGETYGNACVAKCLGISVRCEGKCPCPCICPKILAPVCGVDGQTYANECLAKCEYVAVACNGNCPCRG

Claims

1.一种栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，其特征在于：以从栉孔扇贝中克隆得到序列表SEQ ID No.1所示的丝氨酸蛋白酶抑制剂CfKZSPI的cDNA全长序列为模板，正向引物序列为TGGCCACCATCATATCATCATTGTATATGTCCAAAAATATTGGC，反向引物序列为AAGCTTTCAACCTCTACAAGGGCAA，通过PCR扩增，扩增出编码C末端Kazal结构域的基因。

2.一种权利要求1所述的栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的应用，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.1中碱基序列C末端Kazal结构域的基因的重组表达产物用于制备胰蛋白酶类抑制剂药物中的应用。