CN110257397B - 刺参il-17基因、编码蛋白及克隆方法、重组刺参il17基因工程菌构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了刺参IL‑17基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参IL17基因工程菌构建方法和多克隆抗体制备方法，特点是刺参IL‑17基因序列如SEQIDNO.1所示；刺参IL‑17蛋白序列如SEQIDNO.2所示，其去除信号的蛋白序列如SEQID NO.3所示；用分别含有BamHI位点和Xho I位点的引物扩增刺参IL‑17蛋白的去除信号肽部分结构域；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化复性即获得基因工程菌，优点是其表达的重组表达蛋白具有诱导腐皮综合症炎症发生，根据其蛋白序列制备的多克隆抗体具有缓解和修复腐皮综合症创面的作用。

Description

刺参IL-17基因、编码蛋白及克隆方法、重组刺参IL17基因工 程菌构建方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种刺参IL-17基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参IL17基因工程菌构建方法和多克隆抗体制备方法。
背景技术
最初研究认为IL-17（Interleukin-17）是由Th17细胞产生的促炎细胞因子。 然而，随着研究的深入，发现在高等动物中适应性免疫细胞（包括中性粒细胞，自然杀伤细胞，肥大细胞，αβ和γδT细胞）在抵抗细菌或真菌感染过程中，都可以产生大量的IL-17。病原体入侵后，细胞内的微生物传感器激活炎性小体。随后，caspase-1激活产生IL-1β和IL-17。这驱动了IL-17+先天和适应性免疫细胞的形成。IL-17通路通过上调多种细胞因子、趋化因子招募中性粒细胞和产生抗菌肽来对细菌进行杀灭。
近年来研究表明IL-17的活化与特定的皮肤疾病发生密切相关。IL-17作为炎性皮肤病的新兴靶标，在牛皮癣的治疗中取得了显著的成效，同时该细胞因子的在其他疾病中的治疗作用也在不断的进行探索。然而，对IL17生物学功能的研究主要集中在人及其他哺乳动物，在低等脊椎动物和无脊椎动物中的研究相对甚少。而此类炎性物质的出现，不但为临床抗感染治疗提供了新的“武器”，而且为解决针对性的靶向治疗疾病提供了新的思路。因此，深入研究主要水产养殖品种免疫防御机制，这样为解决海水养殖业病害预防，开展健康养殖和实现养殖业可持续发展具有重要意义。
刺参（Apostichopus japanicus），是属于棘皮动物门（Echinodermata）、海参纲（Holothuridea）、循手目（Aspidochirota）的重要经济种类，是一种高蛋白、低脂肪、低糖、无胆固醇的重要经济养殖水产动物。随着养殖规模的不断扩大腐皮综合症成为严重制约了该产业的健康和持续发展的重要因素。目前针对腐皮综合症的治疗主要集中在，对病原微生物的杀灭，改善水质环境以及抗生素的使用，进行缓解。然而，在生产中大量抗生素、水体消毒剂的使用诱导致病菌产生耐药性，对腐皮综合症的缓解作用越来越弱。腐皮综合症作为一种特殊的刺参皮肤病，参考高等动物皮肤病的研究，构建水产动物自身修复基因表达工程菌，进而产业化高产量且价格低廉的生产腐皮病的治疗药物已迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种刺参IL-17基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参IL-17基因工程菌构建方法和多克隆抗体的制备方法，该重组表达的IL-17可以诱导刺参炎症发生，IL-17多克隆抗体处理腐皮综合症海参，腐皮部位可以得到明显的修复。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种刺参IL-17基因，该基因为SEQID NO.1所示的cDNA序列。1168 bp，包括813bp的开放阅读框，编码270个氨基酸，5’非编码区长109 bp，3’非编码区长246 bp。
上述刺参IL-17基因的克隆方法，根据与IL-17基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下：
（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码IL-17基因的EST序列，选取编码刺参IL-17部分片段的EST克隆；
（2）RACE引物设计：根据编码刺参IL-17部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：CTGCGAGGATCTGCAAAATTCG，3’上游特异性引物2：TCAAGTTCCTATCGCATGCGTGTG；扩增3’接头引物outer 3：CTAATACGACTCACTATAGGGC，扩增3’接头引物inner 3：TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT；
（3）RACE扩增获取刺参IL-17基因全长序列，具体步骤如下：
a．总RNA提取：取刺参体腔液，收集体腔细胞制备得到RNA提取液；
b．3’-RACE扩增：以RNA提取液为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物outer3进行PCR 扩增，取PCR产物1 μL作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物inner3进行PCR扩增，得到3’端目的条带；
c．将扩增产物3’端目的条带用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到刺参IL-17基因全长序列，其基因序列如SEQIDNO.1所示。
RACE扩增反应体系及反应条件：RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的接头引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：17.3 μL；扩增条件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10min。
2、上述刺参IL-17基因的编码蛋白，该编码蛋白为SEQID NO.2所示的氨基酸序列。该蛋白分子量为29.52 kDa，等电点为6.24，AjIL17带有一段信号肽（1-23aa）。SMART分析显示，与哺乳动物相似，AjIL17保守IL17家族结构域(190-261aa)。
3、上述刺参IL-17基因的编码蛋白的去除信号肽蛋白，该蛋白为SEQID NO.3所示的氨基酸序列。
4、一种重组刺参IL-17基因工程菌的构建和蛋白纯化方法，步骤如下：设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参IL-17除去信号肽的部分序列，即SEQID NO.3所示的氨基酸序列；将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-IL17；对重组质粒pET28a（+）- IL17进行诱导表达，离心收集菌体，即获得重组刺参IL-17基因工程菌，再进行重组蛋白的纯化复性即获得纯化刺参IL-17蛋白。具体步骤如下：
（1）IL-17除去信号肽部分进行克隆及重组蛋白质粒的构建与表达
a．总RNA提取：取刺参体腔液，收集体腔细胞制备得到RNA提取液；
b．cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参IL-17蛋白去除信号肽的序列，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，其中
含BamH I位点IL-17上游扩增引物：GGATCCTTTGTCGTGAAACCAGTACAGGAAC，
含Not I位点IL-17下游扩增引物：GCGGCCGCTCACCTTCCTGACCGCACATT；
c．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0μL，浓度10 μM的含BamH I位点IL-17上游扩增引物 1.0 μL，浓度10 μM 的含Not I位点IL-17下游扩增引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水17.3 μL ；扩增条件：95℃ 5 min、95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
d．PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e．重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Not I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在700bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-IL17重组质粒；
f．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-IL17，转化到表达宿主ROSETTA(DE3)获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 μg/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物，即为重组刺参IL-17基因工程菌；
（2）重组蛋白的纯化
a．取100 mL细菌沉淀物，加入细菌沉淀物1/10体积的裂解缓冲液重悬离心菌体，加入溶菌酶使其终浓度为0.3 mg/mL，在冰上用玻璃试管进行超声波破碎（有助于散热保持蛋白的活性），280 W，超声5 s停歇10 s，共超声30 min；将超声至澄清的液体转移到新的离心管中，于4℃，12000r/min离心20 min，取上清液；
b．将Ni-NTA SefinoseTMResin和纯化管提前进行平衡，平衡完成后将1 mL Ni-NTASefinoseTMResin与离心后的上清液混合均匀，4℃，20 rpm反转摇床混匀1 h；用2 mL 的洗涤缓冲液洗涤介质两次；用0.2 mL 洗脱缓冲液洗脱4-6次，收集洗脱液，取洗脱液进行SDS-PAGE电泳对每一蛋白条带进行鉴定，获得纯化的重组刺参IL-17去除信号肽蛋白，即为纯化刺参IL-17蛋白。
所述的裂解缓冲液的配方为NaCl 300 mM，NaH2PO4 50 mM，咪唑 10 mM，pH 8.0；所述的洗涤缓冲液的配方为NaCl 300 mM，NaH2PO4 50 mM，咪唑20 mM，pH 8.0；洗脱缓冲液的配方为NaCl 300 mM，NaH2PO4 50 mM，咪唑300 mM，pH 8.0。
5、上述重组刺参IL-17基因的多克隆抗体制备，包括以下步骤：
取上述浓度为1 g/L的纯化重组刺参IL-17蛋白腹腔注射四只四周龄的雌性小鼠制备多克隆抗体，首次进行免疫的抗原量为100 μg/只，第二次和第三次免疫抗原用量为75μg/只，每次免疫之间间隔一周时间；最后给老鼠断粮一天，隔天用摘眼球的方法进行取血，收集的血液放置到冰上，4℃静止过夜后，5000g，离心10min获得抗血清，即得到重组刺参IL-17基因的多克隆抗体，保存在-80℃备用。
6、上述重组刺参IL-17基因工程菌的应用，其表达的重组表达蛋白具有诱导腐皮综合症炎症发生，根据重组刺参IL-17基因工程菌制备的多克隆抗体在制备刺参腐皮综合症创面修复剂或缓解剂方面的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首先公开了刺参IL-17基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参IL-17基因工程菌构建方法和多克隆抗体的制备方法和应用，其利用基因工程技术，通过3’端cDNA快速扩增（3’-RACE）的方法，首次从刺参中克隆得到了IL-17基因cDNA序列，同时对刺参去掉信号肽的蛋白质进行重组质粒的构建和表达，获得了一株具有蛋白诱导活性的基因工程菌（pET28a（+）-IL17），重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有高效的修复腐皮综合症创面的作用，对研制新型高效腐皮综合症治疗药物具有重要价值，可以作为绿色疾病制剂在刺参病害防治中发挥作用。
附图说明
图1为刺参重组杀菌通透性增强蛋白的SDS-PAGE分析，M泳道为蛋白质分子量标准，1为诱导pET-28a 空载；2为未诱导重组蛋白；3为诱导1 h重组蛋白；4为诱导3 h重组蛋白；5为诱导5 h重组蛋白；6 诱导7 h重组蛋白；7诱导表达包涵体和上清重组蛋白；8诱导表达上清中的重组蛋白；9为纯化后上清重组蛋白；
图2为BSA对照30μL（50μg/μL）对稚参炎症及腐皮综合症诱导作用效果图；
图3为刺参重组IL-17 30μL（50μg/μL）蛋白对稚参炎症及腐皮综合症诱导作用效果图；
图4为BSA对照120μL（50μg/μL）对成参炎症及腐皮综合症诱导作用效果图；
图5刺参重组IL-17 120μL（50μg/μL）蛋白对成参炎症及腐皮综合症诱导作用效果图；
图6为IL-17多克隆抗体对腐皮综合症发生的刺参修复效果图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
IL-17基因克隆与序列分析
（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码IL-17基因的EST序列，选取编码刺参IL-17部分片段的EST克隆；
（2）RACE引物设计：根据编码刺参IL-17部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：CTGCGAGGATCTGCAAAATTCG，3’上游特异性引物2：TCAAGTTCCTATCGCATGCGTGTG；扩增3’接头引物outer 3：CTAATACGACTCACTATAGGGC，扩增3’接头引物inner 3：TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT；
（3）RACE扩增获取IL-17基因全长序列，具体步骤如下：
a．总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集体腔细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL， 4℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b．3’-RACE扩增：将上述RNA提取液用SMARTer® RACE 5’/3’ Kit Protocol-At-A-Glance试剂盒（Takara公司）逆转录合成扩增3’的模板，具体合成方法依试剂盒说明书操作，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物outer3进行PCR 扩增，取PCR产物1 μL作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物inner3进行PCR得到3’端目的条带；
c．将上述扩增产物用凝胶回收试剂盒（百泰克）回收，回收产物与载体pMD19-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证并送至上海生工生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到全长序列；
其中，RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的Adaptor 1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：17.3 μL；扩增条件：94 ℃ 5 min、95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
最终得到的刺参IL-17基因cDNA序列如SEQID NO.1所示，该序列全长1168 bp，包括813 bp的开放阅读框，编码270个氨基酸，5’非编码区长109 bp，3’非编码区长246 bp；刺参IL-17基因编码蛋白为SEQID NO.2所示的氨基酸序列。该蛋白分子量为29.52 kDa，等电点为6.24，AjIL17带有一段信号肽（1-23aa）。SMART分析显示，与哺乳动物相似，AjIL17保守IL17家族结构域(190-261aa)。
具体实施例二
重组刺参IL-17基因工程菌的构建方法
1、IL-17基因的克隆及重组蛋白质粒的构建与表达
a、总RNA提取：取刺参体腔液1.0 mL，800 g离心5 min，收集体腔细胞，加入Trizol试剂（购于Takara公司）1.0 mL，震荡混匀，室温放置5 min，再加入0.2 mL氯仿，震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12000 g，离心15 min，吸取上清至离心管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 rpm，离心10 min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1 mL，4℃，12000 rpm，离心5 min，去上清，沉淀静置5-10 min，加20 μL无RNA酶水，得到RNA提取液；
b、cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒（Takara）逆转录合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参编码IL-17去除信号肽部分的序列，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示，其中：
含BamHI位点IL-17上游扩增引物：GGATCCTTTGTCGTGAAACCAGTACAGGAAC
含Not I位点IL-17下游扩增引物：GCGGCCGCTCACCTTCCTGACCGCACATT
c、PCR扩增：cDNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液（含Mg2+ ）2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP2.0 μL，浓度10 μM 的下游引物1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：17.3 μL ；扩增条件：95 ℃ 5min、95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
d、PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒（百泰克）回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T（Takara公司）连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α（Takara公司）后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的阳性克隆质粒；
e、重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BmH I和Not I（Thermo ScientificTM）限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在700bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-IL17重组质粒；
f．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒（Omega公司）纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）-IL17，转化到表达宿主ROSETTA(DE3)（康为世纪公司），获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 μg/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物，即为重组刺参IL-17基因工程菌；
2、重组蛋白的纯化
a．取100 mL细菌沉淀物，加入细菌沉淀物1/10体积的裂解缓冲液（NaCl 300 mM,NaH2PO4 50 mM, imidazole 10 mM, pH 8.0）重悬离心菌体，加入溶菌酶使其终浓度为0.3mg/mL，在冰上用玻璃试管进行超声波破碎（有助于散热保持蛋白的活性），280 W，超声5 s停歇10 s，共超声30 min；将超声至澄清的液体转移到新的离心管中，于4℃，12000r/min离心20 min，取上清液；
b．将Ni-NTA SefinoseTMResin（上海生工，编号：BSP033）和纯化管提前进行平衡，平衡完成后将1 mL Ni-NTA SefinoseTMResin与离心后的上清液混合均匀，4℃，20 rpm反转摇床混匀1 h；用2 mL 的洗涤缓冲液（NaCl 300 mM, NaH2PO4 50 mM, imidazole 20 mM,pH 8.0）洗涤介质两次；用0.2 mL 洗脱缓冲液（NaCl 300 mM,NaH2PO4 50 mM, imidazole300 mM，pH 8.0）洗脱4-6次，收集洗脱液，取洗脱液进行SDS-PAGE电泳对每一蛋白条带进行鉴定，获得纯化的重组刺参IL-17去除信号肽蛋白，即为重组刺参IL-17基因工程菌。用完之后的Ni-NTA SefinoseTMResin，用进行灭菌的双蒸水洗涤两次，然后用20%的乙醇进行保存备用。由图1说明重组AjIL17蛋白可以在原核表达系统成功表达，并经过蛋白纯化后可以获得单一的纯化蛋白条带。
具体实施例三
一种重组刺参IL-17基因的多克隆抗体制备，包括以下步骤：
取浓度为1 g/L的具体实施例二制备的纯化刺参IL-17蛋白腹腔注射四只四周龄的雌性小鼠制备多克隆抗体，首次进行免疫的抗原量为100 μg/只，第二次和第三次免疫抗原用量为75 μg/只，每次免疫之间间隔一周时间；最后给老鼠断粮一天，隔天用摘眼球的方法进行取血，收集的血液放置到冰上，4℃静止过夜后，于5000g，离心10min获得抗血清，即得到重组刺参IL-17基因的多克隆抗体，保存在-80℃备用。
具体实施例四
刺参IL-17重组蛋白的对腐皮综合症及炎症的治疗作用分析
1、分别取大小均匀的10只稚参（30g±5g）暂养于实验室适应养殖环境（温度16℃，盐度30）；对照组稚参注射30μL （50μg/μL）BSA蛋白作为对照，注射4天后海参状态如图2所示，没有出现明显的腐皮现象；实验组稚参注射30μL具体实施例二制备获得的纯化刺参IL-17蛋白（50μg/μL），四天后，处理组海参出现了不同程度的腐皮现象如图3所示。腐皮面积为2.3±0.3 cm2，所有动物实验重复三次。
2、分别取大小均匀的20只健康成参（123±17g）暂养于实验室适应养殖环境（温度16℃，盐度30）。对照组稚参我们注射120μL （50μg/μL）BSA蛋白作为对照，注射4天后海参状态如图4所示，没有出现明显的腐皮现象。实验组用具体实施例二制备获得的纯化刺参IL-17蛋白 120μL （50μg/μL） 蛋白注射稚参四天后，处理组海参出现了不同程度的腐皮现象如图5所示。腐皮面积为5.0±1.3 cm2，所有动物实验重复三次。
3、用稀释的具体实施例三制备获得的IL17抗体（1×105倍）浸泡腐皮海参3天后得到了不同程度得恢复如图6所示。修复后的腐皮面积为1.5±0.5 cm2，所有动物实验重复三次。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 刺参IL-17基因、编码蛋白及克隆方法、重组刺参IL17基因工程菌构建方法和应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1168
<212> DNA
<213> 刺参IL-17基因全长
<400> 1
GATTGAAGAGCGATTTAATTAAAGTCACCAGCAGAGACAAACGAAATAGTCTTATAGTCAGAGCAAAAGGAAAAAAAGAAAAGTTACCGTGAAATATATTAAAGCCATAATGAATATCAGCCAGTTCGTGCACATCTTCGCCACCGGGTTTGTGGTGCTGTTCTCTGTGACGTCAGCGTTTGTCGTGAAACCAGTACAGGAACTAGCGAGTGGCCATTCCAAAGGACAGATATTATCTAACAATATTGTAACTGGTGTAGGGAGCGCTTCATTTATCAAGAGTGTCGAACAACACGACCTTGGTAACCATGTAGTCCCACAGTCATCAGGGTTTCCTGCAGGAGAGGCGGAGGAGGAGGAGAAGACAAAAGACCCGATCGAAGTCCTGTTCGGAGACACCAACTTCCAAGGCGATCAGTCGGTAGAATCTTCTAGGGGCAGTGACGGCGGACACAATGATGGTGGTGCGGACATTGTCAAGCTGGAGAAGAAGGCTCAACTGCATAACGATAGGCCGACACGGGGGGTATTCAACTGCGAGGATCTGCAAAATTCGCTATTAAAAGCTCAAATCTTTGAGACACCACGGTCAGACACACACAAGATATTTCCAAAATACGAGACTGGGCGTACACAAACCTGCCCTACATCATTTATAGGCACGGCAACAAACAGAAGATCAGTCTGTCCTTGGAGTTATCACACAGATTCTGATCCTAACAGGTGTCCTCAGAACATCACCTACGCGAAGTGTCAATGCACCGAGTGCATGGCAAACTCAGGTAGTTGCGAGCCGGTTATGCAAAATAAAGTTGTTCTGATGAAAGACGTTACAGCTGAATCGCAGTACCGGGCTGTTACAATTCAAGTTCCTATCGCATGCGTGTGTTCCCGTTATTCAAATGTGCGGTCAGGAAGGTGATTGGTGCATACAGAGAAACAGAAATTTCTATTTTTCAGATTTTCCTATTTATTAATTAATAACAAGAATTTGTTTTCTTAAAAGATAACTATATATTACTTCACGAAATTCAGGCGATTCTAAAATATTATGCAACTTTATATTATTTTTTACAATAATAAGAAAGAACAAAGAAAAAAAAACTGCTTCAAGACATTCCGTCATATTTCAAGTGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1168
<210> 2
<211> 270
<212> PRT
<213> 刺参IL-17基因编码蛋白
<400> 2
MNISQFVHIFATGFVVLFSVTSAFVVKPVQELASGHSKGQILSNNIVTGVGSASFIKSVEQHDLGNHVVPQSSGFPAGEAEEEEKTKDPIEVLFGDTNFQGDQSVESSRGSDGGHNDGGADIVKLEKKAQLHNDRPTRGVFNCEDLQNSLLKAQIFETPRSDTHKIFPKYETGRTQTCPTSFIGTATNRRSVCPWSYHTDSDPNRCPQNITYAKCQCTECMANSGSCEPVMQNKVVLMKDVTAESQYRAVTIQVPIACVCSRYS NVRSGR 270
<210> 3
<211> 247
<212> PRT
<213> 刺参IL-17基因编码蛋白的去除信号肽蛋白
<400> 3
FVVKPVQELASGHSKGQILSNNIVTGVGSASFIKSVEQHDLGNHVVPQSSGFPAGEAEEEEKTKDPIEVLFGDTNFQGDQSVESSRGSDGGHNDGGADIVKLEKKAQLHNDRPTRGVFNCEDLQNSLLKAQIFETPRSDTHKIFPKYETGRTQTCPTSFIGTATNRRSVCPWSYHTDSDPNRCPQNITYAKCQCTECMANSGSCEPVMQNKVVLMKDVTAESQYRAVTIQVPIACVCSRYS NVRSGR 247
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 3’上游特异性引物1
<400> 4
CTGCGAGGATCTGCAAAATTCG 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 3’上游特异性引物2
<400> 5
TCAAGTTCCTATCGCATGCGTGTG 24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 扩增3’接头引物outer3
<400> 6
CTAATACGACTCACTATAGGGC 22
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 扩增3’接头引物inner3
<400> 7
TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 44
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 含有BamH I位点IL-17上游扩增引物
<400> 8
GGATCCTTTGTCGTGAAACCAGTACAGGAAC 31
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 含有Xho I位点IL-17下游扩增引物
<400> 9
GCGGCCGCTCACCTTCCTGACCGCACATT 29

Claims (10)

1.一种刺参IL-17基因，其特征在于：该基因为SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。
2.一种权利要求1所述的刺参IL-17基因的克隆方法，其特征在于：根据与IL-17基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下：
（1）通过对腐皮综合症发病刺参和健康刺参体腔细胞高通量转录组测序和表达谱分析，发现了多条编码IL-17基因的EST序列，选取编码刺参IL-17部分片段的EST克隆；
（2）RACE引物设计：根据编码刺参IL-17部分片段的EST克隆设计RACE的巢式引物：3’上游特异性引物1：CTGCGAGGATCTGCAAAATTCG，3’上游特异性引物2：TCAAGTTCCTATCGCATGCGTGTG；扩增3’接头引物outer 3：CTAATACGACTCACTATAGGGC，扩增3’接头引物inner 3：TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT；
（3）RACE扩增获取刺参IL-17基因全长序列，具体步骤如下：
a．总RNA提取：取刺参体腔液，收集体腔细胞制备得到RNA提取液；
b．3’-RACE扩增：以RNA提取液为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物outer3进行PCR 扩增，取PCR产物1 μL作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物inner3进行PCR扩增，得到3’端目的条带；
c．将扩增产物3’端目的条带用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到刺参IL-17基因全长序列，其基因序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求2所述的一种刺参IL-17基因的克隆方法，其特征在于RACE扩增反应体系及反应条件：RACE扩增反应体系及反应条件：模板1.0 μL，10×PCR含Mg2+缓冲液2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的特异性引物1.0 μL，浓度10 μM的接头引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水：17.3 μL；扩增条件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
4.一种权利要求1所述的刺参IL-17基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
5.一种权利要求4所述的刺参IL-17基因的编码蛋白的去除信号肽蛋白，其特征在于该蛋白为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
6.一种重组刺参IL-17基因工程菌的构建和蛋白纯化方法，其特征在于步骤如下：设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和Not I位点的引物扩增刺参IL-17除去信号肽的部分序列，即SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）-IL17；对重组质粒pET28a（+）- IL17进行诱导表达，离心收集菌体，即获得重组刺参IL-17基因工程菌，再进行重组蛋白的纯化复性即获得纯化刺参IL-17蛋白。
7.根据权利要求6所述的一种重组刺参IL-17基因工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）IL-17除去信号肽部分进行克隆及重组蛋白质粒的构建与表达
a．总RNA提取：取刺参体腔液，收集体腔细胞制备得到RNA提取液；
b．cDNA合成：将上述RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用分别含有BamH I位点和Not I位点的引物扩增刺参IL-17蛋白去除信号肽的序列，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，其中
含BamH I位点IL-17上游扩增引物：GGATCCTTTGTCGTGAAACCAGTACAGGAAC，
含Not I位点IL-17下游扩增引物：GCGGCCGCTCACCTTCCTGACCGCACATT；
c．PCR扩增：cDNA 1.0 μL，含Mg2+的10×PCR缓冲液2.5 μL，浓度2.5 mM的dNTP 2.0 μL，浓度10 μM的含BamH I位点IL-17上游扩增引物 1.0 μL，浓度10 μM 的含Not I位点IL-17下游扩增引物 1.0 μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2 μL，超纯水17.3 μL ；扩增条件：95 ℃5 min、95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；
d．PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50 μg/mL的LB平板培养基中培养8-12 h，挑取阳性克隆菌落，进行RCR验证和测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒；
e．重组质粒：将PCR阳性克隆质粒用BamH I和Not I限制性内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收分子量在700bp的目的条带，与经同样酶切的pET28（a）原核表达载体酶切产物连接，转化Escherichia coli DH5α，PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的表达载体pET28（a）-IL17重组质粒；
f．重组蛋白的表达：利用质粒提取试剂盒纯化阳性菌株重组质粒pET28（a）- IL17，转化到表达宿主ROSETTA(DE3)获得的阳性菌株，将阳性菌株再接种到卡那霉素浓度为50 μg/mL的LB培养液中，37 ℃、200r/min振荡培养至菌液OD600的值为0.4-0.6时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达3-6 h，收集菌液，经12000r/min离心5 min，弃上清液，获得细菌沉淀物，即为重组刺参IL-17基因工程菌；
（2）重组蛋白的纯化
a．取100 mL细菌沉淀物，加入细菌沉淀物1/10体积的裂解缓冲液重悬离心菌体，加入溶菌酶使其终浓度为0.3 mg/mL，在冰上用玻璃试管进行超声波破碎，280 W，超声5 s停歇10 s，共超声30 min；将超声至澄清的液体转移到新的离心管中，于4℃，12000r/min离心20min，取上清液；
b．将Ni-NTA SefinoseTMResin和纯化管提前进行平衡，平衡完成后将1 mL Ni-NTASefinoseTMResin与离心后的上清液混合均匀，4℃，20 rpm反转摇床混匀1 h；用2 mL 的洗涤缓冲液洗涤介质两次；用0.2 mL 洗脱缓冲液洗脱4-6次，收集洗脱液，取洗脱液进行SDS-PAGE电泳对每一蛋白条带进行鉴定，获得纯化的重组刺参IL-17去除信号肽蛋白，即为纯化刺参IL-17蛋白。
8.根据权利要求7所述的一种重组刺参IL-17基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的裂解缓冲液的配方为NaCl 300 mM，NaH2PO4 50 mM，咪唑 10 mM，pH 8.0；所述的洗涤缓冲液的配方为NaCl 300 mM，NaH2PO4 50 mM，咪唑20 mM，pH 8.0；所述的洗脱缓冲液的配方为NaCl 300 mM，NaH2PO4 50 mM，咪唑300 mM，pH 8.0。
9.一种根据权利要求6-8中任一项所述方法制备得到的重组刺参IL-17基因的多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：取浓度为1 g/L的纯化刺参IL-17蛋白腹腔注射四只四周龄的雌性小鼠制备多克隆抗体，首次进行免疫的抗原量为100 μg/只，第二次和第三次免疫抗原用量为75 μg/只，每次免疫之间间隔一周时间；最后给老鼠断粮一天，隔天用摘眼球的方法进行取血，收集的血液放置到冰上，4℃静止过夜后，5000g，离心10min获得抗血清，即得到重组刺参IL-17基因的多克隆抗体，保存在-80℃备用。
10.一种根据权利要求6-7中任一项所述方法制备得到的重组刺参IL-17基因工程菌的应用，其特征在于：根据重组刺参IL-17基因工程菌制备的多克隆抗体在制备刺参腐皮综合症创面修复剂或缓解剂方面的应用。
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