CN108048413B - 伪狂犬病毒犬科动物分离株及其制备的灭活疫苗和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株伪狂犬病毒犬科动物分离株及其制备的灭活疫苗和应用。本发明首先公开了一株伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV‑LN株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14736。本发明进一步公开了所述PRV‑LN株在制备预防伪狂犬病，尤其是预防犬科动物伪狂犬病的疫苗中的应用。本发明还公开了一种预防犬科动物伪狂犬病的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的PRV‑LN株和药学上可接受的佐剂。本发明利用伪狂犬病毒PRV‑LN株制备的灭活疫苗免疫效果良好，能够更好的对犬科动物进行伪狂犬病的防控。本发明分离的伪狂犬病毒PRV‑LN株能够作为犬科动物伪狂犬病防控的候选疫苗株。

Description

伪狂犬病毒犬科动物分离株及其制备的灭活疫苗和应用

技术领域

本发明涉及一株伪狂犬病毒犬科动物分离株，还涉及所述伪狂犬病毒犬科动物分离株制备的灭活疫苗及其在预防犬科动物伪狂犬病中的应用，属于伪狂犬病毒毒株的分离及应用领域。

背景技术

伪狂犬病，又名奥耶斯基氏病，是由伪狂犬病毒引起的一种烈性传染病。该病最早发现于美国，后来由匈牙利科学家首先分离出病毒。除各种年龄的猪、牛都易感外，在自然条件下羊、犬、猫、兔、鼠、水貂、狐和浣熊等其他家畜及野生哺乳动物均能感染发病，且通常情况下该病毒对这些宿主是致命的，一旦感染死亡率几乎高达100％，给养殖业造成了严重的经济损失。

目前，对于伪狂犬病的防控没有特别有效的防控手段，主要通过接种疫苗来进行。对于猪伪狂犬病的防控，中国市场上主要通过活疫苗和灭活疫苗进行免疫，取得了比较显著的成绩。但对于犬科动物，尤其是规模化的犬、狐和貉养殖业的防控，目前市场上还没有相关的疫苗。这种情况与中国日益扩大的经济动物及皮毛动物养殖业的规模严重不符，因而急需研发一种针对犬科动物的安全性和免疫效果良好的灭活疫苗，以避免对养殖户造成严重的经济损失。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株伪狂犬病毒犬科动物分离株；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述伪狂犬病毒犬科动物分离株制备的灭活疫苗及其在预防犬科动物伪狂犬病中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明从辽宁省某特种经济动物养殖场采集的发病死亡的狐和貉的脑、肝脏等组织病料中分离得到一株伪狂犬病毒毒株。用伪狂犬病毒gB基因特异性引物对分离株gB基因的PCR鉴定结果表明，PCR扩增出一条200bp左右的条带，与预期扩增的片段大小一致；将PCR产物用Sal I酶切，结果PCR产物可切成140bp和77bp 2个条带。

本发明将分离的伪狂犬病毒经3轮蚀斑克隆纯化后，将分离的伪狂犬毒株命名为PRV-LN株。对纯化的病毒进行病毒效价的测定，按照Reed-Muench法计算结果，PRV-LN株的病毒含量为10^8.17TCID₅₀/0.1mL。

本发明对伪狂犬病毒分离株PRV-LN株TK基因的测序及序列分析结果表明，与大多数的PRV毒株相比，分离株在30位发生了C-G、47位发生了A-G、643位和644位发生了GT-AC和386位发生了A-G的核苷酸的点突变。TK基因的遗传进化分析表明，本发明分离的毒株PRV-LN株位于一个相对独立的分支中。由TK基因推导的氨基酸序列对比发现，分离株PRV-LN株存在以下特征：在16位发生了K-R、129位发生了S-G、214位发生了V-T和284位A-V的突变。

兔体致病力试验结果表明，接种伪狂犬病毒PRV-LN株的兔子，在接种后24-36h注射部位出现奇痒，家兔烦躁、啃咬注射局部，导致皮肤发生溃烂，并全部死亡。证明，本发明分离的狐貉源伪狂犬病毒毒株为强毒株。

本发明将分离的伪狂犬病毒PRV-LN株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14736；分类命名为：猪伪狂犬病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年11月16日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明进一步公开了所述的伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株在制备预防伪狂犬病的疫苗中的应用，尤其是在制备预防犬科动物伪狂犬病的疫苗中的应用。

本发明还公开了一种预防犬科动物伪狂犬病的灭活疫苗，包括：预防上有效量的灭活的所述伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株和药学上可接受的佐剂。

本发明所述的犬科动物包括但不限于：犬、狐或貉中的任意一种或多种。

本发明进一步公开了一种伪狂犬灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)增殖所述伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株，收获病毒液；(2)将病毒液加入灭活剂进行灭活；(3)将灭活的病毒液与佐剂混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)用ST细胞(猪睾丸传代细胞)增殖所述伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株。具体的，将伪狂犬病毒PRV-LN株按1％的接毒量接入形成单层的ST细胞中，置37℃旋转培养36-48小时，当细胞病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收获病毒液，置2～8℃保存，应不超过15天。

步骤(2)所述灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)溶液；优选的，按g/ml计，所述灭活剂的终浓度为0.2％。所述灭活为30℃搅拌灭活54h，然后加入终浓度0.2％(w/v，g/ml)的硫代硫酸钠溶液终止灭活。

步骤(3)所述佐剂为Montanide ISA 15A VG佐剂；按照体积比计，灭活的病毒液：佐剂＝9：1。具体的，先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟，即制备成伪狂犬病灭活疫苗。

本发明进一步公开了所述制备方法制备得到的伪狂犬灭活疫苗。所述灭活疫苗中含伪狂犬病毒PRV-LN株≥10^7.67TCID₅₀/头份。

安全性评价结果表明，本发明制备的狂犬病灭活疫苗对家兔及犬的安全性良好。免疫效力评价结果表明，本发明制备的狂犬病灭活疫苗可有效地诱导特异性抗体的生成，免疫后28天免疫犬的抗体阳性率为100％，免疫犬对PRV-LN株的攻毒保护率为100％，证明本发明制备的伪狂犬病灭活疫苗免疫效果良好，能够对犬提供良好的攻毒保护。与伪狂犬活疫苗(Barth-K61株)免疫效力的对比试验表明，本发明制备的伪狂犬病灭活疫苗诱导的中和抗体水平和攻毒保护能力均优于伪狂犬病毒弱毒活疫苗(Barth-K61株)，能够更好的对犬科动物进行伪狂犬病的防控。因此，本发明分离的伪狂犬病毒PRV-LN株能够作为犬科动物伪狂犬病防控的候选疫苗株。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明从发病死亡的狐和貉的组织病料中分离得到一株狐貉源伪狂犬病毒PRV-LN株。应用该毒株制备的伪狂犬病灭活疫苗，免疫效果良好，可以对犬提供良好的攻毒保护，且安全性良好，能够作为犬科动物伪狂犬病防控的候选疫苗株。

附图说明

图1为伪狂犬病毒PRV-LN株gB基因的PCR鉴定结果；

图2为伪狂犬病毒PRV-LN株gB基因的PCR产物Sal I酶切结果；

图3为伪狂犬病毒PRV-LN株TK基因的测序结果；

图4为伪狂犬病毒PRV-LN株TK基因的遗传进化树。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1伪狂犬病毒毒株的分离和鉴定

1、细胞和病料

ST细胞购自中国兽医药品监察所；病料采集自辽宁省某特种经济动物养殖场采集的发病死亡的狐和貉的脑、肝脏、脾脏及淋巴结等组织。

将病料使用研磨器研磨，反复冻融3次后，与PBS(0.1mol/L，pH 7.2)以1:5(V/V)混合后，3000r/min离心15min，取上清，经0.22μm滤膜除菌后，-70℃保存备用。

2、病毒分离

将上述病料按病毒培养液的10％的接种量接入形成单层的ST细胞培养物中，置37℃作用1h，换含2％新生牛血清的DMEM培养液，37℃培养96h，逐日观察致细胞病变效应(CPE)。结果，在病料接种培养24h，ST单层细胞培养物出现CPE，表现为细胞圆缩、膨大、融合形成合胞体以及“拉网”现象，随着时间的推移，病变细胞脱落形成空斑样病灶。当细胞病变达到80％左右时，收获，-70℃保存，准备进行鉴定。

3、病毒的鉴定

将上述分离的病毒用PCR法进行鉴定。按照《中华人民共和国国家标准》伪狂犬病诊断技术(GB/T 18641-2002)中的聚合酶链式反应进行引物合成，扩增伪狂犬病毒基因中434-651碱基对(bp)之间217bp基因片段，序列为上游引物P1:5'-AGGAGGACG AGCTGGGGCT-3'，下游引物P2:5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'，引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR扩增反应体系(50ul体系)：

PCR反应条件：94℃预变性5min，进入循环，94℃变性，1min；65℃退火，1min；72℃延伸，1min；30个循环后，72℃，延伸10min，4℃终止循环。

结果表明，PCR扩增出一条200bp左右的条带，与预期扩增的片段大小一致，结果见图1。为进一步进行PCR产物的特异性鉴定，将产物用Sal I酶切，结果PCR产物可切成140bp和77bp 2个条带，见图2。

本发明将将分离的伪狂犬毒株暂命名为伪狂犬病毒PRV-LN株。

4、病毒的蚀斑克隆

将伪狂犬病毒PRV-LN株病毒液用DMEM做10倍系列稀释，取其中的10^-5、10^-6、10^-7和10^-8 4个稀释度，接种于ST细胞长满单层的24孔细胞培养板，每个稀释度作4个重复，100μl/孔。置含5％CO₂的细胞培养箱在37℃条件下吸附1h后，吸出病毒液，然后加入43℃～45℃的低熔点琼脂糖1mL，待琼脂糖凝固后将细胞培养板翻转，并置含5％CO₂的细胞培养箱在37℃条件下培养，逐日观察。培养4～5天后，对每个稀释度所形成的空斑进行计数，计算空斑形成单位(PFU)，观察空斑形态及大小，挑出最高稀释度的细胞孔内小而孤立的空斑，加入0.5mL培养液中，冻融3次后，3000r/min离心10min，吸取上清，做10倍系列稀释，选取10^-1、10^-2和10^-3 3个稀释度，按上述方法进行第2轮克隆纯化，共进行3轮。纯化后将分离的伪狂犬毒株正式命名为PRV-LN株，对纯化的病毒进行病毒效价的测定，按照Reed-Muench法计算结果，PRV-LN株的病毒含量为10^8.17TCID₅₀/0.1mL。

5、伪狂犬病毒分离株TK基因的克隆、测序及序列分析

PCR扩增反应体系(50ul体系)：

PCR反应条件：94℃预变性5min，进入循环，94℃变性，1min；56℃退火，1min；72℃延伸，1min；30个循环后，72℃，延伸10min，4℃终止循环。

结果表明，PCR扩增出一条1000bp左右的条带，与预期扩增的片段大小一致。

将上述PCR扩增的产物纯化后，回收目的片段，克隆至pMD-18T载体，筛选出阳性克隆后，送invitrogen公司进行测序，测序结果见图3。与大多数的PRV毒株相比，分离株在30位发生了C-G、47位发生了A-G、643位和644位发生了GT-AC和386位发生了A-G的核苷酸的点突变。

TK基因的遗传进化分析表明，新分离的毒株PRV-LN株位于一个相对独立的分支中，见图4。

由TK基因推导的氨基酸序列对比发现，分离株存在以下特征：在16位发生了K-R、129位发生了S-G、214位发生了V-T和284位A-V的突变。

6、兔体致病力试验

取2.5～3.0kg的家兔5只，每只经颈部皮下注射PRV-LN株病毒液1mL，同时设2只颈部皮下注射生理盐水1.0mL的家兔2只，同条件饲养96小时，观察家兔的发病情况。结果，接种病毒的5只兔子，在接种后24～36h注射部位出现奇痒，家兔烦躁、啃咬注射局部，导致皮肤发生溃烂，并全部死亡。对照组无任何临床症状。

本发明将分离的伪狂犬病毒PRV-LN株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏号为CGMCC No.14736。

实施例2伪狂犬病灭活疫苗的制备及其安全性和免疫效力的评价

1、制苗用病毒液的制备

将实施例1分离的伪狂犬病毒PRV-LN株按1％的接毒量接入形成ST细胞单层中，置37℃旋转培养，当细胞病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收获病毒液。

2、病毒灭活剂疫苗制备

将上述收获的病毒液加入终浓度为0.2％(w/v，g/ml)的BEI，30℃灭活54h后，加入终浓度为0.2％(w/v，g/ml)的硫代硫酸钠。将灭活检验合格的伪狂犬病毒PRV-LN株病毒液，按照与Montanide ISA 15A VG佐剂＝9:1(v/v)的比例混合，先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟，制备成伪狂犬灭活疫苗。

3、疫苗的安全性评价

取2.5～3.0kg的家兔5只，每只经颈部皮下注射伪狂犬病灭活疫苗2.0mL，同时设5只颈部皮下注射生理盐水2.0mL的家兔2只，同条件饲养15天，观察家兔的发病情况。结果疫苗免疫组的家兔均没有任何不良反应。

4、疫苗的免疫效力评价

本发明同时采用血清学方法和免疫攻毒2种方法对疫苗的免疫效力进行评价。取10只5～6周龄的比格犬(PRV抗体阴性)随机分成2组，5只/组，1组为疫苗免疫组，经后腿肌肉注射上述疫苗2.0ml，首免后14日，按相同的方式加强免疫1次；另外1组为攻毒对照组，按上述方法注射PBS。在免疫前、免疫后7d、14d、21d和28d对所有犬进行采血，分离血清，测定血清中PRV的中和抗体指数，结果见表1。二免后14d，对所有犬进行攻毒，攻毒毒株为PRV-LN株(10^7.67TCID₅₀/0.1ml)，攻毒途径为肌肉注射，剂量为1.0ml。攻毒后观察所有犬的发病和死亡情况，结果见表2。

由以上两种评价结果表明，本发明制备的疫苗可以对犬提供良好的攻毒保护。

表1疫苗免疫后不同时间血清抗体中和指数测定结果

注：中和指数≥1:316时为阳性。

表2疫苗免疫后免疫攻毒试验结果

实施例3伪狂犬病灭活疫苗与伪狂犬活疫苗(Barth-K61株)免疫效力的对比试验

1、伪狂犬病灭活疫苗

实施例2制备的伪狂犬灭活疫苗。

2、伪狂犬活疫苗

哈药集团生物疫苗有限公司产品，批号201505。

3、伪狂犬病毒经典株

闽A株，购自中国兽医药品监察所。作为血清抗体测定时抗原。

4、疫苗的免疫效力评价

本发明同时采用血清学方法和免疫攻毒2种方法对疫苗的免疫效力进行评价。

取15只5～6周龄的比格犬(PRV抗体阴性)随机分成3组，5只/组，1组接种伪狂犬灭活疫苗，经后腿肌肉注射上述疫苗2.0ml；1组接种伪狂犬活疫苗，经后腿肌肉注射上述疫苗2.0ml；1组为攻毒对照组，按上述方法注射PBS。在免疫前和免疫后28d对所有犬进行采血，分离血清，分别用伪狂犬病毒LN株和闽A株作为中和抗原，测定血清中PRV的中和抗体指数，结果见表3。免疫后28d，对所有犬进行攻毒，攻毒毒株为PRV-LN株(10^7.67TCID₅₀/0.1ml)，攻毒途径为肌肉注射，剂量为1.0ml。攻毒后观察所有犬的发病和死亡情况，结果见表4。由结果可知，免疫后28日，伪狂犬灭活疫苗对LN株和闽A株两种抗原的血清中和指数的阳性率均≥80％；活疫苗对LN株的血清中和指数阳性率则为40％，对闽A株的血清抗体阳性率为80％。免疫后28日用LN株进行攻毒，灭活疫苗的攻毒保护率为5/5，而活疫苗的攻毒保护率为2/5。

表3不同疫苗免疫后28d血清抗体中和指数测定结果

注：中和指数为≥1:316时为阳性。

表4不同疫苗免疫后免疫攻毒试验结果

由以上两种评价结果表明，分离株LN株与经典株闽A株的抗原性和免疫原性存在一定的差异，由分离株制备的疫苗所诱导的中和抗体水平和攻毒保护能力优于常用的伪狂犬病毒弱毒活疫苗(Barth-K61株)，在现阶段可以对犬提供良好的攻毒保护，能更好的对犬科动物进行伪狂犬病的防控。

SEQUENCE LISTING

<110> 哈药集团生物疫苗有限公司

<120> 伪狂犬病毒犬科动物分离株及其制备的灭活疫苗和应用

<130> HLJ-3002-170803A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

aggaggacga gctggggct 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 2

gtccacgccc cgcttgaagc t 21

Claims (10)

1.一株伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14736。

2.权利要求1所述的伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株在制备预防伪狂犬病的疫苗中的应用。

3.权利要求1所述的伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株在制备预防犬科动物伪狂犬病的疫苗中的应用。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述犬科动物包括：犬、狐或貉中的任意一种或多种。

5.一种预防犬科动物伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防上有效量的灭活的权利要求1所述伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株和药学上可接受的佐剂。

6.一种伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)增殖权利要求1所述伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株，收获病毒液；(2)将病毒液加入灭活剂进行灭活；(3)将灭活的病毒液与佐剂混合，乳化，即得。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)用ST细胞增殖权利要求1所述伪狂犬病毒犬科动物分离株PRV-LN株。

8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活剂为二乙烯亚胺溶液；按g/ml计，所述灭活剂为终浓度0.2％的二乙烯亚胺溶液；

步骤(2)所述灭活为30℃灭活54h。

9.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述佐剂为MontanideISA15A VG佐剂；

按照体积比计，灭活的病毒液：佐剂＝9：1。

10.权利要求6至9任何一项所述制备方法制备得到的伪狂犬病灭活疫苗。

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