CN107217064A

CN107217064A - 超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白

Info

Publication number: CN107217064A
Application number: CN201710626682.0A
Authority: CN
Inventors: 林峻
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2017-09-29
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: CN107217064B; WO2019019863A1; US20200149016A1

Abstract

本发明公开了一种超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白，所述超氧化物歧化酶基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，该超氧化物歧化酶基因的编码蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的蛋白序列。本发明SOD基因编码的超氧化物歧化酶兼具良好的耐热性和抗冻融性，能够广泛应用于化妆品、食品、医药学、环境保护等领域。

Description

超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白

技术领域

本发明涉及生物基因领域，具体涉及一种超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白。

背景技术

超氧化物歧化酶Orgotein(Superoxide Dismutase，SOD)，别名肝蛋白、简称：SOD。它是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低是衰老与死亡的直观指标。现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成，因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。

超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种类型。第一种是含铜、锌金属辅基的SOD，称为Cu.Zn—SOD，是最为常见的一种SOD酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰金属辅基的SOD，称为Mn—SOD，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁金属辅基的SOD，称为Fe—SOD，呈黄褐色，存在于原核细胞中。

SOD具有抗衰老、免疫调节、调节血脂、抗辐射、美容等功能，在化妆品、食品、医药学、环境保护等领域具有重要的用途。但是，现有技术中的SOD由于在耐热和抗冻融等方面存在缺陷，极大地限制了SOD的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白，该基因编码的超氧化物歧化酶兼具良好的耐热性和抗冻融性。

本发明所提供的超氧化物歧化酶基因(简称SOD基因)，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述超氧化物歧化酶基因所编码的蛋白，其蛋白序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明所述SOD基因，是从福建省福州市闽侯县收集的一份自然环境的水样品中，通过宏基因组学技术，用试剂盒提取宏基因组DNA，并直接对提取好的DNA进行PCR扩增得到。

本发明SOD基因编码的超氧化物歧化酶兼具良好的耐热性和抗冻融性，能够广泛应用于化妆品、食品、医药学、环境保护等领域。

附图说明

图1为实施例1步骤1中PCR产物的电泳图谱；

图2为实施例1步骤6的电泳图谱；上排1～6孔：左起：marker、样品6～10；下排1～7孔：左起：marker、阴性对照、样品1～5。

图3为实施例2SOD活性检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。以下未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规实验条件或者制造厂商所建议的条件。

本发明所述超氧化物歧化酶基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述超氧化物歧化酶基因的编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述SOD基因的来源，是从福建福州闽侯收集的一份自然环境的水样品中，通过宏基因组学技术，用0.22微米的微孔滤膜，通过过滤，截留其中的各种生物，用试剂盒(Mobio牌，PowerDNA Isolation Kit，14900-50-NF，USA)提取宏基因组DNA，并直接对提取好的宏基因组DNA进行PCR扩增得到。

实施例1

通过分子克隆技术，构建SOD基因的蛋白表达载体

1、对提取好的宏基因组DNA做PCR扩增(50μl体系)

PCR体系如下：

Sodinfupet15F：GTTAGCAGCCGGATCCTATTTTATCTGGTTATACCGTCTCTCAACCTCC

Sodinfupet15R：ATATGCTCGAGGATCccATGAAGTTTAGAAGTATAATCCTTGCAGGGC

PCR程序设定如下：94℃预变性10min；(94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s)，并设置30个循环；最后72℃延伸5min。

PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，图1左起第一个泳道是marker，第二个泳道是PCR产物，目的条带位置如图1所示。

本实施例所得PCR产物使用sanger法测序(ABI 3730xl测序仪双向测序，测序引物为上述Sodinfupet15F和Sodinfupet15R，由广州英骏生物公司完成)，得到本发明所述超氧化物歧化酶基因的的DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。

2、胶回收

使用Omega公司胶回收试剂盒，货号D2500-01，对步骤1的PCR产物中的目的条带进行胶回收。胶回收的PCR产物(SOD酶基因)作为后续in fusion连接反应的底物，用于连接到表达载体上。

3、线性化表达质粒的制备

质粒载体选择pET15b，先对载体酶切

在37℃下保温30min，酶切产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，用上述omega试剂盒回收酶切产物条带。胶回收产物浓度为32ng/μl。以上即为制备好的线性化的质粒载体，用于后续的In fusion反应。

4、In-Fusion连接反应

将纯化好的PCR产物与质粒表达载体相互连接，构建表达载体。

50℃保温15min，然后置于冰上。

5、转化

取In-Fusion连接反应获得的连接产物10μl，加入到大肠杆菌stbl3感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，涂LB平板(带有氨苄青霉素抗性)。将平板在37℃培养箱培养16个小时，平板上形成单克隆菌落。6、验证单克隆

挑取单克隆菌落10个(编号1—10)，分别至10个各有10μl无菌水的Ep管中，吹打混匀，各取1μl做模板进行菌落PCR，验证目的基因是否连接到质粒载体上。

PCR体系：

空质粒对照：

PCR程序设定如下：94℃预变性10min；(94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min)，并设置30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物电泳检测，通过目的条带的有无和大小，判断目的基因是否成功连接于载体,,电泳结果如图2所示。

7、测序验证与表达菌株的构建

取图2中的5号样品菌，接种到带有氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，培养过夜，菌液送至广州英骏生物公司进行sanger测序验证，使用T7上游和下游通用测序引物进行测序，结果显示序列正确。然后提取该样品的质粒DNA，将质粒DNA转化到大肠杆菌ER2566细胞(蛋白表达的宿主菌)内，将ER2566培养过夜。

实施例2

蛋白表达

1、诱导表达

1)取实施例1步骤7中过夜培养的菌液300μL，加入到30mL LB中，再加氨苄青霉素，37℃，200rpm培养。

2)大约2h后测OD值，当OD值达到0.5(0.3～0.5)时，加入IPTG，终浓度0.1mM，然后20℃，200rpm培养12h。

2、酶法裂解细胞(30mL菌液)

1)4000g，10min离心收集菌体，去上清，用高纯水洗一次(高纯水重悬沉淀再离心去除上清)。

2)每30mL菌液对应的沉淀重悬于1.2mL cell lysis buffer(pH 8.5)，buffer需要确保添加有PMSF。

3)加入溶菌酶粉末至终浓度1mg/mL，混匀，冰浴30min。

4)将离心管转移到摇床，旋紧盖子，倾斜45度放置，230rpm，25℃，震荡10min。

5)加入Triton X-100 12μL(终浓度为1％)，DNA酶0.5μL和RNA酶1μL(终浓度均为5μg/mL)，置于摇床上，230rpm，25℃，震荡15min。

6)4℃，12000g离心15min，上清为可溶蛋白组分，沉淀为细胞碎片和不溶蛋白组分。上清液用于后续实验。

上清液中基因工程重组表达的SOD，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

3、活性检测

从碧云天公司采购SOD活性检测试剂盒(WST-8法)，直接对上清液进行SOD活性的检测。

检测结果如图3所示：

带有本发明SOD基因的pET15b-SOD-ER2566，其裂解上清液中的SOD酶活性达到15个Units以上。而不带有本发明SOD基因的pET15b-ER2566(阴性对照)，其裂解上清液中SOD酶活性小于2.5个Units。

1、热稳定性试验

将带有本发明SOD基因的pET15b‐SOD‐ER2566的裂解上清液于80℃保温10分钟后，再次测定SOD酶活性，发现其仍然保留有90％的活性，说明本发明SOD酶具有良好的热稳定性。

2、抗冻融能力

将带有本发明SOD基因的pET15b‐SOD‐ER2566的裂解上清液，放入‐86℃超低温冰箱，冷冻12小时，取出，并在室温(25℃)解冻，再次测定SOD酶活性，发现其仍然保留有95％的活性，说明本发明SOD酶具有良好的抗冻融能力。

实施例3

对比试验

将GenBank编号为SDL36756.1的SOD酶的基因，人工合成(由通用生物公司合成)全基因DNA，按照实施例1和实施例2的方法，将该基因克隆到表达载体，并诱导目的蛋白表达。

1、热稳定性试验

将表达有目的蛋白的基因工程菌裂解上清液于80℃保温10分钟后，测定SOD酶活性，与未高温处理的对照组比较，发现其保留有60％的活性。

2、抗冻融能力

将表达有目的蛋白的基因工程菌裂解上清液放入‐86℃超低温冰箱，冷冻12小时，取出，并在室温(25℃)解冻，再次测定SOD酶活性，与未冻融处理的对照组比较，发现其保留有75％的活性。

由实施例2及实施例3的热稳定试验及抗冻融能力测定试验可知，与现有的SOD酶相比，本发明SOD基因编码的超氧化物歧化酶兼具良好的耐热性和抗冻融性，拓宽了其在化妆品、食品、医药学、环境保护等领域的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 741

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgctcgagg atcccatgaa gtttagaagt ataatccttg cagggctcct tgttaccctg 120

cttgcaccat cagttaaagc tcagtttacc gttcctgatt tgccttatgc ctttgatgcc 180

cttgagcccg caattgataa ggagacgatg cagatccatc acgataagca tcatgctgca 240

tatgtaaaaa atcttaacga cgcggttaag ggaactgccc aagaaaagca aacccttgct 300

caaatcctgg cagcggtgtc taaagcttcc cctgcagtac gaaataatgc tggcggacat 360

tataaccaca gcctcttctg gcagatcatg gcgccgaaag cacaggctcc ttctgccgca 420

tttctaaagg tgatcgatgc acagtttggt tctcttgata agtttaaagc cgcctttgct 480

gactccgccg ccaagcgctt tggttcagga tgggcctggc tgattgttca gaaaggtaag 540

ttgaagatca ccaccactcc taatcaggac aatccgctga tggatgttgt aaaggagaag 600

ggaacgccga tcctggccct cgacgtttgg gaacacgcct actatctgaa gtatcagaac 660

aagcggcctg actatatctc cgcatggtgg acggtcgtaa actggccgga ggttgagaga 720

cggtataacc agataaaata g 741

<210> 2

<211> 246

<212> PRT

<213> 未知

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Leu Glu Asp Pro Met Lys Phe Arg Ser Ile Ile

20 25 30

Leu Ala Gly Leu Leu Val Thr Leu Leu Ala Pro Ser Val Lys Ala Gln

35 40 45

Phe Thr Val Pro Asp Leu Pro Tyr Ala Phe Asp Ala Leu Glu Pro Ala

50 55 60

Ile Asp Lys Glu Thr Met Gln Ile His His Asp Lys His His Ala Ala

65 70 75 80

Tyr Val Lys Asn Leu Asn Asp Ala Val Lys Gly Thr Ala Gln Glu Lys

85 90 95

Gln Thr Leu Ala Gln Ile Leu Ala Ala Val Ser Lys Ala Ser Pro Ala

100 105 110

Val Arg Asn Asn Ala Gly Gly His Tyr Asn His Ser Leu Phe Trp Gln

115 120 125

Ile Met Ala Pro Lys Ala Gln Ala Pro Ser Ala Ala Phe Leu Lys Val

130 135 140

Ile Asp Ala Gln Phe Gly Ser Leu Asp Lys Phe Lys Ala Ala Phe Ala

145 150 155 160

Asp Ser Ala Ala Lys Arg Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Ile Val

165 170 175

Gln Lys Gly Lys Leu Lys Ile Thr Thr Thr Pro Asn Gln Asp Asn Pro

180 185 190

Leu Met Asp Val Val Lys Glu Lys Gly Thr Pro Ile Leu Ala Leu Asp

195 200 205

Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Lys Tyr Gln Asn Lys Arg Pro Asp

210 215 220

Tyr Ile Ser Ala Trp Trp Thr Val Val Asn Trp Pro Glu Val Glu Arg

225 230 235 240

Arg Tyr Asn Gln Ile Lys

245

Claims

1.超氧化物歧化酶基因，其特征在于：所述基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的超氧化物歧化酶基因所编码的蛋白，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。