CN108893437B

CN108893437B - 一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法

Info

Publication number: CN108893437B
Application number: CN201810537606.7A
Authority: CN
Inventors: 王伟平; 岳硕豪; 何雨峰; 秦松; 宫春杰; 黄莹琪; 张华山; 邓颖
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108893437A

Abstract

本发明公开了一种表达红曲霉菌Mn‑SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法，属于生物工程领域。本发明通过筛选并设计出红色红曲霉Mn‑SOD简并引物，利用PCR技术扩增红曲霉Mn‑SOD基因的全长序列，经EcoR I和HindIII酶切后连接至相同酶切的表达载体pET21a及pET28a，并分别转化至E.coli BL21，均实现合成酶基因在E.coli中的表达，得到具有酶活力和耐酸性的Mn‑SOD。本发明将红曲霉Mn‑SOD歧化酶基因导入到原核生物中实现表达，为红曲霉Mn‑SOD歧化酶的大规模生产、分离提供了可能，且本发明构建的工程菌分泌的MnSOD来源于红色红曲霉，在pH3.8条件下处理1h仍具有80%的活性，具有耐酸性，可用于耐酸性超氧化物歧化酶的生产菌株。

Description

一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说涉及一种表达红色红曲霉菌（Monascus rubberCCTCC NO:M2013082）锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的工程大肠杆菌构建、表达方法。

背景技术

超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase，即SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化细胞体内的超氧阴离子自由基生成水和过氧化氢，消除超氧阴离子对细胞的危害。根据其结合金属离子的种类不同，超氧化物歧化酶分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种。Mn-SOD是由氨基酸残基构成的四面体，结构简单，主要存在于真核细胞的线粒体中。线粒体是真核生物细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体内过量产生超氧阴离子对线粒体乃致整个细胞造成伤害。因此，具有超氧阴离子自由基清除作用的Mn-SOD，是消除细胞线粒体内超氧阴离子、维持细胞的正常生长代谢的关键酶，对维持机体氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。目前已广泛地应用于医药、食品、化妆品等领域。

红曲最早发现于中国，已有一千多年的生产应用历史，明代李时珍在《本草纲目》评价：“此乃人窥造化之巧者也”，“奇药也”。红曲霉菌是我国重要的微生物资源，在其生长代谢过程中能够产生多种具有生物活性的代谢产物，如具有超氧阴离子自由基清除作用的Mn-SOD。由于红曲菌产桔霉素问题的存在，国内外对红曲的安全性提出了怀疑。相关研究发现红曲霉中Mn-SOD序列可能与桔霉素的产生密切相关，在橙色红曲菌中得到了可能与桔霉素产毒相关的EST序列。经生物信息学分析，发现其中一个基因P5编码的蛋白与Mn-SOD高度同源（涂追. 橙色红曲菌(AS3.4384)SOD基因的克隆与功能分析[D]. 南昌大学, 2007.）。因此，研究红曲霉Mn-SOD序列及其表达对研究调控红曲霉桔霉素的产生具有重要意义。

Mn-SOD是一种具有广阔前景的蛋白多肽类药物。在SOD家族中，Mn-SOD与其他SOD相比具有寿命长、分子量小、抗炎和抗辐射作用等优点，而且锰的毒性较铜、铁低。并且，红曲霉菌来源的Mn-SOD在酸性条件下具有一定的耐酸性。目前，尽管很多学者已从许多生物体克隆到了Mn-SOD 基因，并且部分基因已经在原核或真核生物体内进行了表达，但国内对大肠杆菌表达Mn-SOD 尤其是红曲霉来源Mn-SOD的研究还鲜见报道。因此，积极开展Mn-SOD基因工程技术有重大的研究意义。

发明内容

鉴于现有技术的上述不足，本发明的目的是一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建、表达方法，包括以下步骤：

（1）查找NCBI数据库，进行Block对比，利用primer premier 5.0进行引物分析，筛选并设计出红曲霉菌（MonascusrubberCCTCC NO. M2013082）基因组Mn-SOD简并引物，简并引物序列分别见SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。

（2）从红曲霉菌（MonascusrubberCCTCC NO. M2013082）获得Mn-SOD基因的全长cDNA；再以总cDNA作为PCR为模板，在简并引物的引导下PCR扩增红曲霉菌（MonascusrubberCCTCC NO. M2013082）得到部分Mn-SOD基因；

（3）通过红色红曲霉Mn-SOD基因组设计扩增引物，扩增得到完整红曲霉Mn-SOD基因组，用TD-PCR方法扩增Mn-SOD基因，得到产物重组至质粒pET39b，重组质粒命名为pET39b-SOD，并于大肠杆菌DH5α中克隆测序，确定正确的阳性克隆；以pET39b-SOD为模板，用PCR方法扩增Mn-SOD，经EcoRI和Hind III酶切点酶切后重组至相同酶切的表达质粒pET21a上，构建成pET21a-MnSOD，并用相同的方法构建得到pET28a-MnSOD；

所述扩增引物序列分别见SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；

（4）将pET21a-MnSOD、pET28a-MnSOD分别转移至大肠杆菌BL21中完成构建，并进行表达；所述的重组质粒表达载体导入大肠杆菌细胞，在IPTG诱导下表达得到有活性的Mn-SOD，并检测重组蛋白Mn-SOD活性。

优选地，如上所述的一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株构建、表达方法，步骤（1）中所述的红曲霉菌为红色红曲霉（Monascus rubber），已于2013年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉武汉大学），其保藏编号为：CCTCC NO：M2013082。

优选地，如上所述的一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建、表达方法，步骤（3）的红曲霉菌的Mn-SOD基因序列见SEQ ID NO:5及推断的氨基酸序列见SEQ IDNO:6。

本发明的一种高效表达Mn-SOD的工程菌及其构建方法，与现有技术相比具有以下优点：

（1）克隆得到了红色红曲霉完整的Mn-SOD基因序列，确保表达获得具有活力的Mn-SOD。

（2）本发明构建的工程菌分泌的MnSOD来源于红色红曲霉，在pH3.8条件下处理1h仍具有80%的活性，具有耐酸性，可用于耐酸性超氧化物歧化酶的生产菌株；同时，利用基因工程技术生产Mn-SOD，能够解决工业上从动植物中直接分离提取SOD的原料限制问题，应用前景广阔。

（3）本发明将红曲霉Mn-SOD歧化酶基因导入到原核生物中实现表达，为红曲霉Mn-SOD歧化酶的大规模生产、分离提供了可能。

附图说明

图1为PCR目的基因产物1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2为Mn-SOD的14%SDS-PAGE电泳图谱，其中40前——未诱导细胞以40mM WashBuffer清洗所得上清液，40后——诱导细胞以40mM Wash Buffer清洗所得上清液，100前——未诱导细胞以100mM Wash Buffer清洗所得上清液，100后——诱导细胞以100mMWash Buffer清洗所得上清液，150前——未诱导细胞以150mM Wash Buffer清洗所得上清液，150后——诱导细胞以150mM Wash Buffer清洗所得上清液，500前——未诱导细胞以500mM Wash Buffer清洗所得上清液，500后——诱导细胞以500mM Wash Buffer清洗所得上清液。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、设计与筛选红色红曲霉菌基因组Mn-SOD简并引物

(1)查找Mn-SOD序列：从数据库NCBI中搜索SOD基因的氨基酸序列，选取了曲霉属(Aspergillus)中具有代表性的如下6个种的序列：红曲霉Aspergillusniger(GeneBank登录号：ABA71743.1)、烟曲霉Aspergillusfumigatus(GeneBank登录号：EAL90786.1)、米曲霉Aspergillusoryzae(GeneBank登录号：AAU04411.1)、白曲霉Aspergilluscandidus(GeneBank登录号：AAU04409.1)、黑曲霉Aspergillusphoenicis(GeneBank登录号：AAU04413.1)和黄曲霉Aspergillusflavus(GeneBank登录号：AAU04410.1)；

(2)Block比对：登录Blockmaker，对上述6个序列进行Block比对，得到3个高度保守的连续氨基酸区域；

(3)利用primer premier 5.0进行引物分析：引物不能含有牢固的自身互补序列；避免上下游引物之间互补形成引物二聚体；避免4个以上的连续单一碱基和同源碱基，上游简并引物(Forward)前端加上ECoRⅠ酶切位点、下游简并引物(Reverse)前端加上NCoⅠ酶切位点。

根据数据库比对结果，最终选取一对简并引物用于本发明实验。上游简并引物 (Forward)、下游简并引物(Reverse)的序列如下表所示。

引物	序列	退火温度/℃	酶切位点
				Forward	GGAATCCATCATGGANNTNCAC	46	<i>ECoR</i>Ⅰ
Reverse	CATGCCATGGACNANCCANNCCCANCC	60	<i>NCo</i>Ⅰ

实施例2、简并引物PCR扩增得到红曲霉的Mn-SOD部分基因

（1）用E.Z.N.A.™Fungal RNA Kit提取红色红曲霉菌总RNA，然后用ThermoFisher的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit扩增出其总cDNA；

（2）再以总cDNA作为PCR模板，用实施例1中所得的简并引物Forward：5’-GGAATCCATCATGGANNTNCAC-3’（含ECoRI酶切位点）和简并引物引物Reverse：5’-catgccatggacnanccanncccancc-3’（含NCo I酶切位点）扩增Mn-SOD基因。

反应体系：upH2O 133.5µL，10×buffer 18µL，dNTP(10µmol/L) 3.6µL，上游引物F7.2µL，下游引物R 7.2µL，Taq酶 4.5µL，模板(63.6ng/µL) 6µL。

设置PCR仪反应条件：95℃ 5min，95℃ 30s，65℃ (62.6℃、55.9℃、53.2℃、51.7℃、50℃) 30s，72℃ 1min，72℃ 10min，24℃ 1min；30个循环。

（3）反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。把10µL的PCR扩增产物和2µL的上样缓冲液混合后点入样孔中，通电调电压在80V左右，对目的基因进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，经PCR扩增获得了红色红曲霉菌基因，约350bp。

实施例3、获取红曲霉Mn-SOD全长基因，构建pET21a-MnSOD重组工程菌

（1）用胶回收试剂盒回收实施例2中所得目的基因片段，将其连接到pET-39b载体中，将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对重组菌株进行序列测定；

（2）根据所得红曲霉Mn-SOD基因的核苷酸序列设计全长扩增引物，添加酶切位点：

SODn: ggaattcatggagctgcaccacagcaagc含EcoR I酶切位点

SODx: cccaagcttaatagctgccttgagcacc含Hind III酶切位点

PCR程序为：94℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，循环30次，72℃10min后，5℃保持10min；

回收PCR产物，PCR产物与质粒pET21a表达载体分别用EcoRI和Hind III双酶切，向已灭菌的微量离心管中，依次加如下组分：T4 buffer 1µL、目的基因 SOD 3.0µL 、酶切载体 pET21a 1µL、T4连接酶 6µL，16℃水浴连接2.5h，重组质粒命名为pET21a-MnSOD，并转化感受态E.coli. BL21，通过PCR和酶切的方法筛选出阳性克隆，最后测序确定正确的阳性克隆。

实施例4、获取红曲霉Mn-SOD全长基因，构建pET28a-MnSOD重组工程菌

SODn: GGAATTCATGGAGCTGCACCACAGCAAGC 含EcoR I酶切位点

SODx: CCCAAGCTTAATAGCTGCCTTGAGCACC 含Hind III酶切位点

回收PCR产物，PCR产物与质粒pET28a表达载体分别用EcoRI和Hind III双酶切，参照实施例3，构建重组质粒，重组质粒命名为pET28a-MnSOD，并转化至感受态E.coli. BL21，通过PCR和酶切的方法筛选出阳性克隆，最后测序确定正确的阳性克隆。

实施例5、pET28a-MnSOD工程菌的诱导表达、活性及耐酸性检测

（1）用测序正确的重组质粒pET28a-MnSOD转化BL21感受态细胞，获得阳性表达菌株。用接种环取一环菌液涂布于含有卡那霉素（100mg/L）的LB琼脂平板上，分37℃过夜培养16h。挑取重组表达的单菌落接种在10ml含有50 μg/ml 卡那霉素的LB培养基中37℃、200rpm振荡恒温培养过夜，获得种子液。取8mL种子液分别接种于8个100mL含50 μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下振荡培养约2.5h。取出培养瓶，以3mL纯培养基为对照，从培养物中无菌取样3mL菌液测定450nm处的吸光度，为0.900。向7瓶培养瓶中加入1mol/L的50μL的IPTG诱导，调节培养温度至18℃，200rpm振荡培养约18h。将700mL诱导后的菌液和100mL未诱导的菌液，分别以4000rpm离心5min收集菌体沉淀，分别溶于10mLPBS。于φ6、1s/3s、20%功率分别超声波破碎诱导前后的菌液10min，以4000rpm离心收集诱导前及诱导后上清。用磁珠吸附上清，分别用500mM、150Mm、100mM、100mM、40mM的WashBuffer进行清洗，收集清洗液样品。分别取30μL样品，向其中各加入10μL 4×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃热处理10min后，取10μL进行14% SDS-PAGE电泳分析，如图2所示，获得表达Mn-SOD蛋白分子量约为18.7kD。

（2）取BL-21诱导后菌液900µL于Ep管，取pET-28a-SOD诱导后菌液600µL于Ep管。将EP管置于离心机13000g离心5min，弃上清；分别加入200µL PBS缓冲液，涡旋混匀，用超声波破胞1min（2s，4s），20%功率。破胞后冰浴2min，在4℃下16000g离心10min，取上清于新离心管中待测Mn-SOD活性。

（3）用Thermo Scientific™ GENESYS 10S 紫外-可见分光光度计检测破胞上清液在280nm的吸光度，测定酶表达量为1.09mg/mL；采用邻苯三酚自氧化法测定酶活，测得上清液Mn-SOD粗酶活为268U/mg；在不同pH条件下，分别测定上清液中重组Mn-SOD酶的酶活力，将最高的酶活定义为100%，分别计算不同pH条件下MnSOD酶活的相对酶活性。该Mn-SOD在pH3.8条件下保温处理1h后，酶活仍剩余82%。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaatccatc atgganntnc ac 22

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgccatgg acnanccann cccanccO 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattcatg gagctgcacc acagcaagcO 31

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagctta atagctgcct tgagcacc 28

<210> 5

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat ggagctgcac 60

cacagcaagc accacaacac ctacgtcaca aacctgaata aggccctcca cgcccacgcc 120

gaagcaacca aggtaaccga cctccctgcc attgtggccc tggagcccgc catcaagttc 180

aacgctggag gccacatcaa ccactccctc ttctggacca acctcactcc ccagaagagc 240

ccggaagcgt ccccagactc cgccccgaag ctgcacgagg ccatccgcca gcagtggggg 300

gatcggaaaa ccttccagca gaagttcaac gagcagctgc tgggtatcca gggtagtgga 360

tggggctggc ttgtgcggca ggggactacc ggcccgctgg ttattgtgac taccaaggat 420

caggatatcg tggggaagga tcaggttcct attttcggtg tggatatgtg ggagcatgcg 480

tattacctgc aggtgagctc tttttag 507

<210> 6

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe

1 5 10 15

Met Glu Leu His His Ser Lys His His Asn Thr Tyr Val Thr Asn Leu

20 25 30

Asn Lys Ala Leu His Ala His Ala Glu Ala Thr Lys Val Thr Asp Leu

35 40 45

Pro Ala Ile Val Ala Leu Glu Pro Ala Ile Lys Phe Asn Ala Gly Gly

50 55 60

His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Thr Asn Leu Thr Pro Gln Lys Ser

65 70 75 80

Pro Glu Ala Ser Pro Asp Ser Ala Lys Lys Leu His Glu Ala Ile Arg

85 90 95

Gln Gln Trp Gly Asp Arg Lys Thr Phe Gln Gln Lys Phe Asn Glu Gln

100 105 110

Leu Leu Gly Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Val Arg Gln Gly

115 120 125

Thr Thr Gly Pro Leu Val Ile Val Thr Thr Lys Asp Gln Asp Ile Val

130 135 140

Gly Lys Asp Gln Val Phe Ile Phe Gly Val Asp Met Trp Glu His Ala

145 150 155 160

Tyr Tyr Leu Gln Val Ser Ser Phe

165

Claims

1.一种表达红曲霉菌Mn-SOD的大肠杆菌工程菌株的构建及表达方法，其特征在于：该构建方法将红曲霉Mn-SOD歧化酶基因导入到大肠杆菌中实现表达，具体包括如下步骤：

（1）查找NCBI数据库，进行Block对比、引物分析，筛选并设计出红曲霉菌基因组Mn-SOD的简并引物，所述简并引物序列分别见SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2；

所述红曲霉菌为红色红曲霉Monascus rubber，已于2013年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M2013082；

（2）从红曲霉菌获得Mn-SOD酶基因的全长cDNA，然后在简并引物的引导下PCR扩增红曲霉菌，得到部分Mn-SOD基因；

（3）通过红曲霉菌Mn-SOD基因设计扩增引物，扩增得到完整红曲霉菌Mn-SOD基因；用PCR方法扩增Mn-SOD基因，经EcoRI和Hind III酶切点酶切后重组至相同酶切的表达质粒pET21a上，构建成pET21a-SOD；用相同的方法构建pET28a-MnSOD；

所述扩增引物序列分别见SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；

所述红曲霉菌的Mn-SOD基因序列见SEQ ID NO:5及推断的氨基酸序列见SEQ ID NO:6；

（4）将步骤（3）构建的重组质粒pET21a-SOD、pET28a-MnSOD表达载体分别导入大肠杆菌BL21细胞，并在IPTG诱导下表达得到有活性的Mn-SOD，采用邻苯三酚自氧化法测定Mn-SOD活性。