KR20120125581A - 열 스트레스에 저항성을 지닌 아라비돕시스 내의 ｓｕｍｏ-변형 단백질 - Google Patents

열 스트레스에 저항성을 지닌 아라비돕시스 내의 ｓｕｍｏ-변형 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 열 스트레스에 저항성을 지닌 아라비돕시스 내의 SUMO-변형 단백질에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 형질전환 아라비돕시스 식물체를 통해 아라비돕시스 내에서 열 스트레스에 저항성을 지닌 SUMO-변형 단백질을 분리하고 이의 기능을 확인함으로써 아라비돕시스 내의 DNA 또는 RNA의 전사 결합 복제에 관련된 SUMO-변형 단백질, 생체 내 신호 경로 및 대사에 관련된 SUMO-변형 단백질을 제공하는 것이다.

Description

열 스트레스에 저항성을 지닌 아라비돕시스 내의 ＳＵＭＯ-변형 단백질 {SUMO-modified proteins in Arabidopsis resistant to heat stress}
본 발명은 열 스트레스에 저항성을 지닌 아라비돕시스 내의 SUMO-변형 단백질에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 형질전환 아라비돕시스 식물체를 통해 아라비돕시스 내에서 열 스트레스에 저항성을 지닌 SUMO-변형 단백질을 분리하고 이의 기능을 확인함으로써 아라비돕시스 내의 DNA 또는 RNA의 전사 결합 복제에 관련된 SUMO-변형 단백질, 생체 내 신호 경로 및 대사에 관련된 SUMO-변형 단백질을 제공하는 것이다.
진핵생물의 단백질은 번역 후 많은 유형의 변형(modification)에 의해 조절되며, 몇몇의 경우 변형된 그룹은 단백질 자체 내의 부분이다. 작고 고도로 보존된 폴리펩티드인 유비퀴틴이 전형적인 예이며, 이 유비퀴틴은 세포 내에서 목적단백질과 가역적으로 연결되며 이를 유비퀴티네이션이라고 칭한다. 작은 유비퀴틴-유사 모디파이어(SUMO)는 구조와 메커니즘에 있어 유비퀴틴과 비슷하다. SUMO와 관련된 활성 및 컨쥬게이션(conjugation) 반응은 유비퀴틴과 많은 공통점을 가지고 있다. 기질에의 SUMO 부착(sumoylation)은 E2에서부터 기질까지 트랜스퍼 SUMO를 자극하는 헤테로다이머 SUMO-활성 효소(E1), SUMO-컨쥬게이션 효소(E2) 및 기질 인식 인자(E3)에 의존한다. 최종적으로 수모화된 단백질은 SUMO 리사이클을 담당하는 SUMO 프로테아제에 의해 접합체로부터 제거될 수 있다.
비록 수모화 패턴이 유비퀴티네이션과 비슷할지라도 유비퀴틴 라이게이션과는 같지 않으며, 목적단백질은 짧은 공통서열, Ψ-K-X-E/D (Ψ, 큰 소수성 아미노산; K, 리신 수용체; X, 임의의 아미노산; E/D, 글루타메이트 또는 아스파테이트)를 지니는 몇 개의 수모화 자리를 일반적으로 포함한다.
동물 및 효모에서 기질 단백질의 SUMO 변형은 선천적 면역, 염색질 안정성 및 세포분열과 같은 중요하고 다양한 세포 과정, DNA 복구, 핵세포질(nucleocytoplasmic) 트래피킹, 전사조절 및 유비퀴티네이션 길항작용에 참여한다. 척추동물의 RanGAP1은 그의 핵공(nuclear pore) 복합체의 국소화를 위해 SUMO 변형이 요구되는 SUMO 접합체로 최초로 확인된 목적단백질이다. 지금까지 50종 이상의 포유류 단백질이 수모화 타겟으로 알려졌다. 효모 및 후생동물에 있어서 글로벌 분석은 100개 이상의 수모화 목적 단백질을 확인하였다.
아라비돕시스에서 SUMO 유전자 패밀리는 오직 4개(SUM 1-3, 및 5)만이 발현되는 것으로 보이는 총 8종의 유전자이다. SUMO 1/2 접합체의 수준은 열 충격, 과산화수소수, 에탄올 및 카나바닌(canavanine)에 식물이 노출되는 것을 포함하는 다양한 세포 스트레스에 의해 급증하나 이는 일시적으로만 증가한다. 이는 수모화가 식물체내에서 스트레스 응답 반응의 중요한 후-번역 특성이라는 것을 암시한다.
몇몇 특이성은 SUMO 3 접합체의 수준 및 분포는 어떤 스트레스에도 영향을 받지 않는다는 사실을 나타낸다. 비록 수모화에 관한 본 발명자들의 이해가 식물에만 제한될지라도, 이 시스템은 열충격, 병원체 방어, 가뭄과 추위 내성, ABA 신호, 개화 및 인산염 결핍을 포함하는 다양한 식물 환경 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 최근에 van den Burg et al. (2010)은 AtSUMO3은 살리실산 축적의 다운스트림으로 작용하는 반면에 AtSUMO1 및 AtSUMO2는 살리실산 축적을 억제한다는 것을 보고했다. 그러므로 Arabidopsis SUMO 파라로그(paralog)는 다양한 환경 조건 하에서 타겟 변형을 구별하여 조절하는 조절 네트워크를 형성한다는 것을 암시한다.
그러나 식물에 있어서 SUMO 목적 단백질을 포함하는 이들의 생물학적 기능 및 조절에 관한 여러 측면은 제대로 규명되지 않은 채 남아있다. 지금까지 소수의 SUMO 목적단백질인 MYB30, GTE3/5, PHR1, ICE1, ABI5 및 FLD의 7개의 진성 아라비돕시스 단백질만이 목적단백질로 밝혀졌으며 이는 수모화 콘센서스 모티프를 포함한다.
식물에서 추정 SUMO 타겟 및 SUMO 결합 단백질의 생물학적 의미에 대해 지식을 확장시키기 위해서, 본 발명자들은 아라비돕시스 형질전환체 과발현 AtSUMO1에서 질량 분석기-기반의 프로테오믹스 접근을 이용하여 SUMO-결합 단백질에 관한 스크리닝을 시작하였다.
따라서 본 발명은 아라비돕시스 식물체 내에서 SUMO-결합 단백질을 분리하고 그 기능을 규명한 것으로, 본 발명자들은 SUMO 목적단백질 기준에 맞는 27개 단백질을 아라비돕시스 식물체 내에서 분리하고 이들의 기능인 DNA 또는 RNA-관련된 전사 복제, 신호 경로, 일반적 대사 및 불확인 기능을 지닌 다양한 단백질을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다. 또한 특별히 MCM3 (At5G46280) 단백질과 함께 SUMO1, SUMO1ΔGG 또는 SUMO3 단백질을 이용하는 효모 스플릿 유비퀴틴 분석 및 E. coli 수모화 분석을 기반으로 하여 생체 내에서 SUMO 단백질의 기능적 특성을 분화된 식물체로부터 확인하였다.
본 발명이 해결하고자하는 과제는 아라비돕시스 식물체 내에서 SUMO-결합 단백질을 분리하고 그 기능을 규명하기 위한 것으로, SUMO 목적단백질 기준에 맞는 27개 단백질을 아라비돕시스 식물체 내에서 분리하고 이들의 기능인 DNA 또는 RNA-관련된 전사 복제, 신호 경로, 일반적 대사 및 불확인 기능을 지닌 다양한 단백질을 확인하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 아라비돕시스 내의 작은 유비퀴틴 모디파이어(SUMO)-변형 단백질에 있어서, 상기 SUMO-변형 단백질은 하기 아라비돕시스 게놈 이니셔티브(AGI) 코드 At5G46280, At3G56860, At3G54670, At3G08505, At3G19210, At2G37160, At3G53390, At3G60240, At5G46500, At3G47290, At4G02930, At1G45000, At5G03860, At3G09260, At2G13440, At4G37930, At1G11860, At5G49360, At3G26650, At1G13440, At2G46110, At5G60160, At4G31990, At1G48030, At3G19870, At2G16760, At4G26920으로 표시되는 27개의 단백질임을 특징으로 하는 아라비돕시스 내의 SUMO-변형 단백질을 제공하는 것이다.
이때 상기 SUMO-변형 단백질은 Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg의 아미노산 서열을 지닌 수모화 영역, Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg의 아미노산 서열을 지닌 수모화 영역 또는 Gln Ser Val Asp Met Asn Ser Ile Ala Phe Leu Phe Asp Gly Arg의 아미노산 서열을 지닌 수모화 영역을 지님을 특징으로 한다.
한편 본 발명의 또다른 목적은 상기 SUMO-변형 단백질을 과발현시키는 열 스트레스 저항성을 지닌 형질전환 아라비돕시스 식물체를 제공하는 것이다.
이때 상기 형질전환 아라비돕시스 식물체는 제 1항의 SUMO-변형 단백질을 암호화시킨 cDNA를 포함한 T-플라스미드 벡터를 아그로박테리움 균주를 이용하여 야생형 아라비돕시스 식물 세포에 감염 형질전환 시킨 후 성장시켜 제조된 식물체임을 특징으로 한다.
본 발명의 효과는 아라비돕시스 식물체 내에서 핵산 대사, 신호화, 대사와 같은 다양한 경로와 관련된 단백질 및 그 기능이 확인되지 않은 단백질을 포함하는 27개의 수모화 목적단백질을 제공하는 것이다. 또한 상기 단백질간의 결합 및 수모화 패턴이 독립적으로 확인되었다. 또한 수모화 타겟과 특정 수모화 효소간에 특이적 상호작용을 지님을 제공하는 것이다.
도 1은 아라비돕시스에서 AtSUMO1의 발현을 나타낸 것이다.
(A)는 아라비돕시스 형질전환체에서 AtSUMO1의 발현을 위해 사용된 이원 벡터의 구조를 나타낸 것이다. AtSUMO와 융합된 6xHis-3xFlag(HFAtSUMO1)는 pCAMBIA1300PT-유래 이원 벡터 내의 CaMV 35S 프로모터와 OCS 터미네이터 사이에 삽입되었다. (B)는 동형컨쥬게이션 T3 과발현 형질전환 식물 및 대조 식물(Col-0 및 HF 삽입된 벡터)에서의 HFAtSUMO1의 발현을 나타낸 것이다. 상기 식물체에서 분리된 조추출액(40 ㎍)을 SDS-PAGE에 의해 분리하였으며, 면역 블로팅 분석을 항-HA 항체를 사용하여 실시하였다. (C)는 MALDI-TOP MS에 의한 AtSUMO1 단백질 확인을 나타낸 것이다. MALDI-TOP 질량 분석기-기반 분석은 AtSUMO1로서 발현된 단백질 내의 펩티드 모티프 서열을 확인시켰다.
도 2는 HFSUMO1을 발현시키는 형질전환 식물의 표현형 및 열 충격-유도에 의한 SUMO 컨쥬게이션을 나타낸 것이다.
(A) 앱식산에 의한 뿌리 성장 억제가 HFSUMO1 과발현 형질전환 식물에서 감소된다는 것을 나타낸다. 3일령의 묘목은 10 mM 앱식산으로 보충되거나 앱식산이 없는 MS 배지로 이동되었으며 24℃에서 16-시간-명/8-시간-암의 일 광주기 하에서 유지되었다. 사진은 24일 후에 촬영하였다. (B)는 HFSUMO1 과발현 형질전환 식물에 열 처리 후 SUMO 컨쥬게이션 패턴을 나타낸 것이다. 10일령의 벡터 묘목 및 각각의 SUMO 과발현(#3-3, #12-5, #23-1, #4-1 및 #5-3)은 어둠 속에서 39℃의 열 충격에 30분간 노출되었다. 전체 단백질은 열 충격 되지 않거나(t=0) 열 충격 받은(t=30) 묘목으로부터 추출되었으며, 단백질 30 ㎍을 SDS-PAGE로 분리하였다. 면역 블로팅은 항-His-태그 항혈청으로 프로브되었다.
도 3은 벡터 대조군 및 AtSUMO1 (#12-5) 과발현 형질전환 묘목의 대표적 2차원 겔 이미지를 나타낸 것이다.
벡터 (A-Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ) 및 AtSUMO1 (B-Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ) 과발현 형질전환 묘목은 7일 동안 24℃에서 지속광원 하에서 액체 배양배지에서 성장되었으며, 39℃의 열 충격에 30분간 노출되었다. 등전점 전기 영동을 위해, 170 mg 단백질 전체는 pH 4-7L IPG 스트립(18 cm) 상으로 적가되었으며, 뒤이어 12% 겔 상에서 SDS-PAGE 분리되었으며 은 염색되었다. 화살표는 다양한 추정 SUMO 변형된 단백질을 나타낸다.
도 4는 효모 및 토바코 시스템에서 SUMO1과 추정 SUMO1 결합 단백질간의 상호작용의 확인을 나타낸 것이다.
(A)는 분할 유비퀴틴 시스템의 개략도 및 추정 SUMO1 결합 단백질을 지닌 SUMO1의 상호작용에 따른 적용을 나타낸 것이다. (B)는 효모 및 분할 유비퀴틴 시스템에서 SUMO1 및 추정 SUMO1 결합 단백질간의 상호작용을 나타낸 것이다. (C)는 N. 벤타미아나 잎에서 SUMO1 및 SUMO1 결합 단백질간의 상호작용을 나타낸 것이다. 추정 SUMO1 결합 단백질--NLuc 및 CLuc-SUMO1를 포함하는 아그로박테리움 스트레인으로 공동-침윤되는 N. 벤타미아나 잎의 LUC 이미지. (I; 벡터 대조군, Ⅱ; SGT1a-NLuc 및 CLuc-RAR1 Chen et al., 2007, Ⅲ; NLuc, Ⅳ; At3G08505-NLuc, Ⅴ; At3G08505K17R-NLuc, Ⅵ; At3G53390-NLuc, Ⅶ; At3G09260-NLuc 및 Ⅷ; At5G46280-nLuc). (D)는 추정 SUMO1 결합 단백질-NLuc 및 CLuc-SUMO1을 발현시키는 잎에서 LUC 활성의 정량화를 나타낸 것이다. (N; 벡터 대조군, P; SGT1a-NLuc 및 CLuc-RAR1 Chen et al., 2007, Vector; NLuc). 자료는 침윤 후 36시에 수집되었다. 상기 자료는 3개의 독립적 샘플의 ㅁ표준오차 평균으로 나타낸다.
도 5는 SUMO1 및 MCM3 (At5G46280) 단백질간의 특이적 상호작용 및 수모화 패턴을 나타낸 것이다.
(A) AtSUMO1은 효모 스플릿 유비퀴틴 시스템에서 MCM3 (At5G46280) 단백질과 특이적으로 상호작용한다. 나타난 것은 MCM3 (At5G46280) 단백질 및 SUMOs (SUMO1, SUMO1ΔGG 또는 SUMO3)와 상호작용으로 Cub 또는 Cub-SUMOs(SUMO1, SUMO1ΔGG 및 SUMO3) 융합을 각각 공동-발현하는 세포의 연속적 희석에 의해 나타나는 것이며, 트립토판 및 히스티딘 결핍 (대조군) 추가로 우라실 결핍(- Ura) 또는 5-FOA를 포함하는(+FOA) 플레이트 상에서 희석되었다. 단백질은 싱글 카피 벡터로부터 발현되었다. (B)는 E1 헤테로다이머의 서브 유니트로서 AtSAE1b를 사용하여 AtSUMO1에 의해 MCM3 (At5G46280) 단백질의 특이적 수모화 패턴을 나타낸 것이다. 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)은 각 컨스트럭트로 형질전환되었다. 형질전환된 E. coli 세포는 OD600이 1.0에 도달할 때까지 37℃에서 배양되었으며, 그 다음에 태그된 단백질의 발현 및 수모화는 25℃에서 0.4 mM IPTG로 밤새 유도되었다. 세포 용해물이 제조되었으며, 웨스턴 블로팅은 항-T7-태그 항체를 사용하여 실시되었다. 수모화된 MCM3 (At5G46280) 단백질은 성숙한 AtSUMO (GG) (GG로 나타냄)를 이용한 레인에서 더 높은 분자량으로 이동한 밴드로서 관찰되었으나 미성숙된 AtSUMO (AA) (AA로 나타냄)을 이용한 레인에서는 관찰되지 않았다. AtMYB30은 E. coli 시스템에서 수모화 분석을 위해 양성대조군으로서 사용되었다. 화살표는 수모화된 단백질을 나타낸다.
작은 유비퀴틴 모디파이어(SUMO) 펩티드 단백질의 가역적인 수모화(SUMOylation)는 동물과 효모의 많은 세포 과정에서 중요한 역할을 한다. 그러나 식물에서 SUMO 기질에 대해 알려진 것은 거의 없다. 단백질 분석학으로 아라비돕시스 내에서 SUMO 기질 확인 및 SUMO 단백질의 생물학적 기능을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 아라비돕시스 Col -0으로의 형질전환을 위해 CaMV35S 프로모터에 의해 조절되는 6xHis-3xFLAG와 융합된 AtSUMO1(HFAtSUMO1)을 조립하였다.
열 처리 후 증가된 수모화 패턴이 형질전환된 식물에서 검출되었다. SUMO1-변형 단백질은 2-차원 전기영동 (2-DE) 이미지 분석 후에 선별되었으며 매트릭스-보조 레이저-탈착 이온화 비행시간형 질량 분석기(MALDI-TOP MS)를 이용하여 확인되었다.
본 발명자들은 수모화 목적단백질로서 핵산 전사 복제, 신호화, 생체 대사와 같은 다양한 경로와 관련된 단백질과 그 기능이 확인되지 않은 단백질을 포함하여 27개의 단백질을 분리 확인하였다.
이들 단백질의 결합 및 수모화 패턴이 독립적으로 확인되었다. 놀랍게도 DNA 복제 허가 인자인 MCM3 (At5G46280)은 AtSUMO1과만 상호작용 하였으며 AtSUMO1에 의해서는 수모화되었으나 SUMO1ΔGG 또는 AtSUMO3에 의해서는 수모화되지 않았다. 이 결과는 수모화 타겟과 특정 수모화 효소간에 특이적 상호작용을 나타낸다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
1. AtSUMO1 아라비돕시스 형질전환체 식물의 컨스트럭션
아라비돕시스 내에서 SUMO-변형 단백질을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 His6-FLAG3와 융합된 AtSUMO1 컨스트럭트(HFAtSUMO1)를 조립하였으며, 아라비돕시스 형질전환체 식물을 만들었다. His6-FLAG3는 N-말단에 첨가되었으며, 컨스트럭트의 발현은 CaMV35S 프로모터의 대조군 하에서 발생되었다(도 1A). 프리 His6-FLAG3 컨스트럭트는 대조군 벡터로서 비교되었다. 25개 각각의 아라비돕시스 형질전환체는 하이그로마이신 내성을 이용하여 선별되었으며, 그 다음에 항-His 태그 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 선택되었다.
도 1B는 융합 단백질을 발현시키는 형질전환체 식물로부터 5개의 대표적 HFAtSUMO1의 단백질 발현 수준을 나타낸다. 항-His 태그 항혈청을 사용하는 웨스턴 블로팅 분석은 HFAtSUMO1 아라비돕시스 형질전환체 식물에서 두 개의 상이한 밴드를 나타냈다. 이 2개의 밴드는 C-말단 GG 모티프의 분할을 통해 목적단백질에 라이신 잔기를 공유 결합으로 결합시키는 SUMOs를 지니는 미성숙 및 성숙한 형태를 나타낸다.
형질전환체 식물에서 HFAtSUMO1 단백질의 과발현 여부를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 MALDI-TOP 질량 분석기를 이용하여 펩티드 질량 지문분석(PMF)을 실시하였다. 식물 유래 추출물을 히스티딘 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 정제된 샘플이 SDS-PAGE 분석에 적용되었으며 추정 HFAtSUMO1을 포함하는 밴드가 겔로부터 절단되었다. 절단된 단백질은 트립신에 의해 분해되었으며 MALDI-TOP 질량 분석기에 의해 확인되었다. 정제된 단백질의 펩티드 질량 지문분석은 SUMO1 펩티드 서열과 일치함을 나타냈으며 상기 단백질은 HFAtSUMO1 DNA 서열로부터 유래됨을 나타낸다(도 1C).
2. AtSUMO1 형질전환체 식물에서 열 스트레스에 따른 ABA 및 SUMO1 접합체의 축적에 의한 효과
SUMO1/2의 과발현은 앱시스산에 의해 매개되는 무생물적 스트레스 응답 반응을 억제하는 것으로 보고되었다. 또한 본 발명자들은 앱시스산이 HFAtSUMO1 아라비돕시스 형질전환체 식물에서 뿌리 성장에 영향을 미치는지 여부를 분석하였다.
도 2A는 ABA-매개 뿌리 성장 억제가 Col-0 및 공(empty) 벡터 대조군 식물과 비교시 AtSUMO1를 과발현시키는 식물에서 현저하게 감소된 것을 나타낸다. 더욱이 고 전이유전자 단백질 수준을 나타내는 형질전환체 식물은 (#3-3, #12-5 및 #23-1 라인) ABA-매개 뿌리 성장 억제의 현저한 감소를 보였다(도 2A).
동물에서 수모화는 다양한 환경 스트레스에 의해서 활성화되었으며, 일부 SUMO 타겟은 스트레스 응답 반응의 일부였다. 아라비돕시스에서 열 충격, H2O2, 에탄올 및 아미노산 유사 카나바닌과 같은 스트레스 조건에 묘목이 노출된 후 SUMO1 및 -2 접합체의 수준은 증가하였으나 SUMO3은 증가하지 않았다. 더욱이 SUMO2의 과발현은 정상적인 성장 조건 하에서 SUMO2 접합체의 정치상태 수준을 증가시켰으며 그 후 아라비돕시스 식물에서 열 충격-유도 축적을 나타내었다.
독립적 HFAtSUMO1 아라비돕시스 형질전환체에서 내부 SUMO 접합체를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 열 처리 후에 항-His 태그 항혈청을 사용하여 겔 블롯 분석을 실시하였다(도 2B). CaMV35S 프로모터에 의해 조절되는 AtSUMO1과 융합된 His6-FLAG3(HFAtSUMO1)에 있어서, SUMO 접합체는 스트레스가 없는 조건 하에서는 검출되지 않았다. 이 결과는 효모에서 얻은 SUMO 접합 자료와 일치하며, 아마도 AtSUMO1의 N-말단에서 His6-FLAG3 태그의 배치(placement)가 SUMO 컨쥬게이션의 효율을 감소시키기 때문이다. 하지만 컨쥬게이션의 패턴은 단백질 발현-의존 방식으로 시간과 양을 대폭 증가시켰다(도 2B).
따라서 #12-3 과발현이 2차원 분석에 의해 SUMO1-변형 단백질의 스크리닝을 위한 좋은 후보(candidate)로서 선택되었다.
3. 2차원 분석에 의한 SUMO1-변형 단백질의 확인
AtSUMO1와 융합된 His6-FLAG3(HFAtSUMO1)를 사용하여 (HFAtSUMO1)체내에서 SUMO-변형 단백질을 분리하기 위해서, 본 발명자들은 2차원을 갖춘 질량 분석기-기반 스크리닝을 실시하였다.
먼저 본 발명자들은 30분 동안 40℃에서 열 스트레스 처리 후에 벡터 대조군 식물과 비교시 형질전환체 식물을 과발현시키는 AtSUMO1의 SUMO-변형 단백질을 정제하기 위해서 Ni-NTA 크로마토그래피를 실시하여 분석하였다. 2차원 분석을 이용하여, 벡터 대조군과 AtSUMO1 형질전환체 식물간의 단백질 스팟의 차이점을 열-충격 처리 후에 비교하였다.
도 3은 벡터 대조군(도 3A) 및 HFAtSUMO1 형질전환체 식물(도 3B)에 관한 대표 이미지를 나타낸다. 새로운 단백질 스팟이 HFAtSUMO1 형질전환체 식물에서 검출되었으며, 이는 HFAtSUMO1에 의한 SUMO-변형 단백질의 출현을 나타낸다(도 3에서의 화살표). 전체로서 27 라인-특이적 단백질 스팟은 겔로부터 절단되었으며, 더욱이 MALDI-TOP MS에 의해 분석되었다.
절단된 단백질 스팟은 트립신으로 분해되었으며, 이 결과로 만들어지는 펩티드가 추출되었으며 MALDI-TOP MS를 이용하여 펩티드 질량 지문분석(PMF)에 의해 확인되었다. SUMO1-변형 단백질의 목록은 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
Figure pat00002

a. 예상된 수모화 자리는 http://www.abgent.com/tools/sumoplot_login의 프로그램에 의해 분석되었다.
이는 추정 SUMO 타겟이 DNA와 RNA-관련 과정, 신호 경로 및 일반적 대사와 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 일반적으로 SUMO 단백질은 대부분 핵 단백질이지만 수모화는 세포질에서도 일어나며 이러한 실험에서 확인된 일련의 추정 SUMO-변형 단백질은 핵과 세포질 단백질 모두를 포함한다. 최근에 Budhiraja et al (2009)은 SUMO 목적단백질이 크로마틴 구조, 스플라이싱 또는 번역의 조절과 같은 DNA-관련 또는 RNA-의존적 과정과 관련되어 있다는 것을 보고하였다.
또한 본 발명자들은 DNA 및 RNA-관련된 단백질을 분리하였으며 특히 MCM3 (At5G46280), UBA2A (At3G56860), SMC-유사 단백질 (At3G54670), 징크 핑거 패밀리 단백질 (At3G08505) 및 RAD54 (At3G19210)이었다. 흥미롭게도 질병 저항성 관련 단백질(At5G46500)이 발견되었다. 동시에 수모화된 단백질의 이러한 샘플은 SUMO 변형이 용해성 단백질에만 나타나는 것은 아니고, 유비퀴틴처럼 막에 위치한 신호화 기능을 지닐 수 있다. 추정 목적 단백질에서 특이성을 나타내며, 모든 SUMO1-변형 후보 단백질은 높은 확률의 모티프를 지니는 예상된 수모화 자리를 포함한다(표 1).
4. 체내에서 SUMO1 및 SUMO1-변형 단백질간의 상호작용
분리된 SUMO1-변형 단백질이 SUMO-단백질 접합체가 맞는지 확인하기 위해서, 본 발명자들은 효모 스플릿-유비퀴틴 분석 시스템을 사용함으로써 AtSUMO1가 5개의 대표적 SUMO1-변형 단백질과 직접적으로 상호작용하는지 여부를 밝혀냈으며, 유비퀴틴(Ub)의 N- 및 C-말단 절반(Nub 및 Cub)의 재조합(reassembly)을 기반으로 하고 있다. AtSUMO1 및 SUMO1-변형 단백질은 각각 Nub의 C-말단과 Cub의 N-말단과 융합되었다(도 4A). AtSUMO1가 SUMO1-변형 단백질과 직접적으로 상호작용하면, Nub 및 Cub은 천연-유사 Ub로 재조합된다(Varshavsky, 1996). 최종적으로 SUMO1-변형 단백질-Cub-RUra3p 및 Nub-AtSUMO1을 포함하는 세포는 우라실이 결핍된 플레이트 위에서는 성장할 수 없으나, 5-FOA를 포함하는 플레이트 위에서는 성장할 수 있으며, 이는 RUra3p에 의해 독성 5-플루오로우라실로 전환된다. 반대의 경우 효모 세포는 우라실 원영양체이거나 5-FOA 민감성이다(도 4A).
도 4B에 나타난 바와 같이, 세포 공동-발현 SUMO1-변형 단백질-Cub-RUra3p 및 Nub-AtSUMO1는 우라실이 결핍된 플레이트 위에서는 성장할 수 없으나, 5-FOA가 포함된 플레이트 위에서는 성장되었으며, 이는 AtSUMO1가 효과적으로 체내에서 SUMO1-변형 단백질을 지니는 안정한 콤플렉스를 형성한다는 것을 나타낸다. 음성 대조군에서 Nub-AtSUMO1과 Cub-RUra3p 사이의 상호작용은 관찰되지 않았다.
더욱이 본 발명자들은 징크 핑거 패밀리 단백질(At3G08505)K17R을 구성하였으며, 이는 지적한 추정 수모화 자리인 라이신 잔기에서 아미노산 치환(라이신을 아르기닌으로)을 수반하였다. 흥미롭게도 SUMO 단백질의 글리신 잔기와 공유결합을 형성하는 라이신 잔기를 결핍시킨 징크 핑거 패밀리 단백질 (At3G08505)K17R 변이체와 AtSUMO1의 공동-발현은 5-FOA 내성에는 영향을 미치지 않았으며 이는 AtSUMO1가 징크 핑거 패밀리 단백질 (At3G08505)K17R 변이체와 여전히 상호작용 한다는 것을 시사한다. 이는 징크 핑거 패밀리 단백질(At3G08505)이 AtSUMO1와의 비공유 상호작용에 참여하거나 다른 수모화 자리를 인식하거나 변형(switch)하는 것을 짐작케 한다. 동물에서 Minty et al. (2000)은 SUMO-상호작용 모티프(SIM)로서 소수성 및 산성 아미노산에 의해 둘러싸인 Ser-Xaa-Ser 모티프를 정의하였다. SUMO-상호작용 단백질 중에서, 일부 징크 핑거-포함 단백질은 DNA 복구 또는 전사 리프레션과 같은 과정과 관련되어 측정되었다(Hecker et al., 2006).
효모 분석을 대체함으로써 본 발명자들은 AtSUMO1-변형 단백질이 식물의 생리학적 조건하에서 AtSUMO1과 상호작용하는지 여부를 조사하였다. 아그로박테리움-기반 토바코 LUC 일시 발현 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 반딧불 LUC를 위한 기질인 루시페린의 첨가 후에 AtSUMO1와 AtSUMO1-변형 단백질 사이의 상호작용을 테스트하였다.
도 4C에 나타난 바와 같이 CLuc-RAR1 및 SGT1a-NLuc의 공동-발현은 양성 대조군으로 토바코 잎에서 강한 LUC 활성을 유도한다(도 4C-Ⅱ; Chen et al., 2008). 대조적으로 벡터 대조군으로서 CLuc와 공동발현된 NLuc는 LUC 활성을 나타내지 않았다(도 4C-Ⅲ). 비록 LUC 활성 수준이 상이한 타겟에 따라서 다를지라도(도 4D), CLuc-AtSUMO1 및 AtSUMO1-변형 단백질-NLuc의 공동-발현은 벡터 대조군의 LUC 활성과 비교시 더 높은 수준의 LUC 활성을 나타냈다. 이 결과는 효모 스플릿 유비퀴틴 분석으로부터 얻은 자료와 일치한다. 따라서 상기 결과는 본 실험에서 분리된 SUMO-변형 단백질이 진짜 SUMO 목적단백질을 나타낸다는 것을 의미한다.
5. SUMO1와 MCM3(At5G46280) 단백질간의 특이적 상호작용과 수모화 패턴
아라비돕시스는 8개의 SUMO 유전자를 포함한다(Kurepa et al., 2003; Novatchkova et al., 2004). 이 중 오직 4개(SUMO1, SUMO2, SUMO3 및 SUMO5)만이 높이 발현하며, 기능적이고 아마 가장 중요한 것이다. SUMO1 및 SUMO2가 가장 밀접하게 관련되어 있으며, SUMO2는 SUMO1과 89% 단백질 서열 상동성을 공유하며, 반면에 SUMO3는 48% 상동성을 나타내며, SUMO5는 오직 35%의 상동성을 나타낸다. 이것은 각각의 SUMOs는 별개의 타겟을 지니며, 기능적 다양성이 존재한다는 것을 의미한다. 그러므로 본 발명자들은 MCM3 (Mini Chromosome Maintenance3; DNA 복제 허가 인자; At5G46280) 단백질을 사용함으로써 SUMO-변형 단백질이 우선적으로 SUMO1, SUMO1ΔGG 또는 SUMO3과 결합하는 여부를 조사하였으며, 이들은 복제 개시에 중요한 역할을 한다 (Stevens et al., 2002).
도 5A에 나타난 바와 같이, SUMO1은 특별히 MCM3 단백질과 결합하였으며, 반면에 SUMO1ΔGG 또는 SUMO3 모두는 효모 스플릿 유비퀴틴 분석에 의해 확인된 것처럼 이 단백질을 변형시키지는 않았다. 이 결과는 MCM3 단백질이 수모화시 SUMO1과만 공유결합적으로 상호작용한다는 첫 번째 증거를 제공한다.
SUMO1에 의한 MCM3 (At5G46280) 공유결합적 변형의 상세한 조사를 위해, 본 발명자들은 E. coli.에서 수모화 분석 시스템을 사용하여 AtSUMO1 및 AtSUMO3의 수모화 패턴을 조사하였다. 최근에 AtMYB30는 E. coli.에서 수모화 분석을 위한 AtSUMO1/2/3 및 5의 모델 SUMO 목적단백질로 사용되었다(Okada et al., 2009). AtSUMO1 및 AtSUMO3을 C-말단 Gly-Gly 서열에 노출시켜 변형된 AtSUMO1(GG) 또는 AtSUMO3(GG)은 목적단백질에 공유결합적으로 부착되기 위해 필요하다.
음성 대조군으로 C-말단 Gly-Gly가 Ala-Ala로 변이된 AtSUMO1 또는 AtSUMO3인 AtSUMO1(AA) 또는 AtSUMO3(AA)이 각각 구성되었다. 도 5B에 나타난 바와 같이, 수모화 반응은 기질로서 MCM3 단백질 (At5G46280)을 지닌 AtSUMO1 또는 AtSUMO3를 이용하여 E. coli에서 실시되었다. 양성 대조군으로 AtMYB30는 AtSUMO1(GG) 또는 AtSUMO3(GG)에 의해 각각 수모화되었다. 기질로서 MCM3 단백질 (At5G46280)은 AtSUMO1(GG)에 의해 강하게 수모화되는 반면에, AtSUMO3(GG)는 인식되거나 변형되지 않았다. 따라서 이 결과는 식물에서 수모화된 단백질이 상이한 SUMO 단백질에 의해 특이적으로 수모화된다는 것을 의미한다.
수모화는 다양한 생물학적 기능을 조절한다. 주로 동물 및 효모로 얻은 예는 세포분열 및 DNA 복구와 전사에 작용을 한다. 대조적으로 적은 수의 식물 SUMO 타겟만이 확인된 자료를 가지며, 이들의 기능은 분자 수준에서 분석되었다. 아주 일반적인 의미에서, 식물 SUMO 단백질은 개화시기의 조절, 생물 또는 무생물 스트레스 응답 반응 조절과 관련이 있다. 식물에서 수모화의 의미를 더 이해하기 위해서, 본 발명자들은 본 연구에 있어서 질량 분석기-기반의 프로테오믹스 접근을 이용하여 아라비돕시스 형질전환체 과발현 AtSUMO1에서 목적단백질을 확인함으로써 SUMO-결합 단백질을 스크리닝하였다.
이 결과를 기초로 하여, SUMO-변형 단백질은 식물 세포에서 발견되었으며 이는 수모화가 핵 뿐만 아니라 세포질에서의 다양한 기능과 관련되어 있음을 나타낸다. 더욱이 기질로서 MCM3 단백질(At5G46280)은 특이적으로 SUMO3가 아니라 SUMO1에 의해 수모화되며, 이는 각각의 SUMOs가 별개의 타겟을 지닌다는 것을 시사한다. 모두 종합해 보면, 우리의 연구는 지식을 확장시켰으며, 식물에서 수모화 기능에 관한 통찰력을 제공한다. SUMO 변형의 조건-특이적 타켓인 다양한 단백질의 수모화를 유도하는 정확한 메커니즘은 추가 연구에 관한 중요한 분야가 될 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
(실시예 1) 식물 재료와 ABA 처리
야생형 아라비돕시스 탈리아나 콜롬비아-0(Col -0)가 이 실험에 사용되었다. 종자는 4℃에서 3일 동안 표면 살균, 층상화되었으며 그 다음에 1x Murashige 및 Skoog basal 염 혼합물, 3% 수크로오스, 2.5 mM MES, pH 5.7 및 0.8% 한천 또는 토양을 포함하는 페트리 플레이트의 배지에 파종되었다. 식물은 22℃에서 100 μ㏖ m-2s-1빛의 세기 및 상대 습도 57~80%의 16/8 시간 명/암 조건 하에서 성장되었다. 앱시스산에 의한 뿌리 성장의 억제를 연구하기 위해서, 4일령의 묘목은 앱시스산이 보충된 플레이트 상으로 이동되었다. 뿌리 성장은 성장 평가 기간의 시작과 끝 사이의 뿌리 길이의 차이로서 측정되었다. 14일령의 묘목을 사진 찍었다.
(실시예 2) 플라스미스 컨스트럭트 및 식물의 형질전환
아라비돕시스 형질전환체 식물 과-발현 AtSUMO1를 생성하기 위해서, 단백질 암호 영역은 아라비돕시스 탈리아나 cDNAs를 사용하여 RT (역전사)-PCR에 의해 증폭되었다. AtSUMO1와 융합된 6xHis-3xFlag(HFAtSUMO1)는 pGEM -T Easy 벡터(Promega, Madison, WI, 미국)로 클로닝되었으며, 정확한 DNA 서열을 확인하기 위해서 서열화되었다. 그 다음에 적절한 제한효소를 이용하여 pCAMBIA1300PT-유래 벡터로 서브-클로닝되었다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 스트레인은 30℃에서 50 mg/L 겐타마이신, 50 mg/L 리팜피신 및 50 mg/L 카나마이신을 지니는 LB 액체 배양액에서 성장되는 컨스트럭트 과-발현 HFAtSUMO1을 포함하였다. Col -0 식물은 이전에 기술된 바와 같이(Clough & Bent 1998; Park et al. 2009) 프로럴 딥(floral deep) 방법에 의해 형질전환되었다. 하이그로마이신-내성 형질전환체 식물은 30 mg/L 하이그로마이신을 포함하는 1x MS 배지 위에서 선택되었다.
(실시예 3) 면역 블로팅 분석
식물 조직은 동결되었으며 액체 질소에서 약자 사발과 막대로 가루로 만들었다. 단백질 추출물은 단백질 추출 완충용액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5% NP40, 1 mM EDTA, 3 mM DTT, 1x Complete Protease Inhibitor (Roche), 1mM 페닐메틸술포닐 플루오르]에서 제조되었다. 20분 동안 14,000 rpm에서 두 번 원심분리한 후, 상청액은 즉시 사용되거나 -80℃에서 저장되었다. 단백질 원심분리는 단백질 분석 키트를 사용하여 측정되었으며, 전체 단백질의 40 mg이 SDS-PAGE에 의해 분리되었으며, 폴리비닐리덴 디플로라이드 막으로 이동되었고, 항-His 항체로 프로브되고, ELC 웨스턴 블롯 검출 시스템(Amersham Biosciences)을 사용하여 검출되었다.
(실시예 4) 2차원 분석 및 MALDI-TOP MS
SUMO 접합체는 제조자의 지침(Qiagen, Valencia, CA)에 따라 니켈-니트릴로트리아세트산 아가로스 (Ni-NTA) 수지를 사용하여 친화성 정제되었다. 정제된 단백질은 항HA-항체를 사용하여 면역 블로팅 분석에 의해 실험되었다. 정량화된 단백질(170 ㎍)은 샘플 완충용액에서 혼합되었으며 그 다음에 IEF 겔 (18 cm 튜브 겔) (OFarrell, 1975) 상으로 로드되었다. 2차원에서, 단백질은 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리되었으며, 글루타르알데히드 없이 은 염색에 의해 시각화되었다(Blum et al., 1987). 겔 이미지는 GS-800 Imaging Densitometer (Bio-Rad)를 사용하여 스캔, 소프트웨어 PDQuest 버전 7.2.0 (Bio-Rad)으로 분석되었다. 각 샘플에 대한, 정량화는 3개의 독립적 생물학적 복제품(replicas)으로부터 유래한 3개의 분석 겔로 실시되었다. 은-염색된 단백질 스팟은 겔로부터 절단, 겔-트립신 분해는 이전에 기술된 바와 같이 추출되었다(Kim et al., 2004). 펩티드 질량 지문분석은 이전에 보고된 방법(Kim et al., 2004)에 따라 Voyager-DE STR MALDI-TOF 질량 분석기(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, 미국) 상에서 수행되었다. 데이터 처리를 위해서 소프트웨어 패키지 PerSeptive-Grams가 사용되었다.
(실시예 5) 효모 스플릿 유비퀴틴 분석
효모 스플릿 유비퀴틴 분석은 이전에 기술된 바와 같이(Laser et al., 2000; Yoo et al., 2005) 실시되었다. 사카로마이세스 세레비지애 스트레인 JD53은 모든 실험을 위해 사용되었다. 추정 SUMO1-결합 cDNAs은 효모 Ste14를 대체 하는 pMET-Ste14-Cub-RUra3으로 클로닝되었다. AtSUMO1, AtSUMO1ΔGG 및 AtSUMO3 cDNAs는 각각 효모 Sec62를 대체하는 pCup-Nub-Sec62 벡터의 변형 버전으로 클로닝되었다(Stagljar, et al., 1998). 단백질의 각 쌍 사이의 상호작용은 2 mg/ml 5-FOA를 포함하는 선택배지 및 우라실 결핍 선택배지 상에서 테스트되었다. 별도로 기술되지 않는다면 플레이트는3~5일 동안 30℃에서 배양되었다.
(실시예 6) 토바코 식물에서 아그로박테리움-매개 일과성 발현 분석
7주령의 N. 벤타미아나(benthamiana)는 아그로박테리움-매개 일과성 발현을 위해 사용되었다. AtSUMO1은 pCambia1300 - cLUC으로 클로닝되었으며 추정 SUMO 결합 단백질을 인코팅하는 유전자는 pCambia1300 - nLUC에 각각 클로닝되었다(Chen et al., 2008). DNA 컨스트럭트는 아그로박테리움 투메파시엔스 스트레인 GV3101으로 도입되었다. 28℃에서 10 mM MES 완충용액, 20 mM 아세토시린곤 및 적절한 항생제로 보충된 Luria-Bertani 배지에서 성장된 박테리아가 항생제의 독성을 피하기 위해서 침윤용액(10 mM MgCl2, 10 mM MES 완충용액 및 100 mM 아세토시린곤)으로 두 번 세척되었다. 더욱이 유전자 침묵의 억제인자인 p19으로 형질전환된 아그로박테리움이 배양 및 제조되었다 (Lakatos, et al., 2004). 공동-침윤을 위해 각각의 아그로박테리움 배양액은 최종 침윤 용액에서 OD600 = 0.5이었으며 동일한 부피에서 혼합되었다. 박테리아 서스펜션은 무바늘 주사기를 사용하여 토바코 잎으로 침윤되었다. 침윤 후에, 식물은 즉시 플라스틱 백으로 덮였으며, 36시간 동안 23℃ 하에 두었다. 토바코 잎은 용액중에서 1 mM 루시페린으로 세 번 분사되었으며, EM CCD 카메라(iXon, Andor Technology plc, Belfast, 아일랜드)에 의해 이미지화되었다. 생물발광은 어둠 속에서 5분 동안 ??칭된 후 기록되었다.
(실시예 7) E. coli 내에서의 수모화 분석
E. coli 내에서의 수모화 분석이 이전에 기술된 바와 같이(Okada et al., 2009) 실시되었다. 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) 세포는 pACYCDuet-AtSAE1b-AtSAE2 및 pCDFDuet-AtSUMO1/3 (AA or GG)-AtSCE1a으로 형질전환되었다. 형질전환된 세포는 컴피턴트 세포의 제조를 위해 사용되었다. 체내의 수모화 반응을 위해서, 컴피턴트 세포는 각각 pET28a-AtMYB30 또는 pET28a-At5g46280으로 형질전환되었다. 형질전환된 세포는 OD600이 1.0이 될 때까지 37℃에서 5 ml의 LB 배지에서 배양되었으며 뒤이어 0.4 mM IPTG가 첨가되었다. 25℃에서 약 12시간 배양 후, 2 ml의 배양 세포가 수확되고, 1xPBS 완충용액으로 세척 및 200 ul의 1xPBS 완충용액으로 현탁되었다. 샘플은 초음파처리에 의해 용해되었으며, 샘플을 5분 동안 95℃에서 끓였다. 전체 단백질의 20 ㎕은 7.5% 연속적 그라디언트 겔(continuous gradient gel)로 로드되었으며, 폴리비닐리덴 디플로라이드 막으로 이동, 항-T7 항체로 프로브되고, ECL 웨스턴 블롯 검출 시스템 (Amersham Biosciences)을 이용하여 검출되었다.

Claims (4)

  1. 아라비돕시스 내의 작은 유비퀴틴 모디파이어(SUMO)-변형 단백질에 있어서, 상기 SUMO-변형 단백질은 하기 아라비돕시스 게놈 이니셔티브(AGI) 코드 At5G46280, At3G56860, At3G54670, At3G08505, At3G19210, At2G37160, At3G53390, At3G60240, At5G46500, At3G47290, At4G02930, At1G45000, At5G03860, At3G09260, At2G13440, At4G37930, At1G11860, At5G49360, At3G26650, At1G13440, At2G46110, At5G60160, At4G31990, At1G48030, At3G19870, At2G16760, At4G26920으로 표시되는 27개의 단백질임을 특징으로 하는 아라비돕시스 내의 SUMO-변형 단백질
  2. 제 1항에 있어서, 상기 SUMO-변형 단백질은 Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg의 아미노산 서열을 지닌 수모화 영역, Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe Phe Arg의 아미노산 서열을 지닌 수모화 영역 또는 Gln Ser Val Asp Met Asn Ser Ile Ala Phe Leu Phe Asp Gly Arg의 아미노산 서열을 지닌 수모화 영역을 지님을 특징으로 하는 SUMO-변형 단백질
  3. 제 1항의 SUMO-변형 단백질을 과발현시키는 열 스트레스 저항성을 지닌 형질전환 아라비돕시스 식물체
  4. 제 3항에 있어서, 상기 형질전환 아라비돕시스 식물체는 제 1항의 SUMO-변형 단백질을 암호화시킨 cDNA를 포함한 T-플라스미드 벡터를 아그로박테리움 균주를 이용하여 야생형 아라비돕시스 식물 세포에 감염 형질전환 시킨 후 성장시켜 제조된 식물체임을 특징으로 하는 SUMO-변형 단백질을 과발현시키는 열 스트레스 저항성을 지닌 형질전환 아라비돕시스 식물체
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110079547A (zh) * 2019-04-29 2019-08-02 清华大学 eIF4G蛋白在调控植物对ABA耐受性中的应用
CN116121298A (zh) * 2023-04-18 2023-05-16 河南大学三亚研究院 抑制hsrp1基因的表达在提高植物耐热性中的应用

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CN110079547A (zh) * 2019-04-29 2019-08-02 清华大学 eIF4G蛋白在调控植物对ABA耐受性中的应用
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