CN108486067B

CN108486067B - 猪流行性腹泻病毒变异株及其制备的灭活疫苗和应用

Info

Publication number: CN108486067B
Application number: CN201810138902.XA
Authority: CN
Inventors: 杨万秋; 王东升; 张明波
Original assignee: Heilongjiang Zhengkang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Heilongjiang Zhengkang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2018-02-11
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2038-02-11
Also published as: CN108486067A

Abstract

本发明公开了一株猪流行性腹泻病毒变异株及其制备的灭活疫苗和应用。本发明首先公开了一株分离的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV‑HB株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14889。本发明进一步公开了所述PEDV‑HB株在制备预防猪流行性腹泻病的疫苗中的应用。本发明还公开了一种预防猪流行性腹泻病的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的所述猪流行性腹泻病毒变异株PEDV‑HB株和药学上可接受的佐剂。本发明利用猪流行性腹泻病毒变异株PEDV‑HB株制备的灭活疫苗安全性好，免疫效果良好，能更好的进行猪流行性腹泻的防控。本发明分离的猪流行性腹泻病毒PEDV‑HB株能够作为猪流行性腹泻病防控的候选疫苗株。

Description

猪流行性腹泻病毒变异株及其制备的灭活疫苗和应用

技术领域

本发明涉及一株分离的猪流行性腹泻病毒变异株，还涉及所述猪流行性腹泻病毒变异株制备的灭活疫苗及其在预防猪流行性腹泻病中的应用，属于猪流行性腹泻病毒变异株的分离及应用领域。

背景技术

猪流行性腹泻，是由猪流行性腹泻病毒(PEDV，Porcine Epidemic Diarrheavirus)引起的一种接触性肠道传染病，1971年首发于英国，中国于20世纪80年代初陆续发生。本病只发生于猪，各种年龄的猪均能感染发病，但对哺乳仔猪造成的危害最为严重，母猪的发病率大约为 15％～90％。临床特征表现为呕吐、腹泻和脱水。症状的轻重随年龄的大小而有差异，年龄越小，症状越重，新生仔猪(1周龄内)发生腹泻后3-4 天，呈严重脱水而死亡，最高死亡率可达100％，给养猪业造成了严重的经济损失。

目前，对于猪流行性腹泻的防控没有特别有效的防控手段，主要通过接种疫苗来进行。对于猪流行性腹泻的防控，中国市场上主要通过猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的二联活疫苗或灭活疫苗进行免疫，取得了比较显著的成绩。但作为正链RNA病毒，猪流行性腹泻病毒基因容易发生变异。据文献报道自2010年以来，尽管大部分猪场都进行过PEDV疫苗的免疫，但PED仍在中国许多省份的猪场中流行(Chen J,Wang C,Shi H etal.Molecular epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus in China[J].Archives of Virology,2010,155:1471-1476.)。根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的研究报告显示，现阶段流行毒株大部分为新发毒株，也有部分毒株与以往爆发过的毒株相似(刘孝珍,陈建飞,时洪艳,等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J].中国预防兽医学报,2012,34(3): 180-183.)，传统疫苗可能不能对抗流行的新发毒(李一经，张博，唐丽杰，等.PEDV地方流行毒株S1基因的遗传变异分析及HLJ-2012株免疫原性检测[J].东北农业大学学报，2014,45(12)：1-9.)。另有研究表明(陈静，杨盼盼，雷喜梅，等.PEDV中国流行株和疫苗株S蛋白免疫原性差异分析[J].中国兽医学报，2015，35，(10):1573-1577.)，在相同Elisa条件下，抗PEDV疫苗株抗体与疫苗株SA蛋白反应性明显高于与流行株SA 蛋白反应性(P＜0.01)；而抗PEDV流行株抗体与流行株SA蛋白反应性明显高于与疫苗株SA蛋白反应性(P＜0.01)，两种SA蛋白在反应性上存在较大差异。PEDV S基因表达蛋白的N端高突变区存在主要抗原位点，由于该基因某些碱基的改变，导致了PEDV流行株和疫苗株主要抗原位点的差异。

目前，市场上还没有与猪流行性腹泻变异株相关的疫苗，这种情况与中国日益扩大的生猪养殖业的规模严重不符。因而，急需研发对猪流行性腹泻变异株的安全性和免疫效果良好的灭活疫苗，以免对养殖户造成严重的经济损失。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株分离的猪流行性腹泻病毒变异株；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述分离的猪流行性腹泻病毒变异株制备的灭活疫苗及其在制备预防猪流行性腹泻病的疫苗中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明从河北省某养猪场爆发猪流行性腹泻的发病濒死的哺乳仔猪的小肠、小肠内容物及粪便等组织中分离得到一株猪流行性腹泻病毒。电镜鉴定结果显示，病毒直径在120nm左右，呈球形，有棘突，与PEDV 粒子的形态相符。本发明进一步利用PCR扩增上述分离的猪流行性腹泻病毒S蛋白的部分基因，结果扩增出一条1800bp左右的条带，与预期扩增的片段大小一致。本发明对分离的猪流行性腹泻病毒进行3轮蚀斑克隆纯化，纯化后将分离的猪流行性腹泻毒株命名为PEDV-HB株。

本发明对分离的PEDV-HB株进行病毒含量的测定，PEDV-HB株的病毒含量≥10^6.83TCID₅₀/0.1mL。

本发明对猪流行性腹泻病毒分离株S基因的测序及序列分析结果表明，与大多数的PEDV毒株相比，分离株PEDV-HB株在166-174位有9 个核苷酸的插入、在178-180位有3个核苷酸的插入、在182位发生C-T 的点突变、在184-189位有6个核苷酸的插入、在932位发生C-A的点突变、在935位发生C-T的点突变、在1159-1170位发生12个核苷酸的缺失、在1324-1422位发生99个核苷酸的缺失、在1571位发生A-C的点突变及在1573位发生A-G的点突变。S蛋白部分基因的遗传进化分析表明，新分离的毒株PEDV-HB株位于一个相对独立的分支中。由S蛋白部分基因推导的氨基酸序列对比发现，分离株存在以下特征：在56-58位插入了GEN 3个氨基酸、在第60位插入了G 1个氨基酸、在62位发生了A-V 的突变、在62、63位插入NS两个氨基酸、在311-312位发生AA-DV的点突变、在387-390位发生4个氨基酸的缺失、在442-474位发生33个氨基酸的缺失及在524和525位发生HS-PG的点突变。另外，第161-166位的氨基酸序列为-HMSEHS-，符合最近中国流行性腹泻变异株的氨基酸序列。

动物致病力试验表明，接种PEDV-HB株的仔猪，在接种后24-36h 出现呕吐、腹泻及脱水等临床症状，接种后7日有60％仔猪死亡。

本发明将分离的猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14889；分类命名为：猪流行性腹泻病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年11月27日；保藏地址：中国北京。

本发明进一步公开了所述的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株在制备预防猪流行性腹泻病的疫苗中的应用。

本发明还公开了一种预防猪流行性腹泻病的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的所述猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株和药学上可接受的佐剂。

本发明进一步公开了一种猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)增殖所述猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株，收获病毒液；(2)将病毒液加入灭活剂进行灭活；(3)将灭活的病毒液与佐剂混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)用Vero细胞(绿猴肾细胞)增殖所述的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株。具体的，将猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株按1％的接毒量接入形成单层的Vero细胞中，置37℃条件下旋转培养 36-48小时，当细胞病变达到80％时，反复冻融2次后收获病毒液，置-20℃保存，应不超过3个月。

步骤(2)所述灭活剂为β-丙内酯；优选的，所述灭活剂为终浓度为 0.2％的β-丙内酯。所述灭活为30℃灭活36h。

步骤(3)按照体积比计，灭活的病毒液：佐剂＝9：1。所述佐剂为 Montanide ISA15A VG佐剂。乳化方法为：先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止 30分钟，即制备成猪流行性腹泻灭活疫苗。

本发明还公开了所述制备方法制备得到的猪流行性腹泻灭活疫苗。本发明制备的猪流行性腹泻灭活疫苗为水包油型疫苗，每头份疫苗中所含猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株≥10^7.50TCID₅₀。

疫苗安全性评价结果表明，本发明制备的猪流行性腹泻灭活疫苗免疫组的哺乳仔猪均无任何不良反应，疫苗的吸收情况良好，病理切片显示无任何病理变化，证明灭活疫苗对哺乳仔猪的安全性良好。免疫效力试验结果表明，该疫苗能够有效地诱导特异性抗体生成，免疫仔猪对猪流行性腹泻病毒的攻毒保护率为100％，证明本发明制备的猪流行性腹泻灭活疫苗的免疫效果良好，可以对哺乳仔猪提供良好的攻毒保护。与猪流行性腹泻经典株灭活疫苗的免疫效力对比试验表明，免疫后28日，本发明制备的猪流行性腹泻灭活疫苗对PEDV-HB株和经典株CV777株两种抗原的血清中和效价的阳性率均≥80％，而猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联灭活疫苗对PEDV-HB株的血清中和效价阳性率仅为40％；免疫后28日用PEDV-HB株进行攻毒，本发明猪流行性腹泻灭活疫苗的攻毒保护率为 100％，而猪传染性胃肠炎、流行性腹泻(经典株)二联灭活疫苗的攻毒保护率仅为60％。证明，本发明分离的PEDV-HB株与经典株CV777株的抗原性和免疫原性存在一定的差异，由变异株PEDV-HB株制备的灭活疫苗在现阶段能更好进行猪流行性腹泻的防控。因此，本发明分离的猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株能够作为猪流行性腹泻病防控的候选疫苗株。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明从爆发猪流行性腹泻的养猪场濒死猪的肠道和粪便等病料中分离得到一株猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株。利用该变异株制备的猪流行性腹泻灭活疫苗，安全性良好，免疫效果良好，在现阶段能更好进行猪流行性腹泻的防控。本发明分离的猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株能够作为猪流行性腹泻病防控的候选疫苗株。

附图说明

图1为猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株病毒颗粒电镜负染色结果，箭头指示为病毒；

图2为流行性腹泻病毒PEDV-HB株S蛋白部分的PCR扩增结果；

图3为猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株S蛋白部分基因的测序结果；

图4为猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株S蛋白部分基因的遗传进化树；

图5为猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株灭活疫苗安全性试验接种部位病理切片。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1猪流行性腹泻病毒毒株的分离和鉴定

1、细胞和病料

Vero细胞购自中国兽医药品监察所；病料采集自河北省某规模化养猪场的发病濒死的哺乳仔猪的小肠、小肠内容物及粪便等组织。

将病料使用研磨器研磨，反复冻融3次后，与PBS(0.1mol/L，pH 7.2) 以1:5(V/V)混合后，3000r/min离心15min，取上清，经0.22μm滤膜除菌后，-70℃保存备用。

2、病毒分离

将上述病料按病毒培养液的10％的接种量接入形成单层的Vero细胞培养物中，置37℃作用1h，换含2％新生牛血清的DMEM培养液，37℃培养96h，逐日观察致细胞病变效应(CPE)。结果，在病料接种培养72h， Vero单层细胞培养物出现CPE，表现为细胞圆缩、膨大、融合形成合胞体以及“拉网”现象，随着时间的推移，病变细胞脱落形成空斑样病灶。当细胞病变达到80％左右时，收获，-70℃保存，准备进行鉴定。

本发明将分离的病毒暂命名为猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株。

3、电镜鉴定

将培养第3代的PEDV-HB株毒株培养72h的Vero细胞培养物收获后，反复冻融3次，12000r/min 4℃离心40min，去除细胞碎片，进行磷钨酸溶液染色后，在透射电镜下观察，结果见图1。结果显示病毒直径在 120nm左右，呈球形，有棘突，与PEDV粒子的形态相符。

4、病毒的鉴定

将上述分离的病毒用PCR法进行鉴定，扩增S蛋白的部分基因。

PCR扩增反应体系(50ul体系)：

PCR反应条件：94℃预变性5min，进入循环，94℃变性，1min；51.5℃退火，1.5min；72℃延伸，1.5min；30个循环后，72℃，延伸10min，4℃终止循环。

结果表明，PCR扩增出一条1800bp左右的条带，与预期扩增的片段大小一致，结果见图2。

5、病毒的蚀斑克隆

将猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株病毒液用DMEM做10倍系列稀释，取其中的10^-5、10^-6、10^-7和10^-8 4个稀释度，接种于Vero细胞长满单层的24孔细胞培养板，每个稀释度作4个重复，100μl/孔。置含5％CO₂的细胞培养箱在37℃条件下吸附1h后，吸出病毒液，然后加入43℃～45℃的低熔点琼脂糖1mL，待琼脂糖凝固后将细胞培养板翻转，并置含5％CO₂的细胞培养箱在37℃条件下培养，逐日观察。培养4～5天后，对每个稀释度所形成的空斑进行计数，计算空斑形成单位(PFU)，观察空斑形态及大小，挑出最高稀释度的细胞孔内小而孤立的空斑，加入0.5mL培养液中，冻融3次后，3000r/min离心10min，吸取上清，做10倍系列稀释，选取10^-1、10^-2和10^-3 3个稀释度，按上述方法进行第2轮克隆纯化，共进行3轮。纯化后将分离的猪流行性腹泻毒株正式命名为PEDV-HB株，对纯化的病毒进行病毒效价的测定，按照Reed-Muench法计算结果， PEDV-HB株的病毒含量为10^6.83TCID₅₀/0.1mL。

6、猪流行性腹泻病毒分离株S基因的克隆、测序及序列分析

将上述PCR扩增的产物纯化后，回收目的片段，克隆至pMD-18T载体，筛选出阳性克隆后，送invitrogen公司进行测序，测序结果见图3。与大多数的PEDV毒株相比，分离株在166-174位有9个核苷酸的插入、在178-180位有3个核苷酸的插入、在182位发生C-T的点突变、在184-189 位有6个核苷酸的插入、在932位发生C-A的点突变、在935位发生C-T 的点突变、在1159-1170位发生12个核苷酸的缺失、在1324-1422位发生99个核苷酸的缺失、在1571位发生A-C的点突变及在1573位发生 A-G的点突变。

S蛋白部分基因的遗传进化分析表明，新分离的毒株PEDV-HB株位于一个相对独立的分支中，见图4。

由S蛋白部分基因推导的氨基酸序列对比发现，分离株存在以下特征：在56-58位插入了GEN 3个氨基酸、在第60位插入了G 1个氨基酸、在62位发生了A-V的突变、在62、63位插入NS两个氨基酸、在311-312 位发生AA-DV的点突变、在387-390位发生4个氨基酸的缺失、在442-474 位发生33个氨基酸的缺失及在524和525位发生HS-PG的点突变。另外，第161-166位的氨基酸序列为-HMSEHS-，符合最近中国流行性腹泻变异株的氨基酸序列。

7、动物致病力试验

取新生7日龄的仔猪5头，每只经口服接种PEDV-HB株病毒液1mL，同时设2只口服接种生理盐水1.0mL的哺乳仔猪，同条件饲养14d，观察仔猪的发病情况。结果，接种病毒的5头仔猪，在接种后24～36h出现呕吐、腹泻及脱水等临床症状，接种后7日有3头仔猪死亡。对照组无任何临床症状。

本发明将分离的猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏号为CGMCC No.14889。

实施例2猪流行性腹泻病灭活疫苗的制备及其安全性和免疫效力的评价 1、制苗用病毒液的制备

将实施例1分离的猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株按1％的接毒量接入形成Vero细胞单层中，置37℃旋转培养，当细胞病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经3次冻融后，收获病毒液。

2、病毒灭活剂疫苗制备

将上述收获的病毒液加入终浓度为0.2％(w/v，g/ml)的β-丙内酯，30℃灭活36h。将灭活检验合格的猪流行性腹泻病毒PEDV-HB株病毒液，按照与Montanide ISA 15A VG佐剂＝9:1的比例(v/v)混合，先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30 分钟，再静止30分钟，制备成猪流行性腹泻灭活疫苗。

3、疫苗的安全性评价

取猪流行性腹泻病毒血清抗体阴性母猪所产的3日龄哺乳仔猪5头，每只经肌肉注射猪流行性腹泻病灭活疫苗2.0mL，逐日观察免疫猪注射部位及全身的临床症状，共观察14日。14日随机取免疫猪2头，对注射部位进行剖检，看疫苗的吸收情况，同时取注射部位肌肉组织进行病理切片。结果疫苗免疫组的哺乳仔猪均无任何不良反应，疫苗的吸收情况良好，病理切片显示无任何病理变化，结果见图5。

4、疫苗的免疫效力评价

本发明同时采用血清学方法和免疫攻毒2种方法对疫苗的免疫效力进行评价。取猪流行性腹泻病毒血清抗体阴性母猪所产的3日龄哺乳仔猪 10头随机分成2组，5只/组，1组为疫苗免疫组，经肌肉注射上述疫苗 2.0ml；另外1组为攻毒对照组，按上述方法注射PBS。免疫后14日对所有哺乳仔猪进行采血，分离血清，测定血清中PEDV的中和抗体效价，结果见表1。免疫后14d，对所有哺乳仔猪进行口服攻毒，攻毒毒株为 PEDV-HB株(10^6.00TCID₅₀/0.1ml)，剂量为1.0ml。攻毒后观察所有哺乳仔猪的发病和死亡情况，结果见表2。由以上两种评价结果表明，本发明制备的疫苗可以对哺乳仔猪提供良好的攻毒保护。

表1疫苗免疫后不同时间血清抗体中和抗体测定结果

注：“-”表示抗体阴性；当中和效价为≥1:16时判为PEDV血清阳性。

表2疫苗免疫后免疫攻毒试验结果

实施例3猪流行性腹泻变异株灭活疫苗与猪流行性腹泻经典株灭活疫苗的免疫效力的对比试验

1、猪流行性腹泻变异株灭活疫苗

实施例2制备的猪流行性腹泻变异株灭活疫苗。

2、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗

由于市场上尚无猪流行性腹泻单苗，因而选择市售二联疫苗进行试验。该疫苗为哈尔滨维科生物技术开发公司产品，批号20150804，该二联苗制苗用抗原为猪流行性腹泻经典株CV777株。

3、猪流行性腹泻经典株CV777株

用作血清中和抗体的测定。

4、疫苗的免疫效力评价

本发明同时采用血清学方法和免疫攻毒2种方法对疫苗的免疫效力进行评价。取15只3日龄哺乳仔猪(PEDV抗体阴性)随机分成3组，5 只/组，1组接种猪流行性腹泻变异株灭活疫苗，经颈部肌肉注射上述疫苗 1.0ml；1组接种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联灭活疫苗，经后海穴注射上述疫苗1.0ml；1组为攻毒对照组，按上述方法注射PBS。在免疫前和免疫后28d对所有猪进行采血，分离血清，分别用猪流行性腹泻变异株 PEDV-HB株和猪流行性腹泻经典株CV777株作为中和抗原，测定血清中 PEDV的中和抗体效价，结果见表3。免疫后28d，对所有猪进行攻毒，攻毒毒株为PEDV-HB株(10^6.00TCID₅₀/0.1ml)，攻毒途径为口服，剂量为1.0ml。攻毒后观察所有猪的发病和死亡情况，结果见表4。

表3不同疫苗免疫后28d血清抗体中和指数测定结果

注：“-”，PEDV抗体阴性；中和效价为≥1:16时为阳性。

表4不同疫苗免疫后免疫攻毒试验结果

由结果可知，免疫后28日，猪流行性腹泻变异株灭活疫苗对 PEDV-HB株和经典株CV777株两种抗原的血清中和效价的阳性率均≥80％；猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联灭活疫苗对PEDV-HB株的血清中和效价阳性率则为40％，对CV777的血清抗体阳性率为80％。免疫后28日用PEDV-HB株进行攻毒，猪流行性腹泻变异株灭活疫苗的攻毒保护率为5/5，而猪传染性胃肠炎、流行性腹泻(经典株)二联灭活疫苗的攻毒保护率为3/5。

由以上两种评价结果表明，分离株PEDV-HB株与经典株CV777株的抗原性和免疫原性存在一定的差异，由变异株PEDV-HB株制备的疫苗在现阶段能更好进行猪流行性腹泻的防控。

SEQUENCE LISTING

<110> 黑龙江正康生物技术股份有限公司

<120> 猪流行性腹泻病毒变异株及其制备的灭活疫苗和应用

<130> HLJ-3002-170804A

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> porcine epidemic diarrhea virus

<400> 1

His Met Ser Glu His Ser

1 5

Claims

1.一株分离的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14889。

2.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株在制备预防猪流行性腹泻病的疫苗中的应用。

3.一种预防猪流行性腹泻病的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防上有效量的灭活的权利要求1所述猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株和药学上可接受的佐剂。

4.一种猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)增殖权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株，收获病毒液；(2)将病毒液加入灭活剂进行灭活；(3)将灭活的病毒液与佐剂混合，乳化，即得。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)用Vero细胞增殖权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV-HB株。

6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活剂为终浓度为0.2％的β-丙内酯。

7.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活为30℃灭活36h。

8.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)按照体积比计，灭活的病毒液：佐剂＝9：1。

9.按照权利要求4或8所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述佐剂为MontanideISA 15A VG佐剂。

10.权利要求4至9任何一项所述制备方法制备得到的猪流行性腹泻灭活疫苗。