CN114560950A - 一种遗传编码的有机汞荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种遗传编码的有机汞荧光探针及其制备方法和应用，涉及有机汞检测探针领域，旨在提供一种实时特异且可逆性检测细胞和活体水平有机汞的方法，采用的技术方案是，包括多肽B和无机汞离子荧光蛋白探针A，所述无机汞离子荧光蛋白探针A融合于所述多肽B的氨基端或羧基端；所述无机汞离子荧光蛋白探针A和多肽B之间连接有寡肽；所述有机汞荧光探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；通过构建遗传编码的有机汞荧光探针，使该有机汞离子荧光探针可以在体内、体外、亚细胞或原位水平检测有机汞离子；探针蛋白相对较小且易于成熟，其荧光动态变化明显；通过将无机汞离子探针和MerB融合产生的有机汞探针更可以检测活体内有机汞的动态变化。

Description

一种遗传编码的有机汞荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机汞检测探针领域，具体为一种遗传编码的有机汞荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
汞是一种具有全球性影响的有毒物质，它被列为全球性污染物，是除了温室气体外唯一一种对全球范围产生影响的化学物质。
一般人群常常接触到的汞的形态包括金属汞，无机汞化合物和有机汞。前两者入血后会被过氧化氢酶氧化生成汞离子(Hg2+)，可与血浆蛋白结合形成蛋白结合汞；也可和含巯基的小分子化合物结合形成可弥散汞，这两种汞会随血液流动分布到全身各脏器。金属汞蒸气还可经肺、乳汁、汗液等排出，无机汞可由尿排出。二价无机汞离子和一个或多个碳原子共价结合产生有机汞，这会显著提高汞的毒性和脂溶性，它们会对造成神经中枢系统的不可逆损伤，导致临床前肾功能差异，儿童发育延迟和认知改变等，并造成了二十世纪的数起灾难，例如日本的水俣病等。
目前已经开发出很多种方法检测环境中的汞离子，如冷原子吸收分光光度法，试纸比色法和气体速测管法，荧光方法以其高灵敏性、强选择性和可兼容高通量检测的特点而得到研究者们的青睐。无机汞离子特异性的化学染料工具箱非常庞大，但实际上化学染料普遍存在难定位、易泄露等劣势，所以它们很难在细胞和活体中使用。近来基因编码的工具也取得了新进展，Virta等人开发了一种细胞依赖的汞离子检测方法，它利用MerR调控发光蛋白的表达且检测限低至0.1fM，但是该系统只能延时性地检测环境中的汞离子。最早的可直接检测汞离子的蛋白质探针来源于对增强绿色荧光蛋白(EGFP)的改造，引入S205C突变后，探针的绿色荧光会被汞离子淬灭约30％左右。
尽管检测无机汞离子的方法很多，但是目前我们仍然缺乏能够有效检测有机汞的荧光方法。有机汞的弥散性强，且可以通过血胎屏障和血脑屏障，是造成儿童神经发育障碍以及各种微细效应等问题的主要汞离子种类。
现有技术中，无机汞离子探针在EGFP上突变产生了S205C突变，在汞离子影响下发生荧光淬灭，其荧光动态变化小，变化不可逆且干扰很大；并且，利用iFP检测无机汞离子的探针，该探针需要胆绿素(BV)才会产生荧光，因此在不同细胞株，如BV浓度低的细胞表皮细胞或哺乳动物细胞亚细胞器，如线粒体中无法使用；它的不可逆性也限制了在活体上的应用该有机汞离子荧光探针可以在体内、体外、亚细胞或原位水平检测有机汞离子；因此，目前急需发展一种实时特异且可逆性检测细胞和活体水平有机汞的方法。
发明内容
鉴于现有技术中所存在的问题，本发明在现有技术的基础上提供了一种遗传编码的有机汞荧光探针，采用的技术方案是，包括多肽B和无机汞离子荧光蛋白探针A；所述多肽B用于将有机汞催化降解为无机汞离子；所述无机汞离子荧光蛋白探针A对无机汞离子进行表现；所述无机汞离子荧光蛋白探针A融合于所述多肽B的氨基端或羧基端；所述无机汞离子荧光蛋白探针A和多肽B之间连接有寡肽，所述寡肽由柔性氨基酸组成，所述柔性氨基酸的个数为0～30个；所述有机汞荧光探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
作为本发明的一种优选技术方案，所述无机汞离子荧光蛋白探针A选自：
a.来源于绿色荧光蛋白GFP的无机汞离子探针，所述绿色荧光蛋白GFP的无机汞离子探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：1-1；
b.所述柔性氨基酸的个数为0～30个，氨基酸序列为SEQ ID NO：2-1,2,3。
作为本发明的一种优选技术方案，所述多肽B选自：
a.来源于细菌的烷基汞降解酶MerB，所述烷基汞降解酶MerB的氨基酸序列为SEQID NO：3-1；
b.金黄色葡萄球菌的有机汞制剂降解酶，所述有机汞制剂降解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
通过采用上述技术方案，利用多肽B，有助于将环境中的有机汞转化为无机汞；利用无机汞离子荧光蛋白探针A，有助于监测环境中的无机汞含量，以便能够通过与多肽B串联的协同作用对环境或者细胞内的有机汞含量进行监测。
柔性氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；柔性氨基酸的数目优选的是不超过30个，进一步优选的是不超过10个，更优选的是不超过20个。
其中，无机汞离子荧光探针A，优选为来源于绿色荧光蛋白GFP的无机汞离子探针，其序列如SEQ ID NO：1-1所示；更优选来源于绿色荧光蛋白GFP的无机汞离子探针EGFP-S205C，其序列如SEQ ID NO：1-2所示。
对无机汞离子敏感的多肽B，优选为来源于细菌的烷基汞降解酶MerB，其序列如SEQ ID NO：3～4所示；更优选来源于大肠杆菌的烷基汞降解酶MerB，其序列如SEQ ID NO：3～4所示。来源于细菌的Tn21 MerB蛋白或Tn501 MerB，它们分别由Tn21 MerB和Tn501 MerB基因编码。
细菌对无机汞的抗性广泛存在在多种细菌中，它主要是通过mer操纵子来完成的，该过程会将活性离子状态的Hg2+还原为汞蒸气并排出细菌，其中Tn21 mer操作子和Tn501mer操作子研究最为详细，它们都是由三个部分组成，调节元件MerR用于识别环境中的汞离子，并调节后续基因表达；运输元件MerT等用于帮助细菌富集环境中的汞离子；效应元件MerA和MerB可以将外界环境中的有机汞和离子汞转化成为汞蒸汽。
用于催化有机汞降解为无机汞离子的蛋白质是来源于细菌的MerB，它普遍存在于汞抗性细菌中。MerB蛋白质由个212氨基酸组成，它的活性中心包埋在蛋白质内部，其中Cys96和Cys159对有机汞的碳-汞链的断裂和无机汞的释放起到关键作用，而其Asp99对于这个断裂反应的质子传递也起到关键作用。通过MerB转化环境中的有机汞为无机汞，再通过与MerB串联的无机汞离子荧光探针检测，就可以监控环境中或者细胞内的有机汞含量。
通过采用上述技术方案，有机汞荧光探针在至少105个氨基酸残基内任何与氨基酸序列SEQ ID NO：5-1(金葡)具有99％、95％、90％、80％、70％或50％相同性的同源或非同源序列。
本发明还公开了一种表达载体，采用的技术方案是，所述表达载体包括载体质粒和与载体质粒操作性连接的核酸序列；所述核酸序列为所述的有机汞荧光探针的编码核苷酸序列或者所述核苷酸序列的互补序列；所述表达载体选自原核表达载体、真核表达载体或病毒载体。
通过采用上述技术方案，表达载体包含载体质粒和与载体质粒操作性连接的核酸序列。所述载体质粒可以是复制起点、启动子、增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等，有助于调控目的基因的转录、翻译和表达。
核酸序列包含核苷酸序列SEQ ID NO：5-2；优选的，该核酸序列包含在至少105个碱基长度内任何与核苷酸序列SEQ ID NO:5-2具有99％、95％、90％、80％、70％或50％相同性的同源或非同源序列。
进一步说明MerB位于融合蛋白的氨基端和羧基端的氨基酸序列为5-3所示。
本发明还公开了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述的表达载体。
作为本发明的一种优选技术方案，所述利用宿主细胞，有助于接收和容纳重组DNA分子，是重组基因扩增的场所，宿主细胞可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
本发明还公开了一种融合蛋白，所述融合蛋白以上述无机汞离子荧光蛋白探针A为基本单位；且所述融合蛋白的氨基端和/或羧基端融合有多肽C；所述多肽C包括定位到不同亚细胞器的信号肽、用于纯化或者免疫印迹的标签和荧光蛋白，所述多肽C的氨基酸序列为SEQ ID NO：6-1,2,3,4,5。
6-1：纯化用组氨酸标签
6-2：SUMO标签
6-3：Flag标签
6-4：核定位信号
6-5：线粒体定位信号。
本发明还公开了上述遗传编码的有机汞荧光探针的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：
步骤1，构建有机汞离子质粒，得有机汞降解酶；
步骤2，选择无机汞离子探针和所述有机汞降解酶融合，得有机汞荧光探针；
步骤3，对产生的有机汞荧光探针进行转化、诱导表达和活菌检测；
步骤4，将所述步骤3中响应速度最快、荧光动态变化最大的突变体称之为遗传编码的有机汞荧光探针；
步骤5，分离出遗传编码的有机汞荧光探针。
本发明还公开了一种用于检测有机汞的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的遗传编码的有机汞荧光探针。
本发明还提供了一种遗传编码的有机汞荧光探针的应用，将所述有机汞荧光探针应用于实时检测有机汞。
通过采用上述技术方案，该有机汞荧光探针能够应用于检测有机汞离子、在生理状态下检测有机汞离子、在亚细胞水平检测有机汞离子、原位检测有机汞离子、诊断与有机汞离子水平有关的疾病等。
本发明的有益效果：本发明通过构建遗传编码的有机汞荧光探针，使该有机汞离子荧光探针可以在体内、体外、亚细胞或原位水平检测有机汞离子；探针特异性较好，对于锌离子或镉离子等类似物没有响应，也没有竞争性干扰。探针蛋白相对较小且易于成熟，其荧光动态变化明显，是一种适合于活细胞水平和亚细胞特异性的实时检测有机汞离子的技术；通过将无机汞离子探针和MerB融合产生的有机汞探针更可以检测活体内有机汞的动态变化。
附图说明
图1为本发明遗传编码的有机汞荧光探针GEOMSa的基本构造和工作原理示意图；
图2为本发明遗传编码的有机汞荧光探针GEOMSb的基本构造和工作原理示意图；
图3为本发明通过对有机汞荧光探针结构解析后获得的有机汞荧光探针GEOMSa三维结构构造原理图；
图4为本发明从大肠杆菌(E.coli)中分离纯化的EGFP-S205C，GEOMSa；EGFP-H148C，GEOMSb的SDS-PAGE鉴定图；
图5为本发明有机汞荧光探针GEOMSa的吸收光谱图；
图6为本发明有机汞荧光探针GEOMSa的荧光光谱特性图；
图7为本发明细菌表达的有机汞荧光探针GEOMSa对有机汞的响应曲线图；
图8为本发明在HELA细胞中有机汞荧光探针GEOMSa的亚细胞器定位表达示意图；
图9为本发明外源有机汞加入斑马鱼幼体后，脑组织特异性表达的有机汞荧光探针GEOMSa的变化示意图；
具体实施方式
实施例1
如图1至图9所示，本发明公开了一种遗传编码的有机汞荧光探针，采用的技术方案是，包括多肽B和无机汞离子荧光蛋白探针A，所述无机汞离子荧光蛋白探针A融合于所述多肽B的氨基端或羧基端；所述无机汞离子荧光蛋白探针A和多肽B之间连接有寡肽，所述寡肽由柔性氨基酸组成；所述有机汞荧光探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
本发明还公开了上述有机汞荧光探针的制备方法，首先是本制备方法所使用的相关方法和试验说明，具体如下：
主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著,黄培堂等译；《分子克隆实验指南》(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)等。
I.实验材料和试剂
试剂：实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法和细胞培养以及成像方法等，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例中所用的基于pcDNA3.1的不同定位信号的质粒，pRSETb-EGFP-S205C，pRSETb-EGFP-H148C质粒由甘肃民族师范学院化学与生命科学系生物科学实验室构建；所有PCR的引物均由上海捷瑞生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华大基因公司和杰李测序公司完成。实施例中未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
Ⅱ.实施例中用到的常规分子生物学方法和细胞实验方法
(一)聚合酶链式反应(PCR)：
1.目的片段扩增PCR：
该方法主要用于基因片段扩增和菌落PCR鉴定阳性克隆。
Figure BDA0003548384250000051
扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：
Figure BDA0003548384250000052
2.长片段(>2500bp)扩增PCR：
本发明中使用的长片段扩增，主要是反向PCR扩增载体，在下述实施例中用于获得定点突变的一种技术。在变异部位设计反向PCR引物，其中一条引物的5’端包含变异的核苷酸序列。扩增后的产物就含有相应的突变位点。
Figure BDA0003548384250000053
Figure BDA0003548384250000061
扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：
Figure BDA0003548384250000062
或者
Figure BDA0003548384250000063
(二)核酸内切酶酶切反应：
对质粒载体进行双酶切的体系(n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量)：
Figure BDA0003548384250000064
(三)DNA片段5’端磷酸化反应然后自身环化反应：
从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。自身环化连接反应指线性化载体的3’端和5’端连接反应。
Figure BDA0003548384250000065
Figure BDA0003548384250000071
T4 PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成反应。
(四)目的片段和载体的连接反应
不同的片段和载体之间的连接方法有所差异，本发明中使用了两种连接方法：
1.含有粘性末端的DNA片段和含有粘性末端载体片段的连接
通过限制性内切酶切割的DNA片段通常会产生突出的粘性末端，因此可以和含有序列互补的粘性末端载体片段连接，形成重组质粒。
Figure BDA0003548384250000072
注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1～6:1之间。
2.反向PCR引入定点突变后5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的连接反应
Figure BDA0003548384250000073
(五)感受态细胞的制备与转化
A.感受态细胞的制备：
1.挑取单菌落(如Mach1)接种于5mL LB培养基中，37℃摇床过夜。
2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mL LB培养基中，37℃，220rpm培养3至5h，直到OD600达到0.5。
3.冰浴预冷细胞2h。
4.4℃4000rpm离心10min。
5.弃上清，用5ml预冷的重悬缓冲液悬浮细胞，待均匀后再加入重悬缓冲液至终体积为50mL。
6.冰浴45min。
7.4℃4000rpm离心10min，用5mL冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。
8.每个EP管中放100μL菌液，-80℃或液氮冻存。
重悬缓冲液:CaCl2(100mM)、MgCl2(70mM)、NaAc(40mM)
储存缓冲液:0.5mL DMSO、1.9mL 80％甘油、1mL 10×CaCl2(1M)、1mL 10×MgCl2(700mM)、1mL 10×NaAc(400mM)、4.6mL ddH2O
B.转化：
1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。通常加入的连接产物的体积少于感受态细胞体积的1/10。
3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，迅速转移至冰浴中放置5min。
4.加入500μl LB，于37℃恒温摇床上200转培养1h。
5.将菌液4000rpm离心3min，留200μl上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。
(六)有机汞荧光探针的E.coli活细胞检测
1.将pRSETb为基础的汞离子探针质粒到JM109(DE3)，倒置培养过夜，从平板上挑取克隆到5ml锥形瓶中，置于37℃摇床，220rpm培养至OD在0.4～0.6之间，加入千分之一终浓度的IPTG，18℃下诱导24～36小时。
2.4000rpm离心5min，离心后，弃去上清，使用HEPES缓冲液(100mM HEPES，100mMNaCl，pH7.3)冲洗细胞沉淀一次。
3.4000rpm离心5min，弃去上清，加入适当体积的HEPES缓冲液稀释至OD在0.05～0.2之间。
4.设置好酶标仪的参数，使用常温检测不同浓度的有机汞离子和有机汞对细胞荧光强度的影响。
(七)蛋白质荧光探针的表达，纯化和检测
1.将pRSETb为基础的汞离子探针质粒到JM109(DE3)，倒置培养过夜，从平板上挑取克隆到250ml锥形瓶中，置于37℃摇床，220rpm培养至OD在0.4～0.6之间，加入千分之一终浓度的IPTG，18℃下诱导24～36小时离心收菌。
2.加入50mM的Tris-HCl缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎至菌体澄清。然后9600rpm，4℃离心20min。
3.离心上清通过自装的镍柱亲和层析柱纯化获得蛋白，镍柱亲和层析后的蛋白溶液加入金属离子螯合剂1mM DMSA以及10mM EDTA低温下孵育1h，再通过自装的脱盐柱获得溶解在100mM HEPES缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.3)中的探针蛋白。
4.纯化的蛋白鉴定后，使用测定缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.3)稀释探针成终浓度为0.2μM的蛋白溶液。用测定缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.3)将有机汞以及金属离子类似物分别配制成终浓度为100mM的储液，在测定前配置成为不同浓度梯度储液待用。
5.取100μl 0.2μM的荧光探针溶液，分别和有机汞以及其类似物混合后，测定蛋白的485nm荧光激发后528nm发射的荧光强度。对样品的荧光激发、发射测定利用多功能荧光酶标仪完成。
(八)哺乳动物细胞的转染和荧光检测
1.取对数生长期的细胞，吸出细胞培养板中的旧培养液，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤细胞一次
2.加入0.5ml胰酶，37℃或者常温作用数分钟，于光学显微镜下进行观察，当细胞呈现圆粒状将要离壁时，就可以终止消化。
3.加入无抗生素的含有胎牛血清的培养基，轻拍培养板使细胞脱落，用吸管轻轻吹匀打散细胞团，将单细胞悬液铺板到24孔培养板或者35毫米玻璃底培养板。
4.约12小时候转染，使用lipofectamine 8000将合适量的质粒转染到细胞中，4-6小时候更换培养基。
5.显微镜荧光成像：将转染后的细胞培养基移除，加入含有10mM葡萄糖的HBSS缓冲液，将样品置于倒置荧光显微镜载物台上，长度linker的pRSETb-linker质粒(长度分别为10,20,30个氨基酸)，选择好合适的条件进行拍照。
6.酶标仪荧光检测：消化细胞后铺板到96孔黑底的荧光检测板，加入检测药物或试剂，放入酶标仪进行荧光检测。
遗传编码的有机汞荧光探针制备步骤如下：
步骤1：有机汞离子质粒的构建以pRSETb-EGFP-S205C和pRSETb-EGFP-H148C质粒为模板，并从细菌基因组织扩增得到MerB基因(引物：P1：MerB-BamHI-fw：AAGGATCCGATGAAGCTGGCTCCCTACAT；P2：MerB-overlap-rv：GCCTCCACCGCCAGAGGTACCGGGTGTCCTGCTGCTCATGGTCTGGA)先构建MerB位于氨基端的质粒MerB-Linker30-EGFP-S205C这一个融合蛋白质粒，得到的DNA片段通过双酶切的方法酶切以及T4DNA连接酶连接后转化，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成测序。
构建质粒名称如下所示：
1、pRSETb-MerB-Linker30-EGFP-S205C
2、pRSETb-MerB-Linker20-EGFP-S205C(GEOSMa)
3、pRSETb-MerB-Linker10-EGFP-S205C
4、pRSETb-EGFP-S205C-Linker30-MerB
5、pRSETb-EGFP-S205C-Linker30-MerB
6、pRSETb-EGFP-S205C-Linker20-MerB
7、pRSETb-EGFP-S205C-Linker10-MerB
8、pRSETb-MerB-Linker20-EGFP-H148C(GEOSMb)
步骤2：有机汞荧光探针的产生
选择无机汞离子探针EGFP-S205C和来源于细菌的有机汞降解酶MerB融合。MerB由细菌抗性基因Mer操纵子调控基因编码该基因，MerB蛋白的氨基酸如SEQ ID NO：3所示，该多肽可以由SEQ ID NO：3-2编码。
首先，送华大基因合成Linker30的一段DNA序列，再利用PCR overlap的方法将MerB与Linker30扩增结合在一起，然后将合成好的MerB-Linker30再一次通过overlap的方法与EGFP-S205C连接到一起，合成出完整的融合蛋白DNA序列MerB-Linker30-EGFP-S205C其所有引物和合成的片段序列如下。产生的重组蛋白同样对有机汞存在显著的响应，但是它们的动态变化和响应时间略微小于细菌来源MerB的融合蛋白。
双引物退火产生30个氨基酸长度linker所用的引物：P3
ACCATGAGCAGCAGGACACCCGGAGGCTCTGGAGGTGGCGGTAGTACTAGTGGTACCTCTGGCGGTGGAGGCAGTGGTGGCGGAGGCTCTGGAGGTGGCGGTAGTACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG
P4：MerB-BamHI-fw：
AAGGATCCGATGAAGCTGGCTCCCTACAT
P5：L-30MerB-overlap-rv：
ACCTCCACCTCCAGAGCCTCCGGGTGTCCTGCTGCTCATGGTCTG
P6：Linker-EGFP-overlap-rv:CAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATACT
P7：EGFP-fw:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG
P8：EGFP-rv:CAAGCTTCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
后续构建不同linker长度的质粒可直接在MerB-Linker30-EGFP-S205C质粒的基础上设计引物截短以及运用infusion的方法即可得到截短质粒，构建用于MerB位于氨基端的质粒MerB-Linker20-EGFP-S205C和MerB-Linker10-EGFP-S205C质粒所用的引物分别如下：
P9：KpnI-Linker20-S205C-fw(上游引物)
GGTACCTCTGGCGGTGGAGGCAGTGGTGGCGGAGGCTCTGG
P10：MerB-Linker20-infusion-rv(下游引物)ACCGCCAGAGGTACCGGGTGTCCTGCTGCTCATGG
P11：Linker10-infusion-fw：CTGGAGGTGGCGGTAGTACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
P12：MerB-Linker10-infusion-rv：
TACCGCCACCTCCAGAGCCTCCGGGTGTCCTGCTGCTCATGGT
其次，运用类似的的方法获得MerB位于融合蛋白羧基端的质粒，具体方法和所用引物如下所示：
第一步，先以构建得到的质粒pRSETb-MerB-Linker30-EGFP-S205C为模板扩增linker30片段，目的是与EGFP-S205C或者EGFP-H148C以及MerB进行PCR overlap合成融合DNA片段。
P13：EGFP-Linker30-overlap-fw：
CACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAGGCTCTGGAGGC
P14：MerB-Linker30-overlap-rv：
CAGGATGTAGGGAGCCAGCTTCATACTAGTACTACCGCCACCGC
第二步，就可以扩增MerB和EGFP-S205C片段：
P15：BamHI-EGFP(S205C)-fw:GGATCCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
P16：EGFP-S205C-overlap-rv:TTGTACAGCTCGTCCATGCCGA
P17：MerB-overlap-fw:ATGAAGCTGGCTCCCTACATCCTG
P18：MerB-EcoRI-rv:TCGAATTCGGGTGTCCTGCTGCTCATGG
第三步，将片段融合overlap PCR得到最终DNA序列：所用引物都是第一、二步中的引物(具体步骤如MerB-Linker30-EGFP-S205C质粒构建方法)。
后续构建不同linker长度的质粒就直接在EGFP-S205C-Linker30-MerB质粒的基础上设计引物截短以及运用infusion的方法就可以得到截短质粒了，构建用于MerB位于氨基端的质粒EGFP-S205C-Linker20-MerB和EGFP-S205C-Linker10-MerB质粒所用的引物分别如下：
P19：Linker20-infusion-fw
GGTACCTCTGGCGGTGGAGGCAGTGGTGGCGGAGGCTCTGGA
P20：Linker20-infusion-rv:
TCCACCGCCAGAGGTACCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG
P21：Linker10-infusion-fw:
GGAGGCTCTGGAGGTGGCGGTAGTACTAGTATGAAGCTGGCTCCCTA
P22：Linker10-infusion-rv:
ACCTCCAGAGCCTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC
用于pRSETb系列质粒测序的引物序列可以为：
T7通用引物P23：TAATACGACTCACTATAGGG
T7 ter通用引物P24：ATAACTAGCATAACCCCTTG
步骤3，对产生的有机汞荧光探针进行转化、诱导表达和活菌检测
对产生的有机汞荧光探针进行转化、诱导表达和活菌检测(见表1)。
表1
Figure BDA0003548384250000111
注：*表示荧光强度，*越多荧光强度越强
步骤4，遗传编码的有机汞荧光探针的确定
步骤3的结果显示MerB在氨基端，且连接区氨基酸个数为20个时，融合蛋白显示出最快速的响应速度和最大的荧光动态变化，分别将这个MerB-EGFP-S205C-L20的突变体称之为GEOMSa(遗传编码的有机汞荧光探针，genetically encoded organic mercurysensor)。
然后分别将EGFP-H148C(说明：由于此基因只有一个突变位点，所有构建此质粒的时所用的引物和构建MerB-EGFP-S205C时所用的引物一样，区别就是扩增是所用的模板为pRSETb-EGFP-H148C)和在MerB的氨基端或羧基端融合，最终产生的MerB-EGFP-H148C-L20，分别称之为GEOMSb。
有机汞荧光探针性质检测
有机汞荧光探针和其他蛋白的融合和应用
以GEOMSa为所选的荧光探针，将其直接酶切亚克隆到含有不同蛋白纯化标签和蛋白免疫印迹标签的质粒上，经过测序正确后，将重组质粒转化到JM109(DE3)中诱导表达，使用活菌检测探针对于汞离子的响应。其中pcDNA3.1-flag在细胞中表达，检测方法和重组菌相似。
标签 质粒 最大响应倍数 荧光强度
His pRSETb 4.07 ***
sumo pE-sumo 4.10 ****
Flag pcDNA3.1-flag 4.05 ***
结果显示，所有的测试蛋白标签和汞离子荧光探针融合都不影响其性质，而sumo标签因为本身存在分子伴侣的功能，融合蛋白的荧光甚至比原始探针的荧光还强，这使得探针可以在不同的表达系统中使用。
有机汞荧光探针的光谱性质
将GEOMSa探针转化JM109(DE3)，诱导表达，并纯化蛋白，通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，如图4所示，两个蛋白的纯度很高，大小正确。将如上所述制备的荧光探针GEOMSa蛋白溶解于测定缓冲液(100mM HEPES，100mM NaCl，pH7.3)中，配制终浓度为5μM的荧光探针溶液。利用多功能荧光酶标仪测定吸收光谱(如图5所示)，荧光分光光度计测定激发和发射光谱(如图6所示)。
荧光光谱特性测定的实验结果表明，GEOMSa蛋白光谱性质与对应的无机汞离子探针相似，MerB并不干扰其荧光光谱，其中，GEOMSa探针有两个激发峰，分别为420nm和490nm，和一个发射峰在510nm左右，GEOMSb探针同样也有两个激发峰，分别为420nm和490nm，和一个发射峰在510nm左右。在加入50μM的汞离子后，激发峰分别下降了30％和上升了70％。
有机汞荧光探针在不同亚细胞器内定位表达
以pRSETb-GEOMSa为模板，通过双酶切的方法获得汞离子荧光探针基因，酶切产物片段回收后分别连接到pcDNA3.1-Hygro-Cyto&Nuc、Mito、Nuc载体上，各种不同定位的信号肽氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：6-1,2,3,4,5所示。利用所得的重组质粒转染HELA细胞，用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞，两组滤镜分别选择FITC和F407。
GEOMSa和GEOMSb的定位格局相似，GEOMSa-Cyto&Nuc在HELA细胞中高效、准确定位于细胞浆和细胞核中(如图8A、B所示)；GEOMSa-Nuc在HELA细胞中高效、准确定位于细胞核中(如图8C所示)；GEOMSa-Mito在HELA细胞中高效、准确定位于线粒体中(如图8D所示)；。
用有机汞荧光探针测定斑马鱼脑部摄入有机汞
1.取单细胞期的斑马鱼受精卵注射1nL稀释后的25ng的质粒
2.显微注射9-10h后，将斑马鱼维持在含有N-PTU的E3培养基中以抑制黑色素的形成。
3.在标准条件下培养4-5天鱼卵，每天换水一次。
4.将这些幼体置于0.1mg/mL的三卡因的E3培养基中麻醉，并用1％的低熔点琼脂糖将斑马鱼固定在35mm的玻璃底dish中。
5.在dish中加入1ml含有三卡因的E3培养基。
6.使用4倍的物镜进行斑马鱼的观察，拍摄6-8张图片后，加入有机汞溶液至终浓度为300μM，混匀并调整斑马鱼的位置，拍摄10-20min的动力学。
在本发明的上述检测中，该有机汞离子荧光探针可以在体内、体外、亚细胞或原位水平检测有机汞离子；探针蛋白相对较小且易于成熟，其荧光动态变化大，是一种适合于活细胞水平和亚细胞特异性的实时检测无机汞离子的技术。通过将无机汞离子探针和MerB融合产生的有机汞探针更可以检测活体内有机汞的动态变化。
上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 甘肃民族师范学院
台州恩泽医疗中心（集团）
安顺市人民医院
<120> 一种遗传编码的有机汞荧光探针及其制备方法和应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1-1
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1-1
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 1-2
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1-2
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Cys Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 2-1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2-1
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser
1 5 10
<210> 2-2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2-2
Gly Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser
20
<210> 2-3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2-3
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Gly Thr Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser
20 25 30
<210> 3-1
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3-1
Met Lys Leu Ala Pro Tyr Ile Leu Glu Leu Leu Thr Ser Val Asn Arg
1 5 10 15
Thr Asn Gly Thr Ala Asp Leu Leu Val Pro Leu Leu Arg Glu Leu Ala
20 25 30
Lys Gly Arg Pro Val Ser Arg Thr Thr Leu Ala Gly Ile Leu Asp Trp
35 40 45
Pro Ala Glu Arg Val Ala Ala Val Leu Glu Gln Ala Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Thr Leu Arg Glu
65 70 75 80
Thr Ser Tyr Val Phe Glu Ile Asp Asp Arg Arg Leu Tyr Ala Trp Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Thr Leu Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Arg Thr Ala Arg
100 105 110
Val Ser Ser His Cys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Val Ser Leu Thr Val
115 120 125
Ser Pro Ser Glu Ile Gln Ala Val Glu Pro Ala Gly Met Ala Val Ser
130 135 140
Leu Val Leu Pro Gln Glu Ala Ala Asp Val Arg Gln Ser Phe Cys Cys
145 150 155 160
His Val His Phe Phe Ala Ser Val Pro Thr Ala Glu Asp Trp Ala Ser
165 170 175
Lys His Gln Gly Leu Glu Gly Leu Ala Ile Val Ser Val His Glu Ala
180 185 190
Phe Gly Leu Gly Gln Glu Phe Asn Arg His Leu Leu Gln Thr Met Ser
195 200 205
Ser Arg Thr Pro
210
<210> 3-2
<211> 636
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3-2
Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr
1 5 10 15
Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr
20 25 30
Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly
35 40 45
Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Gly
50 55 60
Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys Thr
65 70 75 80
Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Cys
115 120 125
Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly
130 135 140
Cys Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly
145 150 155 160
Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Ala
165 170 175
Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly
180 185 190
Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Ala
195 200 205
Ala Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Gly
210 215 220
Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Gly Gly Gly Ala Gly
225 230 235 240
Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Gly
245 250 255
Ala Gly Ala Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Ala Gly
260 265 270
Gly Cys Thr Gly Thr Ala Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys
275 280 285
Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala
290 295 300
Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr
305 310 315 320
Cys Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Cys Gly Gly
325 330 335
Gly Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Gly
340 345 350
Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys
355 360 365
Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys
370 375 380
Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys
385 390 395 400
Ala Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Cys
405 410 415
Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Ala Gly Cys
420 425 430
Cys Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly
435 440 445
Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Thr Gly Cys Gly
450 455 460
Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys
465 470 475 480
Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly
485 490 495
Cys Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys
500 505 510
Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys
515 520 525
Ala Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly
530 535 540
Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Ala Thr Cys Gly Thr
545 550 555 560
Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr
565 570 575
Thr Thr Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly
580 585 590
Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr
595 600 605
Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys
610 615 620
Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys
625 630 635
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Asn Ile Ser Glu Phe Ser Ala Gln Leu Asp Gln Thr Phe Asp
1 5 10 15
Gln Gly Glu Ala Val Ser Met Glu Trp Leu Phe Arg Pro Leu Leu Lys
20 25 30
Met Leu Ala Glu Gly Asp Pro Val Pro Val Glu Asp Ile Ala Ala Glu
35 40 45
Thr Gly Lys Pro Val Glu Glu Val Lys Gln Val Leu Gln Thr Leu Pro
50 55 60
Ser Val Glu Leu Asp Glu Gln Gly Arg Val Val Gly Tyr Gly Leu Thr
65 70 75 80
Leu Phe Pro Thr Pro His Arg Phe Glu Val Asp Gly Lys Gln Leu Tyr
85 90 95
Ala Trp Cys Ala Leu Asp Thr Leu Met Phe Pro Ala Leu Ile Gly Arg
100 105 110
Thr Val His Ile Ala Ser Pro Cys His Gly Thr Gly Lys Ser Val Arg
115 120 125
Leu Thr Val Glu Pro Asp Arg Val Val Ser Val Glu Pro Ser Thr Ala
130 135 140
Val Val Ser Ile Val Thr Pro Asp Glu Met Ala Ser Val Arg Ser Ala
145 150 155 160
Phe Cys Asn Asp Val His Phe Phe Ser Ser Pro Ser Ala Ala Gln Asp
165 170 175
Trp Leu Asn Gln His Pro Glu Ser Ser Val Leu Pro Val Glu Asp Ala
180 185 190
Phe Glu Leu Gly Arg His Leu Gly Ala Arg Tyr Glu Glu Ser Gly Pro
195 200 205
Thr Asn Gly Ser Cys Cys Asn Ile
210 215
<210> 5
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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1 5 10 15
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35 40 45
Pro Ala Glu Arg Val Ala Ala Val Leu Glu Gln Ala Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Thr Leu Arg Glu
65 70 75 80
Thr Ser Tyr Val Phe Glu Ile Asp Asp Arg Arg Leu Tyr Ala Trp Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Thr Leu Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Arg Thr Ala Arg
100 105 110
Val Ser Ser His Cys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Val Ser Leu Thr Val
115 120 125
Ser Pro Ser Glu Ile Gln Ala Val Glu Pro Ala Gly Met Ala Val Ser
130 135 140
Leu Val Leu Pro Gln Glu Ala Ala Asp Val Arg Gln Ser Phe Cys Cys
145 150 155 160
His Val His Phe Phe Ala Ser Val Pro Thr Ala Glu Asp Trp Ala Ser
165 170 175
Lys His Gln Gly Leu Glu Gly Leu Ala Ile Val Ser Val His Glu Ala
180 185 190
Phe Gly Leu Gly Gln Glu Phe Asn Arg His Leu Leu Gln Thr Met Ser
195 200 205
Ser Arg Thr Pro Gly Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu
225 230 235 240
Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn
245 250 255
Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr
260 265 270
Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val
275 280 285
Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe
290 295 300
Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala
305 310 315 320
Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp
325 330 335
Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu
340 345 350
Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn
355 360 365
Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr
370 375 380
Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile
385 390 395 400
Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln
405 410 415
Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
420 425 430
Tyr Leu Ser Thr Gln Cys Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
435 440 445
Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu
450 455 460
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
465 470
<210> 5-1
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5-1
Met Lys Asn Ile Ser Glu Phe Ser Ala Gln Leu Asp Gln Thr Phe Asp
1 5 10 15
Gln Gly Glu Ala Val Ser Met Glu Trp Leu Phe Arg Pro Leu Leu Lys
20 25 30
Met Leu Ala Glu Gly Asp Pro Val Pro Val Glu Asp Ile Ala Ala Glu
35 40 45
Thr Gly Lys Pro Val Glu Glu Val Lys Gln Val Leu Gln Thr Leu Pro
50 55 60
Ser Val Glu Leu Asp Glu Gln Gly Arg Val Val Gly Tyr Gly Leu Thr
65 70 75 80
Leu Phe Pro Thr Pro His Arg Phe Glu Val Asp Gly Lys Gln Leu Tyr
85 90 95
Ala Trp Cys Ala Leu Asp Thr Leu Met Phe Pro Ala Leu Ile Gly Arg
100 105 110
Thr Val His Ile Ala Ser Pro Cys His Gly Thr Gly Lys Ser Val Arg
115 120 125
Leu Thr Val Glu Pro Asp Arg Val Val Ser Val Glu Pro Ser Thr Ala
130 135 140
Val Val Ser Ile Val Thr Pro Asp Glu Met Ala Ser Val Arg Ser Ala
145 150 155 160
Phe Cys Asn Asp Val His Phe Phe Ser Ser Pro Ser Ala Ala Gln Asp
165 170 175
Trp Leu Asn Gln His Pro Glu Ser Ser Val Leu Pro Val Glu Asp Ala
180 185 190
Phe Glu Leu Gly Arg His Leu Gly Ala Arg Tyr Glu Glu Ser Gly Pro
195 200 205
Thr Asn Gly Ser Cys Cys Asn Ile Gly Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Met Val Ser Lys
225 230 235 240
Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp
245 250 255
Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly
260 265 270
Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly
275 280 285
Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly
290 295 300
Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe
305 310 315 320
Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe
325 330 335
Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
340 345 350
Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys
355 360 365
Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser
370 375 380
His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val
385 390 395 400
Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala
405 410 415
Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu
420 425 430
Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Cys Ala Leu Ser Lys Asp Pro
435 440 445
Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala
450 455 460
Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
465 470 475
<210> 5-2
<211> 1413
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5-2
atgaagctgg ctccctacat cctggagctg ctgaccagcg tgaaccggac caacggcaca 60
gccgacctgc tggtgcccct gctgcgggag ctggctaagg gcaggcccgt gagccggacc 120
acactggccg gcatcctgga ctggcccgct gagcgggtgg ctgccgtgct ggagcaggcc 180
acaagcaccg agtacgacaa ggacggcaac atcatcggct acggcctgac actgcgggag 240
accagctacg tgttcgagat cgacgaccgg aggctgtacg cctggtgcgc cctggacaca 300
ctgatcttcc ccgctctgat cggcaggacc gctcgggtga gcagccactg cgctgccacc 360
ggggcccccg tcagcctgac cgtcagcccc agcgagatcc aggccgtgga gcccgctggg 420
atggccgtga gcctcgtgct gccccaggag gctgccgacg tgcggcagag cttctgctgc 480
cacgtgcact tcttcgcctc cgtgcccaca gccgaggact gggccagcaa gcaccagggg 540
ctggagggcc tggctatcgt gagcgtgcac gaggctttcg gcctgggcca ggagttcaac 600
aggcacctgc tccagaccat gagcagcagg acacccggta cctctggcgg tggaggcagt 660
ggtggcggag gctctggagg tggcggtagt actagtatgg tgagcaaggg cgaggagctg 720
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 780
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 840
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 900
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 960
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 1020
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 1080
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 1140
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 1200
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 1260
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtgcgccctg 1320
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 1380
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aag 1413
<210> 5-3
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5-3
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Cys Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly
225 230 235 240
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Thr Ser Met Lys Leu Ala Pro Tyr Ile Leu Glu Leu Leu Thr Ser
260 265 270
Val Asn Arg Thr Asn Gly Thr Ala Asp Leu Leu Val Pro Leu Leu Arg
275 280 285
Glu Leu Ala Lys Gly Arg Pro Val Ser Arg Thr Thr Leu Ala Gly Ile
290 295 300
Leu Asp Trp Pro Ala Glu Arg Val Ala Ala Val Leu Glu Gln Ala Thr
305 310 315 320
Ser Thr Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Thr
325 330 335
Leu Arg Glu Thr Ser Tyr Val Phe Glu Ile Asp Asp Arg Arg Leu Tyr
340 345 350
Ala Trp Cys Ala Leu Asp Thr Leu Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Arg
355 360 365
Thr Ala Arg Val Ser Ser His Cys Ala Ala Thr Gly Ala Pro Val Ser
370 375 380
Leu Thr Val Ser Pro Ser Glu Ile Gln Ala Val Glu Pro Ala Gly Met
385 390 395 400
Ala Val Ser Leu Val Leu Pro Gln Glu Ala Ala Asp Val Arg Gln Ser
405 410 415
Phe Cys Cys His Val His Phe Phe Ala Ser Val Pro Thr Ala Glu Asp
420 425 430
Trp Ala Ser Lys His Gln Gly Leu Glu Gly Leu Ala Ile Val Ser Val
435 440 445
His Glu Ala Phe Gly Leu Gly Gln Glu Phe Asn Arg His Leu Leu Gln
450 455 460
Thr Met Ser Ser Arg Thr Pro
465 470
<210> 6-1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6-1
His His His His His His Ser Ser Gly
1 5
<210> 6-2
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6-2
Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro
1 5 10 15
Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser
20 25 30
Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu
35 40 45
Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg
50 55 60
Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp
65 70 75 80
Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile
85 90 95
Gly
<210> 6-3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6-3
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 6-4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6-4
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Leu Pro Lys Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Val Glu Asp Leu Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 6-5
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6-5
Met Ser Val Leu Thr Pro Leu Leu Leu Arg Gly Leu Thr Gly Ser Ala
1 5 10 15
Arg Arg Leu Pro Val Pro Arg Ala Lys Ile His Ser Leu Gly Ser Val
20 25 30
Leu Thr Pro Leu Leu Leu Arg Gly Leu Thr Gly Ser Ala Arg Arg Leu
35 40 45
Pro Val Pro Arg Ala Lys
50

Claims (10)

1.一种遗传编码的有机汞荧光探针，其特征在于：包括多肽B和无机汞离子荧光蛋白探针A，所述无机汞离子荧光蛋白探针A融合于所述多肽B的氨基端或羧基端；所述无机汞离子荧光蛋白探针A和多肽B之间连接有寡肽，所述寡肽还包括柔性氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种遗传编码的有机汞荧光探针，其特征在于：所述柔性氨基酸的个数为0～30个；所述有机汞荧光探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
3.根据权利要求1或2所述的一种遗传编码的有机汞荧光探针，其特征在于：所述无机汞离子荧光蛋白探针A选自：
a.来源于绿色荧光蛋白GFP的无机汞离子探针，所述绿色荧光蛋白GFP的无机汞离子探针的氨基酸序列为SEQ ID NO：1-1,2；
b.所述柔性氨基酸的个数为0～30个，氨基酸序列为SEQ ID NO：2-1,2,3。
4.根据权利要求1或2所述的一种遗传编码的有机汞荧光探针，其特征在于：所述多肽B选自：
a.来源于细菌的烷基汞降解酶MerB，所述烷基汞降解酶MerB的氨基酸序列为SEQ IDNO：3-1；
b.金黄色葡萄球菌的有机汞制剂降解酶，所述有机汞制剂降解酶的氨基酸序列为SEQID NO：4。
5.一种表达载体，其特征在于：包括载体质粒和与载体质粒操作性连接的核酸序列；所述核酸序列为权利要求1所述有机汞荧光探针的编码核苷酸序列或者所述编码核苷酸序列的互补序列；所述表达载体选自原核表达载体、真核表达载体或病毒载体。
6.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括权利要求4所述的表达载体。
7.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的基本单位为权利要求1所述的有机汞荧光探针A，还包括多肽C，所述多肽C融合在所述融合蛋白的氨基端、羧基端中的至少一个上。
8.一种用于检测有机汞的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的有机汞荧光探针A。
9.一种制备如权利要求1所述的一种遗传编码的有机汞荧光探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，构建有机汞离子质粒，得有机汞降解酶；
步骤2，选择无机汞离子探针和所述有机汞降解酶融合，得有机汞荧光探针；
步骤3，对产生的有机汞荧光探针进行转化、诱导表达和活菌检测；
步骤4，将所述步骤3中响应速度最快、荧光动态变化最大的突变体称之为遗传编码的有机汞荧光探针；
步骤5，分离出遗传编码的有机汞荧光探针。
10.根据权利要求1-4所述的一种遗传编码的有机汞荧光探针在检测有机汞中的应用。
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