CN113667652A - 一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法 - Google Patents

一种提高sod3可溶性表达及酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因表达技术领域。本发明提供了一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加Fe3+，培养SOD3宿主细胞。结果表明通过在培养基中添加的铁离子，诱导SOD3可溶性表达，虽然表达量没有显著增加，但酶活性提高7倍左右。采用本发明方法，可实现拟南芥SOD3可溶性表达及酶活性增强，达到理想的SOD3产量和活性，为后续的SOD3使用提供物质基础。

Description

一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法
技术领域
本发明涉及基因表达技术领域，尤其涉及一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法。
背景技术
生物体内低浓度超氧阴离子自由基(O2-)是维持生命活动所必需的，其浓度过高时，可引起机体组织细胞氧化损伤，导致机体发生疾病，甚至死亡。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase；SOD)是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，与很多疾病的发生、发展密不可分。SOD复合酶是唯一能清除细胞中自由基的酶，自由基是带有不成对电子、原子或离子，其化学性质活泼，有极高的氧化性能，以夺取核酸、氨基酸等生物分子的电子，使这些物质性质演化成毒性更强的羟自由基，可导致机体的多种疾病。研究表明，机体的衰老、病变及辐射伤害都同自由基的形式有关，故SOD有抗衰老、抗辐射、消炎、抑制肿瘤和癌症的功能。研究还表明，SOD对胃病、气管炎、皮肤病、烧伤、脚气等都有独特疗效，对醒酒、亢奋精神、抗疲劳、恢复体力、减肥也有很好的效果，目前在化妆品、食品、保健品、医药、酒类、饮料等行业也已开始使用SOD，其发展前景十分广阔。
利用大肠杆菌生产蛋白质的主要优点在于易于培养，可降低生产成本；能够经过大量培养从而获得高产量的重组蛋白，但大肠杆菌的表达产物容易形成无生物学活性的包涵体，纯化后还需进行复性处理，影响了产物的回收率和活性。包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关。强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。
因此，在利用大肠杆菌生产蛋白时，如何在增加SOD3可溶性表达的同时提高酶活性就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，实现拟南芥SOD3可溶性表达及酶活性增强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加Fe3+，培养SOD3宿主细胞。
作为优选，所述培养基为LB液体培养基。
作为优选，所述培养基中Fe3+的浓度为500～1000μM，所述Fe3+添加时采用FeCl3。
作为优选，所述培养的过程为：将SOD3宿主细胞在23～27℃下培养至OD600为0.38～0.42，加入IPTG诱导剂，继续培养4～6h。
作为优选，所述SOD3宿主细胞为含有原核表达载体的大肠杆菌BL21，所述IPTG诱导剂在培养基中的浓度为0.15～0.25mM。
作为优选，所述原核表达载体为含有SOD3基因的重组质粒。
作为优选，所述质粒为pET-28a(+)质粒。
作为优选，所述SOD3基因提取自拟南芥。
作为优选，所述SOD3基因通过上下游引物扩增得到，所述上游引物的序列如SEQID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了Fe3+在增加SOD3可溶性表达及提高酶活性中的应用。
本发明提供了一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加Fe3+，培养SOD3宿主细胞。结果表明通过在培养基中添加的铁离子，诱导SOD3可溶性表达，虽然表达量没有显著增加，但酶活性提高7倍左右。采用本发明方法，可实现拟南芥SOD3可溶性表达及酶活性增强，达到理想的SOD3产量和活性。通过选择合适的表达载体和宿主细胞，且在培养基中添加Fe3+诱导培养，高效可溶性表达拟南芥SOD3，同时酶活性显著提高，使大规模制备SOD3成为可能，为后续的SOD3使用提供物质基础。
附图说明
图1为拟南芥SOD3重组质粒pET28a(+)的PCR鉴定结果；
图2为拟南芥SOD3重组质粒Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切鉴定结果；
图3为37℃诱导重组SOD3的SDS-PAGE结果；
图4为25℃低温诱导重组SOD3的SDS-PAGE结果；
图5为25℃低温诱导转染重组SOD3质粒细胞不同组分SDS-PAGE结果；
图6为镍柱纯化的SOD3的Western blotting结果；
图7为不同浓度的Fe3+诱导SOD3表达的SDS-PAGE分析；
图8为SOD3活性受不同浓度的Fe3+影响。
具体实施方式
本发明提供了一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加Fe3+，培养SOD3宿主细胞。
在本发明中，所述培养基优选为LB液体培养基。
在本发明中，所述培养基中Fe3+的浓度优选为500～1000μM，进一步优选为600～900μM，再进一步优选为750μM。
在本发明中，所述Fe3+添加时优选采用FeCl3。
在本发明中，所述培养的过程为：将SOD3宿主细胞在23～27℃下培养至OD600为0.38～0.42，加入IPTG诱导剂，继续培养4～6h。
在本发明中，所述培养的温度优选为24～26℃，进一步优选为25℃。
在本发明中，所述OD600优选为0.4。
在本发明中，加入IPTG诱导剂后培养的时间优选为5h。
在本发明中，所述SOD3宿主细胞优选为含有原核表达载体的大肠杆菌BL21。
在本发明中，所述IPTG诱导剂在培养基中的浓度优选为0.15～0.25mM，进一步优选为0.18～0.22mM，再进一步优选为0.2mM。
在本发明中，所述原核表达载体优选为含有SOD3基因的重组质粒。
在本发明中，所述质粒优选为pET-28a(+)质粒。
在本发明中，所述SOD3基因优选提取自拟南芥。
在本发明中，所述SOD3基因优选通过上下游引物扩增得到。
在本发明中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQIDNO：2所示。
本发明还提供了Fe3+在增加SOD3可溶性表达及提高酶活性中的应用
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1重组质粒构建
从GenBankDatabase中检索得到编码的拟南芥SOD3的基因序列(GenBank,NP_194240.1)。根据检索到的SOD的基因序列设计一对特异性引物SOD-F与SOD-R。SOD-F中引入HindШ位点，SOD-R中引入XhoI位点，如下用横线标出。引物由生物技术公司合成。
上游引物SOD3-F：5’CCCAAGCTTGCATGGCTGCTTCAAGTGCTGTC3’，
下游引物SOD3-R：5’CCGCTCGAGTTAAGCAGAAGCAGCCTT3’。
以拟南芥的基因组(cDNA)作为模板，以SOD3-F、SOD3-R引物进行PCR扩增。回收PCR产物，并与克隆载体pMD18-T连接，构建了重组质粒pMD18-T/SOD3。
实施例2酶切鉴定
重组质粒pMD18-T/SOD3和空质粒pET28a(+)经限制性内切酶HindШ和XhoΙ消化，两者的消化产物经T4DNA连接酶的作用进行连接，目的基因SOD3最终被克隆到表达载体pET-28a(+)上，连接产物转化DH5α涂板37℃过夜培养，挑取单克隆在含卡纳抗性的液体LB培养基中37℃过夜培养约16h后提质粒。提取质粒用HindШ和XhoI双酶切和测序进行验证，验证正确的质粒为表达载体质粒SOD3-pET28a(+)。
实施例3重组蛋白可溶性表达
含重组质粒的表达菌株在大肠杆菌细胞中诱导表达。验证正确的SOD3-pET28a(+)质粒转化BL21(DE3)中，涂板37℃过夜培养，挑取单克隆在含卡纳抗性的液体LB培养基中37℃过夜培养16～18h后，按照1％的体积比分别转接到30、100、500、750、1000uM的Fe3+的100mL的培养基中扩大培养，25℃下摇至OD600约为0.4。取出培养菌液，先取出1mL菌液作为0h的对照，剩余菌液在冰上静置20min后，LB培养基中再加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导剂，25℃下200rpm条件继续培养。5h后于4℃低温离心机4500g离心15min后弃上清，收集菌体，菌体用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤两次去除残留的LB培养基。
实施例4细胞破碎及蛋白收集
收集菌体在超声波细胞破碎仪上进行超声破碎，每100mL培养基收集的菌体最终悬浮成总体积为2.5mL，其中各组分的体积为：100mM PMSF 25μL、50mM pH8.0 Tris-HCl2.475mL。工作参数设置为：破碎功率130W，破碎时间10s，间隔时间10s，超声破碎总时间40min，整个反应在冰水浴条件下进行。超声结束后，样品在低温离心机内4℃，19000g离心20min，移出上清液至新的EP管中，再将上清离心一次，保证上清和沉淀分离彻底。
实施例5镍柱(Ni-resin)亲和纯化
纯化过程在4℃层析冷柜中进行，在10mL空柱子中加入约2mL的Ni-resin，首先用5倍柱体积的超纯水过柱三次以清洗树脂，再用10倍柱体积的Ni-resin平衡Buffer(50mMTris-HCl，150mM NaCl，pH8.0)过柱，用于平衡树脂。将柱子下方出口关闭，并将准备好的蛋白样品加入到柱体中，与树脂充分接触，上方盖上盖并轻轻混合，在4℃条件下混合2h，每隔一段时间混匀一次。打开下方出口，收集流出液并标记为镍柱流过液。柱中加入5～10倍柱体积的Ni-resin Wash Buffer(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM imidazole，pH8.0)过柱，收集流出液并标记为清洗液。在柱中加入2～3倍柱体积的不同咪唑浓度的Elution Buffer I(50mMTris-HCl，300mM NaCl，50mM imidazole，pH8.0)和ElutionBuffer II(50mMTris-HCl，300mM NaCl，100mM imidazole，pH8.0)，将结合在树脂上的目的蛋白洗脱下来，分别收集流出液，标记对应浓度下的洗脱情况。将收集液各取出80μL，每管加入20μL的5×SDS loading buffer(含β-巯基乙醇)，加热煮沸10min后，用于SDS-PAGE电泳检测，看蛋白纯化情况。
实施例6Western bloting鉴定
将纯化的蛋白分别以10ul的量上样，以10％SDS-PAGE胶电泳，电泳结束后将凝胶转膜至PVDF膜，转膜时间1h将PVDF膜置于含5％脱脂奶粉的PBS封闭液，4℃封闭过夜，PBST洗膜3次，每次10min以鼠抗HIS标签单克隆抗体为一抗(1：5000)，孵育2h，PBST洗膜3次，每次l0min，以HRP标记的羊抗兔IgG抗体为二抗(1：5000)，孵育2h，PBST洗膜3次，每次l0min，观察结果。
实施例7蛋白生物学活性检测
采用SOD活性检测试剂盒，购自碧云天生物技术公司，根据试剂盒的说明书进行检测。试剂盒采用经典的氮蓝四唑(NBT)显色法。通过试剂盒通过黄嘌呤(Xanthine)及黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)反应系统产生超氧阴离子(O2-)，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜(formazan)，后者在560nm处有强吸收。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了甲臜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。据此通过比色分析就可以计算出超氧化物岐化酶活性水平。
实验结果：
1、重组质粒的鉴定结果如图1和图2所示，图1中M为DL 2000DNA标记；1为拟南芥叶片cDNA的PCR扩增产物。图2中M1为1kbDNA标记；M2为DL 2000DNA标记；1～4为挑取的SOD3-pET28a(+)四个不同菌落双酶切电泳图。
2、37℃诱导重组SOD3的SDS-PAGE和Western blotting结果如图3所示。其中，1、2为空载体(pET28a(+))诱导0和5小时表达的全菌蛋白。3、4为空载体(pET28a(+))诱导5小时沉淀和上清。5、6、7为SOD3-pET28a诱导5小时上清、沉淀和全菌蛋白。
3、25℃低温诱导重组SOD3的SDS-PAGE和Western blotting结果如图4～6所示。图4中1、2为空载体(pET28a(+))诱导0和5小时表达的全菌蛋白；3、4为空载体(pET28a(+))诱导5小时沉淀和上清；5、6为SOD3-pET28a(+)诱导0和5小时表达的全菌蛋白；7、8为SOD3-pET28a诱导5小时沉淀和上清。图5中1为SOD3细胞超声离心裂粗液；2为镍柱纯化后的hSOD3粗酶剩余物；3为溶解液I(50mM Tris，pH8.0，300mM NaCl，50mM咪唑)洗脱镍柱收集液；4为溶解液II(50mM Tris，pH8.0，300mM NaCl，100mM咪唑)洗脱镍柱收集液；5为透析纯化hSOD3。图6为镍柱纯化的SOD3的Western blotting，M为PageRuler Plus欲染蛋白标记。
4、不同浓度的Fe3+诱导SOD3的SDS-PAGE分析结果如图7所示。M为蛋白质分子量标记；EP为质粒pET-28a(+)。
5、SOD3活性受不同浓度的Fe3+影响如图8所示。X轴代表不同浓度的离子，Y轴表示酶活，对照被定义为1。数据表示为中值的来自三个独立实验的平均值(SD)，**表示P<0.01。
由以上实施例可知，本发明提供了一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，包括如下步骤：在培养基中添加Fe3+，培养SOD3宿主细胞。结果表明通过在培养基中添加的铁离子，诱导SOD3可溶性表达，虽然表达量没有显著增加，但酶活性提高7倍左右。采用本发明方法，可实现拟南芥SOD3可溶性表达及酶活性增强，达到理想的SOD3产量和活性，为后续的SOD3使用提供物质基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 常州市第二人民医院
<120> 一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccaagcttg catggctgct tcaagtgctg tc 32
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctcgagt taagcagaag cagcctt 27

Claims (10)

1.一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：在培养基中添加Fe3+，培养SOD3宿主细胞。
2.根据权利要求1所述的一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，所述培养基为LB液体培养基。
3.根据权利要求2所述的一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，所述培养基中Fe3+的浓度为500～1000μM，所述Fe3+添加时采用FeCl3。
4.根据权利要求3所述的一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，所述培养的过程为：将SOD3宿主细胞在23～27℃下培养至OD600为0.38～0.42，加入IPTG诱导剂，继续培养4～6h。
5.根据权利要求4所述的一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，所述SOD3宿主细胞为含有原核表达载体的大肠杆菌BL21，所述IPTG诱导剂在培养基中的浓度为0.15～0.25mM。
6.根据权利要求5所述的一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，所述原核表达载体为含有SOD3基因的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，所述质粒为pET-28a(+)质粒。
8.根据权利要求7所述的一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，所述SOD3基因提取自拟南芥。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的一种提高SOD3可溶性表达及酶活性的方法，其特征在于，所述SOD3基因通过上下游引物扩增得到，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。
10.Fe3+在增加SOD3可溶性表达及提高酶活性中的应用。
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