CN102191213B

CN102191213B - 一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102191213B
Application number: CN201110093484A
Authority: CN
Inventors: 危宏平; 赵金凤; 王殿冰; 张治平; 张先恩
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2011-04-14
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2031-04-14
Also published as: CN102191213A

Abstract

本发明一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法和应用，包括步骤：1. 突变酶突变位点的引入：2．鉴定重组质粒；3．测序，获得带有1060位突变位点的PCR片段；4．经胶回收纯化后，用限制性内切酶，获得大肠杆菌；5．鉴定重组质粒，得到一种分离的蛋白基因；6．培养大肠杆菌；7．将重组质粒转化BL21感受态细胞，得到表达突变酶的菌株；8．将上述获得的BL21表达菌株培养；9．将5蛋白的菌液离心，再通过超声破碎，离心获取上清；10．测定，获得有高热稳定性又有高酶活的萤火虫荧光素酶。一种萤火虫荧光素酶的基因在食品、医药、菌体检测上的应用。该突变酶的发光强度是野生型的15-20倍左右，并且较野生型具有良好的热稳定性。

Description

一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子酶学与生物技术，更具体涉及一种高热稳定性及高酶活萤火虫荧光素酶的编码基因，同时涉及该突变株编码基因的制备方法。该突变基因编码的高热稳定性及高酶活萤火虫荧光素酶突变株蛋白的用途，萤火虫荧光素酶的编码基因可以广泛应用于食品、医药及生物等领域。

技术背景

荧光素酶是现今生物领域中最重要的工具酶之一，北美萤火虫荧光素酶是其中应用较广泛的荧光素酶，其由于不需要激发光源，发光能量主要来自化学反应并且发光可持续一定的时间得到科研，医药及食品行业的青睐。

在科研领域，萤火虫荧光素酶较突出的应用在于它可以作为报告基因来使用。其内源性低，哺乳动物无内源性表达；荧光素酶检测不受其他物质的影响；采用发光检测，简单易操作；并且检测灵敏度高，检测范围广。还可用于细胞增殖，细胞毒性检测等其他方面的应用。

在医药行业，特别是在做新型药物筛选方面，很多公司都采用萤火虫荧光素酶来筛选新型药物，可以实现快速，便捷，高通量的筛选，大大提高了工作效率，节省了时间，对于新药物的筛选有着很大的贡献。

在食品卫生行业，萤火虫荧光素酶同样有着重要的作用。由于萤火虫荧光素酶其中一个底物是ATP，而ATP是细胞能量的直接来源，存在于从微生物到高等动植物细胞的所有生物体中，通过ATP的测定可以直接反应细胞或微生物的含量。2005年，卫生部发布的《卫生监督机构建设指导意见》中规定省、市、县三级卫生监督机构必须配备ATP荧光检测仪，用于食品卫生和医疗卫生的现场检测。

虽然萤火虫荧光素酶存在着重要的应用价值，但由于该酶自身存在的热稳定性差，抗蛋白酶降解功能较差的缺陷，故有很多针对提高萤火虫荧光素酶稳定性或酶活方面的改造，以期更好的发挥和实现萤火虫荧光素酶的功能和作用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种萤火虫荧光素酶的编码基因，具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列编码的突变体酶，该突变酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。在北美萤火虫firefly luciferase基因中通过overlap PCR引入突变，连接于表达载体，生产高热稳定性及高酶活特性的FIREFLYLUCIFERASE突变酶，该突变酶的发光强度是野生型的15-20倍左右，并且较野生型具有良好的热稳定性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白的制备方法，该方法是构建原核表达载体，利用亲和层析方法纯化高酶活高热稳定性的萤火虫荧光素酶，该方法简单易行，操作简便，成本低廉。

本发明还有一个目的是在于提供了一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白在食品、医药上的应用，其中一个比较重要的应用就是利用该突变酶在菌体检测中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的一个目的是提供一种核苷酸序列，该序列编码一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征是在野生型firefly luciferase基因上具有1060位由G突变为A，1267位由A突变为T，1307位由A突变为G，1589位由T突变为G的4个点突变。

一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白的编码基因的制备方法，其步骤是：

1.突变酶FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R突变位点的引入：

(1)设计两组诱变引物，采用overlap-PCR的方法将实验室购买的Promega公司的pGL3-Basic Vector质粒上的野生型firefly luciferase(源于北美萤火虫)基因1060位由G突变为A，1267位由A突变为T，1307位由A突变为G，1589位由T突变为G；其中第一次用一组诱变引物引入1267位，1307位及1589位的突变；

(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，通过购买的Promega公司的pGEMT-vector试剂盒连接载体，将连接产物pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得DH5α-pGEMT-fireflyluciferase-I423L，D436G，L530R；

2.鉴定重组质粒pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R：将上述转化获得的菌经过培养后用OMEGA公司的质粒抽提试剂盒提取质粒pGEMT-fireflyluciferase-I423L，D436G，L530R，通过酶切进行鉴定，并测序检验，待测序验证正确后再进行下一轮突变位点的引入；

3.以测序正确的pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R质粒为模板，再通过overlap-PCR的分子生物学方法(是一种技术方法)获得带有1060位突变位点的PCR片段；

4.将PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶XhoI及EcoRI进行酶切，经过相同酶切的质粒pET28a(实验室保存，最早购自Invitrogen公司)片段连接后，转化实验室自己制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5α-pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R；

5.鉴定重组质粒pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R：将上述转化获得的菌经过培养后用OMEGA公司的质粒抽提试剂盒提取质粒pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R用酶切的方法进行鉴定，并测序验证，由此得到一种改造的高热稳定性及高酶活性突变株蛋白编码基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明所述的编码高热稳定性及高酶活萤火虫荧光素酶突变株蛋白的基因firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，有以下特征：

1.本发明所用的firefly luciferase基因来自北美萤火虫，长度为1650bp。

2.具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，与野生型相比在此结构基因上具有4处点突变，即1060位由G突变为A，1267位由A突变为T，1307位由A突变为G，1589位由T突变为G。

本发明要求保护的高热稳定性及高酶活萤火虫荧光素酶突变株蛋白可用如下方法生产。该方法包括：以下具体的操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三版)【J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京：科学出版社】中所述的条件进行。

(1)设计两组诱变引物，采用overlap-PCR的方法将野生型firefly luciferase基因上1060位由G突变为A，1267位由A突变为T，1307位由A突变为G，1589位由T突变为G；其中第一次用一组诱变引物引入1267位，1307位及1589位的突变；

(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，通过购自Promega公司的pGEMT-vector试剂盒连接载体，转化实验室自己制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得DH5α-pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R；

3.以测序正确的pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R质粒为模板，再通过overlap-PCR的方法(一种实验方法)获得带有1060位突变位点的PCR片段；

4.将PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶XhoI及EcoRI进行酶切，与经过相同酶切的质粒pET28a(实验室保存，购自Invitrogen公司)片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(实验室自己制备)，获得大肠杆菌菌株DH5α-pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R；

5.鉴定重组质粒pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R：用酶切的方法进行鉴定，并测序验证，由此得到一种改造的蛋白基因，一种分离的高热稳定性及高酶活性突变株蛋白编码基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

6.培养大肠杆菌DH5α-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R，提取重组质粒pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R；

7.将重组质粒pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R转化BL21(DE3)感受态细胞，得到可以表达突变酶FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R的菌株；

8.将上述获得的BL21(DE3)表达菌株进行放大培养，按照1∶100的转接比例将其转入到500ml的LB液体培养基中，同时按照1∶1000的比例添加卡纳抗生素(原液浓度为50mg/ml)，于37℃摇床培养至对数生长期后添加诱导物IPTG至终浓度为0.5mM，于16℃低温摇床诱导过夜；

9.将500ml表达蛋白的菌液4℃，8000rpm离心8min进行集菌，再通过超声破碎，离心获取上清，通过亲和层析使用GE Healthcare的AKATApurifier蛋白纯化仪及GE Healthcare公司的HisTrap FF crude columns进行柱纯化，由此得到一种改造的蛋白，一种分离的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，即高热稳定性及高酶活的萤火虫荧光素酶突变株蛋白；

10.用Pierce公司生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度的测定，以BSA作标准曲线。蛋白定量后配制0.1mg/ml的蛋白液，以Promega公司的E1500荧光素酶检测试剂盒进行发光测定，测定体系为10ul 0.1mg/ml的蛋白液，30ul pH7.4、50mMTris-Hcl、10mM MgCl₂的缓冲液以及10ul的底物混合液，使用Promega测定发光的仪器

20/20Luminometer进行发光测定。

按照以上方法可以检验本发明要求保护的突变酶的活性。纯度检测可以用SDS-PAGE方法检测。

注：以上提到的LB培养基配方如下：

LB培养基(L^-1)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g。

本发明获得的高热稳定性及高酶活性的萤火虫荧光素酶突变株蛋白在食品，医药及生物相关领域有着广泛的应用。

萤火虫荧光素酶在环境微生物检测中的作用：主要可以用于食品中微生物的残留，餐具洁净度，消毒效果的检测以及水中微生物含量等的测定。具体方法是，配置一系列的ATP标准品，利用底物反应液荧光素和萤火虫荧光素酶测定以ATP为唯一变量的标准曲线，再将待测定的样品经过裂解液的裂解释放待测样本中菌体的ATP，使其与配制好的检测工作液，即荧光素、萤火虫荧光素酶和缓冲液进行反应，根据标准曲线可以测得样本中ATP的含量，而ATP存在于所有的生物体内，可以作为生物体量的一个标准，从而获知样本中微生物的含量。

萤火虫荧光素酶有着较为广泛的应用，在食品工业中可用于快速检测菌体数是否达标；在医药行业中可以用于分子影像，医学诊断；在生物领域中，可以用于细胞内报告基因及其他方面的研究。

所述表达载体pET-28a和感受态细胞DH5α及BL21(DE3)(均为实验室保存，PET28a质粒最早购自Invitrogen)。所述的重组质粒pET28a-fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R为本发明所构建。所述的大肠杆菌菌株DH5α-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R是具有质粒pET28a-fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R的大肠杆菌菌株，保藏编号：CCTCCNO.M2011062，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2011.3.14，分类命名：Escherichia coli DH5α-fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R。所述的编码基因fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R是具有SEQUENCE NO.1的核苷酸序列的高热稳定性及高酶活特性的萤火虫荧光素酶突变株蛋白编码基因。所述的蛋白FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R是具有SEQUENCE NO.2的氨基酸序列的高热稳定性及高酶活特性的萤火虫荧光素酶突变株蛋白。

上面所述的菌株均为实验室常用工程菌株，均为大肠杆菌，大小在0.4-0.7*1-3um，没有芽孢，有普通菌毛与性菌毛，为革兰氏阴性杆菌。大肠杆菌的合成代谢能力很强，最适生长温度为37℃，为兼性厌氧菌，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用LB培养基pH为7.0-7.5。其中DH5α为克隆菌株，用于质粒的有效扩增，BL21(DE3)为表达菌株，待其生长到对数期后添加诱导物IPTG后可进行目的蛋白的诱导表达。

本发明的优点和效果：

本发明提供的FIREFLY LUCIFERASE突变株的核苷酸序列和蛋白质序列是一种FIREFLY LUCIFERASE高热稳定性及高酶活特性突变株的基因和蛋白质序列，未见报道。本株FIREFLY LUCIFERASE突变株发光能力是野生型酶的20倍左右，并且具有很好的热稳定性，符合实际应用的要求。萤火虫荧光素酶在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用，是一种重要的工具酶，在同等条件下，高酶活的萤火虫荧光素酶可以有效减低同一反应所需要的酶量，节约成本；同时，高热稳定性的萤火虫荧光素酶可以更好的满足它的实际需要，可以用于30℃以上的实际运用，比如用于生物传感器需要很好的稳定性，而野生型的萤火虫荧光素酶不能很好的满足这样的应用。

附图说明

图1为一种重组质粒的构建示意图

(1)用OMEGA公司的提质粒试剂盒抽提实验室保存有firefly luciferase基因的质粒，用作后面overlap-PCR的模板；

(2)设计两组诱变引物，第一组诱变引物通过overlap-PCR用来引入1267位，1307位及1589位的突变；

(3)上述PCR产物经胶回收纯化后，通过pGEMT-vector试剂盒连接T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得DH5α-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R；

(4)鉴定重组质粒pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R：通过酶切进行鉴定，并测序检验，待测序验证正确后再进行下一轮突变位点的引入；

(5)以测序正确的pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R质粒为模板，再通过overlap-PCR的方法获得带有1060位突变位点的PCR片段；

(6)将PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶XhoI及EcoRI进行酶切，与经过相同酶切的质粒pET-28a片段连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得大肠杆菌菌株DH5α-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R。

图2为一种重组质粒的酶切鉴定，其中图2(a)是重组质粒pGEMT-fireflyluciferase-I423L，D436G，L530R的酶切鉴定结果；图2(b)是重组质粒pET28a-fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R的酶切鉴定结果(1％琼脂糖凝胶电泳)。

如图2(a)所示，使用酶切位点NcoI，NdeI进行重组质粒pGEMT-fireflyluciferase-I423L，D436G，L530R，获得两条片段，其中一条是与firefly luciferase基因大小1650bp相对应，另一条为pGEMT载体的线性大小；图2(b)所示的为第二轮overlap-PCR构建的重组质粒的鉴定，使用的酶切位点为EcoRI和XhoI，同样鉴定出阳性克隆，获得最终所要的pET28a-fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R重组表达载体。鉴定所用的酶切位点均为基因firefly luciferase上所不存在的。

图3为一种纯化后的BL21(DE3)菌株诱导表达产生的高热稳定性及高酶活性的突变株蛋白(10％SDS-PAGE胶电泳检测)示意图

萤火虫荧光素酶分子量约为61KD，与电泳所示结果相符。

图4为一种与野生型的发光强度比较示意图

利用Promega公司的E1500Luciferase Assay System进行荧光测定，比较经过改造的萤火虫荧光素酶与野生型的萤火虫荧光素酶的发光强度。测定体系为50ul，其中包括0.1mg/ml的蛋白酶10ul、Luciferase Assay System不同梯度的底物10ul、30ul pH 7.4的Tris-Hcl缓冲液，测定仪器为

20/20Luminometer，根据测得结果可以判断，改造的萤火虫荧光素酶发光强度提高了20倍左右。

图5(a)为一种与野生型的不同水浴温度下的热稳定性比较示意图将野生型萤火虫荧光素酶与改造的荧光素酶分别在25℃，30℃，35℃，40℃水浴锅中水浴20min后置于冰上，待冷却后同等条件下测定水浴后的荧光素酶发光情况，与水浴前的发光强度进行比较。野生型的在40℃水浴后发光强度降至原来的10％不到，而改造型的还可以有50％左右的发光强度。

图5(b)为一种与野生型37℃水浴不同时间后的热稳定性比较示意图将野生型萤火虫荧光素酶与改造的荧光素酶分别在37℃水浴锅中水浴5min，10min，15min，20min后置于冰上，待冷却后同等条件下测定荧光素酶的发光情况，与水浴前的发光强度进行比较。野生型在5min后发光强度降至原来的20％左右，随着水浴时间的加长，发光性能几乎散失，而改造型的在水浴20min以后还可以保有超过50％的发光强度，这对荧光素酶可以用于固相免疫分析等有着重要意义。

具体实施方式

实施例1一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白的编码基因的制备方法，其步骤是：

1.PCR模板的制备

将实验室现有的保存购自Promega公司的带有firefly luciferase基因的pGL3-Basic Vector质粒大肠杆菌菌株于固体LB活化，挑取单克隆于5mlLB液体培养基中37℃摇床培养后，用OMEGA公司的质粒提取试剂盒抽提质粒，用作PCR的模板。

2.Overlap PCR扩增获得含有4个点突变的firefly luciferase片段

(1)设计两组诱变引物(诱变引物见表1)，以第一组诱变引物A1，B1，C1，D1按照如下条件进行扩增：以野生型荧光素酶基因为模板，引物A1，B1扩增片段A1B1，按照94℃ 10min；94℃ 1min，63℃ 1min，72℃ 1min25sec，30个循环；72℃ 10min的扩增条件。引物C1，D1扩增片段C1D1，按照94℃ 10min；94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 30sec，30个循环；72℃ 10min的扩增条件，PCR扩增产物经1％(质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。

将回收的两种PCR产物A1B1和C1D1等摩尔比混合，加入上、下游引物A1，D1进行第二次PCR，PCR反应条件为：94℃ 10min；94℃ 1min，56℃ 45sec，72℃ 1min25sec，5个循环；94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min35sec，30个循环；72℃ 10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。得到含有突变位点I423L，D436G，L530R的萤火虫荧光素酶基因片段；

(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，通过pGEMT-vector试剂盒与T载体于16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用氨苄青霉素(Amp)-LB平板筛选得到阳性菌落，经过鉴定(见下一步骤)，命名为大肠杆菌DH5α-fireflyluciferase-I423L，D436G，L530R；

(3)鉴定重组质粒pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R：用OMEGA公司的质粒提取试剂盒抽提质粒pGEMT-E354K，I423L，D436G，L530R，用限制性内切酶NcoI和NdeI进行双酶切鉴定，1％琼脂糖胶电泳检查，结果产生约1.7Kb和3Kb大小的两条带，如图2(a)，与预期大小相符。

质粒上firefly luciferase-I423L，D436G，L530R基因的测序由华大基因生物技术有限公司进行。测序引物是利用购自Promega公司的质粒pGEMT上的通用引物5’M13F/T7和3’SP6/M13R，测序结果表明获得的fireflyluciferase-I423L，D436G，L530R基因序列与预期设计完全一致；

(4)以测序正确的pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R质粒为模板，以第二组诱变引物A2，B2，C2，D2按照如下条件进行扩增：以pGEMT-fireflyluciferase-I423L，D436G，L530R质粒为模板，引物A2，B2扩增片段A2B2，按照94℃ 10min；94℃ 1min，58.5℃ 1min，72℃ 55sec，30个循环；72℃ 10min的扩增条件，引物C2，D2扩增片段C2D2，扩增条件同片段A2B2。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。

将回收的两种PCR产物A2B2和C2D2混合，加入上、下游引物A2，D2进行第二次PCR，PCR反应条件为：94℃ 10min；94℃ 1min，55℃ 45sec，72℃50sec，5个循环；94℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min35sec，30个循环；72℃ 10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。得到含有突变位点E354K，I423L，D436G，L530R的萤火虫荧光素酶基因片段。

(5)将PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶XhoI及EcoRI进行酶切，与经过相同酶切的质粒pET-28a片段16℃过夜连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于带有卡纳抗性(Kan)的LB平板上筛选阳性克隆，经过鉴定(见下一步骤)获得大肠杆菌菌株DH5α-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R；

(6)鉴定重组质粒pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R：用OMEGA质粒提取试剂盒抽提质粒pET28a-E354K，I423L，D436G，L530R，用限制性内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切鉴定，1％琼脂糖胶电泳检查，结果产生约1.7Kb和5.4Kb大小的两条带，如图2(b)，与预期大小相符。

质粒上firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R基因的测序由北京六合华大基因科技股份有限公司武汉分公司进行。测序引物是利用针对pET-28a质粒上的通用引物5’T7和3’T7ter(由测序公司提供)，测序结果表明获得的fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R基因序列与预期设计完全一致，由此得到具有SEQ ID NO.1所示序列的高热稳定性及高酶活性编码基因fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R基因全长1650(不包括终止密码TAA)，编码550个氨基酸的蛋白。将产生的质粒命名为pET28a-fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R。

表1：用于构建带有4个突变位点的firefly luciferase基因的引物序列

Primer	Sequence
		A1	ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGG
B1	GCCAACGATGAAGAAGTGTTCGTCTTCGTCCCAGTAAGCTAAGTCTCCAGAATGTAGC
		C1	GGAGACTTAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGGCCGCCTGAAGTC
D1	CACGGCGATCTTTCCGCCCTTCTTGGCCTTTATGAGGATCTCTCTGATTTTTCTTGCGTCGCGTTTTC
		A2	CCGGAATTCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGG
B2	GGTTTATCATCCCCCTTGGGTGTAATCAGAAT
		C2	ATTCTGATTACACCCAAGGGGGATGATAAACC
D2	CCGCTCGAGTTACACGGCGATCTTTCCGCCC

3.突变株蛋白FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R的诱导将上述经测序正确的菌株的质粒pET28a-fireflyluciferase-E354K，I423L，D436G，L530R转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于带有卡纳抗生素(Kan)抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养；挑取单克隆BL21-pET28a-firefly luciferase-E354K，I423L，D436G，L530R于新鲜的5ml试管液体LB培养基(添加卡纳抗生素)中于37℃摇床进行过夜培养；将培养物按照1∶100的转接比例转接至500ml新鲜的液体LB培养基中(添加卡纳抗生素)37℃摇床培养至OD600＝0.4-0.6时添加诱导物IPTG至终浓度为0.5mM，于摇床16℃诱导12小时。

4.蛋白FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R的纯化：

将500ml的培养物于冷冻离心机4℃，8000rpm离心集菌；用20mM咪唑，500mM的氯化钠，20mM的Tris-Hcl配制的pH值7.8的Binding Buffer悬浮菌体，超声破碎；10000rpm，4℃离心后收集上清，并用0.45um的滤膜过滤上清制备好待上样品。

蛋白质的纯化采用AKTAprime蛋白纯化仪及GE Healthcare公司的HisTrap FFcrude columns进行，柱子用上述的Binding Buffer平衡，上样后，分别用含有20mM，40mM，80mM，150mM，250mM咪唑的Tris-Hcl缓冲液进行梯度洗脱，通过核酸蛋白质检测仪(波长280nm)监视，最后收集250mM洗脱下来的峰，将收集的蛋白取样进行SDS-PAGE电泳，检查是否有纯化到目的蛋白以及纯化出来的蛋白的纯度，如图3所示，纯化到了所要的目的蛋白且纯度较高，由此得到分离纯化的如SEQUENCE NO.2所示的高热稳定性及高酶活性的突变株蛋白FIREFLYLUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R。

5.纯化出的蛋白换液处理：

将纯化的蛋白用超滤管于4℃离心机3700rpm离心浓缩蛋白液；将浓缩的蛋白液更换pH7.4，50mMTris-Hcl，10mM MgCl₂的缓冲液除去咪唑，更换2-3次，最后获得约1ml的目的蛋白液。

实施例2：突变株蛋白FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R活性检测及其他酶学性质检测。

发光强度分析：

用Pierce公司生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度的测定，以BSA作标准曲线。蛋白定量后配制0.1mg/ml的蛋白液，以Promega公司的E1500荧光素酶检测试剂盒进行发光测定，测定体系为10ul 0.1mg/ml的蛋白液，30ul pH7.4，50mMTris-Hcl，10mM MgCl₂的缓冲液以及10ul的底物混合液。使用Promega公司的20/20Luminometer进行测定，如图4所示，在同等条件下，改造后获得的蛋白酶FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R比野生型的FIREFLY LUCIFERASE发光强度在底物稀释100倍及1000倍时提高了20倍左右，从而反应了酶活的提高。

热稳定性分析：

催化活性提高的突变体有时会伴随热稳定性的降低，同等测定条件下，将野生型和突变株酶液分别置于25℃，30℃，35℃，40℃水浴锅中水浴20min后置于冰上，待冷却后进行发光测定，如图5(a)所示，野生型和突变型蛋白酶的发光强度都随着水浴温度的升高而降低，野生型在40℃水浴20min后酶活性几乎散失，发光强度很弱，但是突变株蛋白却可以保持50％左右的发光强度。同时，还测定了同一水浴温度下水浴不同时间后蛋白酶的发光情况，如图5(b)所示，在同等测定条件下，野生型荧光素酶在37℃水浴5min后发光强度降到原来的20％左右，时间越久，发光强度越弱，但突变株蛋白荧光素酶即使在37℃水浴20min以后还可以保有50％以上的发光强度。这说明改造后获得的突变株蛋白酶FIREFLYLUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R较野生型蛋白酶具有很好的热稳定性，能够满足更多的实际应用需要。

实施例3：萤火虫荧光素酶在细菌总数(包括大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，酵母，沙门氏菌，李斯特菌，霍乱菌等常见的环境和食品污染细菌)检测(即ATP检测)中的应用(一种分离的蛋白在细菌检测中的应用)。

检测原理：ATP存在于从微生物到高等动植物细胞所有的生物体中，是细胞能量的直接来源，当萤火虫荧光素酶反应中其他反应物过量时，ATP的量与发光值线性相关，通过测定一个样品中加入裂解液后的ATP含量变化，可以测定一个样品中细胞或微生物的多少。

用Pierce公司生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度的测定，以BSA作标准曲线。测定蛋白浓度后配制工作反应液，其中D-luciferin和ATP购自sigma公司，反应液中，将稀释好的浓度为3ug/ml的蛋白液与配制好的浓度为3uM的D-luciferin等体积混合，反应条件为Tris-Hcl缓冲液，10mM MgCl2，pH7.4。取上述混合液40ul，分别加入ATP标准液或经过裂解处理的待测样品20ul于反应液中迅速反应置于Promega公司的

20/20Luminometer发光测定仪器，测定其在560nm处的发光情况。根据标准曲线可得待测样品(食品污染或水污染)中ATP的含量。按照该反应条件和体系，改造后的突变酶至少可以检测到终浓度为0.005uM的ATP，比野生型的蛋白酶的最低检测限至少提高20倍。

注：下列图表中图(4)和图(5)中Luc代表野生型的FIREFLY LUCIFERASE，Luc4代表改造后获得的突变株蛋白酶FIREFLYLUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法和应用

<130> 一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1序列表电子文件的软件版本信息

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> 北美萤火虫（Photinus pyralis)

<400> 1

atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatccgct ggaagatgga 60

accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120

gcttttacag atgcacatat cgaggtggac atcacttacg ctgagtactt cgaaatgtcc 180

gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240

tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300

gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgggcatt 360

tcgcagccta ccgtggtgtt cgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420

aaaaagctcc caatcatcca aaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480

tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540

tttgtgccag agtccttcga tagggacaag acaattgcac tgatcatgaa ctcctctgga 600

tctactggtc tgcctaaagg tgtcgctctg cctcatagaa ctgcctgcgt gagattctcg 660

catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720

gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780

cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttc tgaggagcct tcaggattac 840

aagattcaaa gtgcgctgct ggtgccaacc ctattctcct tcttcgccaa aagcactctg 900

attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct 960

aaggaagtcg gggaagcggt tgccaagagg ttccatctgc caggtatcag gcaaggatat 1020

gggctcactg agactacatc agctattctg attacaccca agggggatga taaaccgggc 1080

gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140

acgctgggcg ttaatcaaag aggcgaactg tgtgtgagag gtcctatgat tatgtccggt 1200

tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260

ggagacttag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttggccg cctgaagtct 1320

ctgattaagt acaaaggcta tcaggtggct cccgctgaat tggaatccat cttgctccaa 1380

caccccaaca tcttcgacgc aggtgtcgca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440

cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500

tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560

gaagtaccga aaggtcttac cggaaaacgc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620

aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg 1650

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 北美萤火虫（Photinus pyralis)

<400> 2

Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro

1 7 13

Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

19 25 31

Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu

37 43

Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala

49 55 61

Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val

67 73 79

Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu

85 91

Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg

97 103 109

Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val

115 121 127

Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro

133 139

Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly

145 151 157

Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe

163 169 175

Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile

181 187

Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val

193 199 205

Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp

211 217 223

Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val

229 235

Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu

241 247 253

Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu

259 265 271

Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val

277 283

Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr

289 295 301

Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser

307 313 319

Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile

325 331

Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr

337 343 349

Pro Lys Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe

355 361 367

Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val

373 379

Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly

385 391 397

Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly

403 409 415

Trp Leu His Ser Gly Asp Leu Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe

421 427

Phe Ile Val Gly Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr LysGly Tyr Gln Val

433 439 445

Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Phe

451 457 463

Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro

469 475 481

Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu

487 493

Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg

499 505 511

Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys

517 523 529

Arg Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly

535 541

Gly Lys Ile Ala Val

547

Claims

1.一种大肠杆菌，其特征在于：大肠杆菌（Escherichia coli），其保藏编号为CCTCC NO.M2011062。

2.一种分离的蛋白编码基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.一种分离的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.权利要求3所述的一种分离的蛋白在细菌检测中的应用。