CN104630153A - 一种猪伪狂犬病病毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明从发病猪群中分离到一株新型猪伪狂犬病病毒株，代号为PRV-HBWH/2014，并对该病毒株进行了生物保藏，于2014年6月保藏在中国典型培养物保藏中心，微生物保藏号是：CCTCC NO：V201439。通过分子生物学的技术分析，该病毒株的gE基因的部分核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示。本发明所分离的毒株为中国PRV的主要流行株，可作为制备猪伪狂犬病疫苗的毒种。

Description

一种猪伪狂犬病病毒株及其应用

技术领域

本发明属于动物病毒分离技术领域，具体而言，涉及一种猪伪狂犬病毒HBWH/2014，以及该病毒株在制备疫苗中的应用。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的多种家畜和野生动物均可感染的急性传染病，以发热、流产、死胎、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症状，其中对猪的危害最大，并且猪是唯一的自然宿主。猪群一旦感染后耐过，则为隐性感染并长期带毒、排毒，成为猪场最主要的传染源。目前，伪狂犬病被认为是威胁养猪生产和引起死亡的主要疫病之一，中国将其列为二类传染病，OIE将其列为法定报告动物疾病的B类多种动物共患病。

疫苗接种是目前公认的有效防制猪伪狂犬病最经济、有效的方法。国内外制备的免疫猪伪狂犬病疫苗以伪狂犬病病毒株Bartha-K61和BUK等基因缺失弱毒活疫苗为主，但在实际生产中，该病并没有得到有效的控制，个别地区大规模爆发的现象依然存在，流行毒株是否发生变异，必须对其进行进一步的分离及研究。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明目的在于提供一种猪伪狂犬病病毒株，以及该病毒株在制备疫苗中的应用。

为了实现本发明的目的，发明人从发病猪群中分离到一株新型猪伪狂犬病病毒株(Herpesoviridae,Vesiculovirus,Pseudorabies virus)，代号为伪狂犬病毒HBWH/2014，并对该病毒株进行了生物保藏，于2014年11月26日保藏在中国典型培养物保藏中心,地址为中国武汉武汉大学，微生物保藏号是：CCTCC NO：V201439。通过分子生物学的技术分析，该病毒株的gE基因的部分核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

需要说明的是，为了获得上述新型猪伪狂犬病病毒株，发明人对传统病毒分离方法进行了改进，首先接种大耳白兔，然后接种BHK-21细胞，通过改进法和传统法的对比试验，证实了改进法显著提高了病毒的分离率1.55倍。本发明将所分离病毒颗粒进行电镜负染观察，结果显示：可见不规则圆形，有衣壳及囊膜的病毒粒子，直径约为110-180nm。

进一步地，发明人通过BHK-21细胞传代，进行了生物学特性试验如病毒增殖、血清中和试验、病毒TCID₅₀测定、本动物回归试验、理化特性检测，试验结果证实该毒株在BHK-21细胞上增殖快、滴度高，HBWH/2014病毒株对目前流行株具有较好的保护效果，是很好的候选疫苗毒株。

本发明对伪狂犬病毒HBWH/2014株与国内外报到的15株PRV分离株进行gE基因核苷酸同源性比较分析。该毒株与Fa株AF403049同源性较高，同属于一个分支，但通过核苷酸序列对比发现存在一定的基因突变现象。分析结果证实本发明所分离的毒株为中国PRV的主要流行株，可作为制备猪伪狂犬病疫苗的毒种。

附图说明

图1：伪狂犬病毒HBWH/2014病毒株分离培养(A为正常BHK-21细胞；B为接种病料出现病变的细胞)。

图2：伪狂犬病毒HBWH/2014病毒株负染形态学电镜图(A：放大15万倍；B：放大10万倍)。

图3：伪狂犬病毒HBWH/2014病毒株gE基因进化树。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1：猪伪狂犬病病毒的大耳白兔增强分离法

湖北省某地猪场发生疑似猪伪狂犬症状病例，经过病原学检测为猪伪狂犬病病毒阳性，因而挑选有典型症状的病猪进行病毒分离工作，具体步骤如下：

1.无菌采集发病猪的脑、脾脏，称重后分别按1:5的重量比加入灭菌生理盐水，匀浆后经超声波破碎处理，反复冻融3次后以3000r/min离心15min，取上清加青(链)霉素双抗至2000IU/ml，放置4℃冷藏过夜，无菌检测合格后，分别皮下接种5只1.5kg大耳白兔，每只5ml。24小时内死亡的大耳白兔弃去，此后每12小时观察一次，连续观察7d，将出现神经症状和奇痒抓腹动作的大耳白兔的脑和脾脏取出，置4℃冷藏。

2.将不同时间发病的病料收集在一起，称重后分别按1:10的重量比加入MEM液体培养基(含青(链)霉素2000IU/ml)，匀浆后经超声波破碎处理，分别接种长有70-80％幼仓鼠肾传代细胞(BHK-21细胞)25cm²细胞瓶，每瓶1ml，连续观察5d，细胞病变达 80％时收获病毒液可置-70℃保存备用。

3.连续传代培养，病毒培养液的10％含量接入尚未形成单层的接种用BHK-21细胞，37℃吸附1h，加入含2％犊牛血清的MEM维持液，37℃培养5d。第二代培养96h，收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒观察细胞病变(CPE)，结果显示：相比正常细胞，感染病毒的细胞膨大，圆缩，继而开始脱落逐渐形成空斑病灶，并且有“拉网”现象，见图1(A为正常BHK-21细胞；B为接种病料出现病变的细胞)。经蚀斑克隆纯化，最终获得一株猪伪狂犬病毒毒株，命名为伪狂犬病毒HBWH/2014。将该伪狂犬病毒HBWH/2014毒株于2014年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为中国武汉市武汉大学，微生物保藏号是：CCTCC NO：V201439。

实施例2：伪狂犬病毒HBWH/2014病毒株的鉴定 

1、电镜负染观察

经培养5-7d后，病变细胞上清蔗糖梯度超速离心，分离病毒颗粒进行电镜负染观察。

结果显示：可见不规则圆形，有衣壳及囊膜的病毒粒子，直径约为110-180nm，见图2(A：放大15万倍；B：放大10万倍)。

2、病毒的组织培养半数致死量(TCID₅₀)测定

取引起CPE的分离株的5代细胞培养物反复冻融3次，用维持液将病毒分别作10^-1～10^-9系列稀释，分别接种在已长满BHK-21单层细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度接种6孔，每孔0.1mL，37℃吸附1h后加入维持液，置5％CO₂培养箱37℃培养，同时设只加维持液的细胞作对照，连续3日观察细胞病变并记录结果，按Reed-Muench氏法计算分离毒株的TCID₅₀。

结果显示：以微量法分别测得分离株病毒在BHK-21细胞上的TCID₅₀分别为10^-7.80/100μL，表明在BHK-21细胞上的感染力很强。

3、血清中和试验

采用固定病毒稀释血清法，将PRV标准阳性血清作10倍系列稀释，使其稀释度为10^-1～10^-9，然后分别与等量200TCID₅₀混匀，置于37℃作用1h，分别接种96孔细胞板，每个稀释度6孔，每孔0.1mL，同时设标准阳性血清、阴性血清及只加维持液的细胞对照，置5％CO2培养箱37℃培养,连续3日观察细胞病变并记录结果。按Reed-Muench氏法计算血清中和指数。判定标准为待检血清的中和指数大于50，即可判为阳性，10～49为可疑，小于10为阴性。

结果显示：PRV标准阳性血清对分离株病毒的中和指数为1∶356(大于50)，结果为阳性；中和试验表明PRV标准阳性血清对分离株病毒有中和能力。

4、动物回归试验

取6只家兔，接种前饲养观察2d并对其心跳、呼吸、体温等生理指针进行检测，正常者，其中2只腹侧皮下注射病毒细胞培养液2mL/只,另外2只腹侧皮下注射病料混悬液2ml/只，另设2只注射Hank’s液2ml/只作对照，观察家兔发病情况。隔离饲养，观察记录后销毁。

结果显示：注射细胞培养物后24h，家兔开始表现兴奋不安，食欲下降，48h后不断低头用舌舔、嘴啃或用爪抓接种部位，明显出现瘙痒症状，接种部位被毛脱落、皮肤潮红、出血，暴露出红色肌肉，体温升高，呼吸急促，至72h四肢麻痹，角弓反张，后抽搐而死；注射病料混悬液的家兔出现症状较晚，大约36～48h后开始表现不安，临床表现与注射细胞培养物的家兔相同；96h后试验组全部死亡。对照组家兔健康无任何症状。

5、理化特性检测

核酸型鉴定取BHK-21细胞4瓶细胞长满单层后向其中2瓶细胞加入5-溴脱氧尿核苷终浓度50g/ml,另2瓶细胞不做任何处理用病毒液分别接种上述细胞,37℃吸附1h,弃病毒液加入维持液观察细胞病变同时设立2瓶阴性对照。

氯仿敏感性试验把经氯仿处理的病毒液接种至BHK-21细胞,同时设立不处理对照组和细胞阴性对照组,置37℃,50ml/L CO₂培养箱培养逐日观察细胞是否产生病变。

结果显示:经5-溴脱氧尿核苷处理的试验组能明显抑制BHK-21细胞病变，经氯仿处理的试验组没有出现CPE，而未处理的病毒对照组均在处理后第36小时出现明显的CPE，细胞对照组无变化。

实施例3：猪伪狂犬病毒gE基因测序检测 

1、引物的设计与合成

参考GenBank中以报到的猪伪狂犬病毒gE基因序列设计，

上游引物P1：5’GCGGCCCTTTCTGCTGCG3’；

下游引物P2：5’AGCGGGGCAGGACATCAA3’。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、PCR扩增

PCR反应体系体积为50μL，其中10μmol/L浓度的上下引物各1μL，DNA模板5μL， 2×EasyTaq PCRMix 25μL，剩下添加ddH₂O至50μL。反应程序：97℃10min，72℃4min；95℃1min，65℃退火2min，72℃2.5min，34个循环；72℃10min。

3、PCR产物克隆和测序

PCR产物的克隆与鉴定连接反应体系为10μL，依次加入PCR产物5μL、pMD18-T载体1μL、连接缓冲液4μL，16℃连接4h。取5μL连接产物转化至制备好的DH5α感受态细胞，涂于含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16h。从平板上挑取单菌落接种于3mL含氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养16-20h。提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ酶切质粒后电泳，按分子量大小初步筛选阳性菌株，鉴定阳性重组质粒。将酶切鉴定为阳性的重组质粒送到上海生工生物工程有限公司测序，然后利用基因分析软件DNAStar对测序结果进行分析比较。

结果显示：本发明对伪狂犬病毒HBWH/2014株与国内外报到的PRV分离株(AY183124、湖北Ea株AF171937、广东SH株EF552427-China、AF207700、美国Becker株AY368490、FJ605135、JF460026、JX417716、Fa株AF403049、河南焦作株EU561349-China、Malaysia株FJ176390、GZ-Z1株HQ832846、西班牙NiA3株EU502923、Rice株M14336、MIN-A株AY170318)进行gE基因核苷酸同源性比较分析，该病毒株的gE基因的部分核苷酸序列如序列表中的序列1所示，其gE基因进化树见图3。该毒株与Fa株AF403049同源性最高为98％，最低的为97％的Rice株M14336，通过与Fa株AF403049核苷酸序列对比发现存在一定的基因突变现象。分析结果证实本发明所分离的毒株为中国PRV新的流行株，可作为制备猪伪狂犬病疫苗的新毒种。

实施例4：伪狂犬病毒HBWH/2014株和PRV-HBXS/2014株TCID₅₀对比

将本实验室保藏的伪狂犬湖北株PRV-HBXS/2014株(武汉大学菌种库保藏号：CCTCC V201420)与本发明提供的伪狂犬病毒HBWH/2014毒株进行病毒半数组织细胞感染量(TCID₅₀)进行对比，比较哪种毒株的毒力更强。

结果显示：伪狂犬病毒HBWH/2014株TCID₅₀为10^-7.80/100μL高于PRV-HBXS/2014株的10^-6.20/100μL，说明该毒株在BHK-21具有更强的感染力。具体见表1。

表1伪狂犬病毒HBWH/2014株和PRV-HBXS/2014株TCID₅₀对比表

	HBWH/2014株	HBXS/2014株
			细胞病变时间(h)	48	72
TCID50测定	10-7.80/100μL	10-6.20/100μL

实施例5：改进猪伪狂犬病病毒分离法和传统方法的比较试验

采用传统猪伪狂犬病病毒分离法和本发明大耳白兔增强分离法，进行猪伪狂犬病病毒分离率比较。同一份样品同时采用两种方法进行病毒的分离和鉴定，比较分离率和效价。

样品为2014年湖北省各地市州新鲜疑似猪伪狂犬病样品105份。具体操作方法如下：实施例1已经介绍了猪伪狂犬病毒大耳白兔增强分离法；传统猪伪狂犬病病毒分离法则是在本发明的方法中省略去了大耳白兔的接种病毒增强试验，直接用病料样品接种BHK-21细胞进行分离。我们对两种方法从细胞病变代次、TCID₅₀测定、病毒分离率这几个数据进行比较。结果见表2。

表2传统法和改进法效果比较表

注：1.传统传代法简称“传统法”，改进传代法简称“改进法”。

2.n为待检样品的数量。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北省农业科学研究院畜牧兽医研究所

<120>  一种猪伪狂犬病病毒株及其应用

<160>  1   

<210>  1

<211>  1673

<212>  DNA

<213>  猪伪狂犬病病毒

<400>  1

accgaggccc cgagcctctc cgccgagacg accccgggcc ccgtcaccga ggtcccgagt        60

ccctcggccg aggtctggga cgacctctcc accgaggccg acgacgatga cctcaacggc       120

gacctcgacg gcgacgaccg ccgcgcgggc ttcggctcgg ccctcgcatc cctgagggag       180

gcgcccccgg cccatctggt gaacgtgtcc gagggcgcca acttcaccct cgacgcgcgc       240

ggcgacggcg ccgtgctggc cgggatctgg acgttcctgc ccgtccgcgg ctgcgacgcc       300

gtgtcggtga ccacggtgtg cttcgagacc gcgtgccacc cggacctggt gctgggccgc       360

gcctgcatcc ccgaggcccc ggagatgggc atcggcgact acctgccgcc cgaggtgccg       420

cggctccggc gcgagccgcc catcgtcacc ccggagcggt ggtcgccgca cctgagcgtc       480

ctgcgggcca cgcccaacga cacgggcctc tacacgctgc acgacgcctc ggggccgcgg       540

gccgtgttct ttgtggcggt gggcgaccgg ccgcccgcgc cggcggaccc ggtgggcccc       600

gcgcgccacg agccccgctt ccacgcgctc ggcttccact cgcagctctt ctcgcccggg       660

gacacgttcg acctgatgcc gcgcgtggtc tcggacatgg gcgactcgcr cgagaacttt       720

ascgccacgc tggastggta ctacgcgcgc gcgcccccgc ggtgcctgct rtactacgtg       780

tacgagccct gcatctacca cccgcgcgcg cycgagtgcc tgcgcccggt ggacccggcg       840

tgcagcttca cctcgycggc gcgcgcgcgg ctggtggcgc gccgcgcgta cgcctcgtgc       900

agcccgctgc tcggggaccg gtggctgacc gcctgcccct tcgacgcctt cggcgaggag       960

gtgcacacga acgccaccgc ggacgagtcg gggctgtacg tgctcgtgat gacccacaac      1020

ggccacgtcg ccacctggga ctacacgctc gtcgccaccg cggccgagta cgtcacggtc      1080

atcaaggagc tgacggcccc ggcccgggcc ccgggcaccc cgtggggccc cggcggcggc      1140

gacgacgcga tctacgtgga cggcgtcacg acgccggcgc cgcccgcgcg cccgtggaac      1200

ccgtacggcc ggacgacgcc cgggcggctg tttgtgctgg cgctgggctc cttcgtgatg      1260

acgtgcgtcg tcgggggggc catctggctc tgcgtgctgt gctcccggcg ccgggcggcc      1320

tcgcggccgt tccgggtgcc gacgcgggcg cggacgcaca tgctctctcc ggtgtacacc      1380

agcctgccca cgcacgagga ctactacgac ggcgacgacg acgacgacga ggaggcgggc      1440

gtcatccgcc ggcggcccgc ctcccccggc ggagacagcg gctacgaggg gccgtacgcg      1500

agcctggacc ccgaggacga gttcagcagc gacgaggacg acgggctata cgtgcacccc      1560

gaggaggcgc cccgctccgg cttcgacgtc tggttccgcg atccggagaa accggaagtg      1620

aagaatggac ccaactatgg cgtgaccgcc aaccgcctgt tgaatgcccg ccc             1673

 

Claims (3)

1.猪伪狂犬病病毒株PRV-HBWH/2014，其微生物保藏号是CCTCC NO：V201439。

2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒株PRV-HBWH/2014，其特征在于，该病毒株的gE基因的部分核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示。

3.如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒株PRV-HBWH/2014在制备防治猪伪狂犬病的疫苗中的应用。