CN114277004B - 一种耐高温重组突变型sod及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用，以耐高温菌Acidilobus saccharovorans的SOD序列为基础，将其编码蛋白的氨基酸序列中164L突变为I以及168V突变为E，从而提高SOD的活性、热稳定性、耐酸碱性以及耐胰蛋白酶消化性，其活性至少提高60％以上，活性显著高于现有技术生产的SOD的活性，耐高温突重组变型SOD包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，还提供了在制备超氧化物歧化酶产品中的应用，特别是在医药、食品、化妆品等行业，本发明具有突变酶活显著提高，耐胰蛋白酶消化，具有较高蛋白稳定性，耐高温等技术特点。

Description

一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及酶及其编码基因与应用，特别涉及一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用，属于生物基因工程领域。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢过程的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，对细胞生命活动具有重大意义。超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为四类：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。

SOD不但能维持生物体内活性氧的产生与消除的动态平衡，并且能够有效抑制活性氧过多而引发的各种氧化损伤，对癌症、炎症、辐射损伤等均有一定的疗效，还可减少抗癌药物对细胞和心脏的毒副作用，是具有抗肿瘤活性的最有效的抗氧化酶之一，因此在保健品、医药、化妆品、食品、农业等领域中具有重要的应用价值。然而，在实际应用中SOD仍然存在一些不足，如热稳定性差，在高温下易失活；天然SOD分离纯化成本昂贵等。虽然目前的基础研究已经证明了SOD的功效和作用方式，但由于现有技术中的SOD在热稳定性、活性维持等方面存在缺陷，因此其极大地限制了SOD在化妆品、食品和医药、农业领域中的应用，不能很好地达到预期的效果。

发明内容

为解决现有技术中存在的不足，本发明提供一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用，具有突变酶活显著提高，耐胰蛋白酶消化，具有较高蛋白稳定性，耐高温等技术特点。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明一种耐高温重组突变型SOD，耐高温突重组变型SOD包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明一种编码耐高温重组突变型SOD的核苷酸序列，包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列核苷酸序列。

优选的，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明一种重组表达载体，包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明一种重组菌，包含上述重组表达载体。

本发明一种所述的耐高温重组突变型SOD的制备方法，包含以下步骤：培养上述所述的重组菌，从重组菌中得到超氧化物歧化酶。

本发明一种所述耐高温重组突变型SOD的纯化方法，包含以下步骤：

A：诱导表达所述的重组菌，菌液离心集菌后，超声破碎，收集破碎后上清；

B：上清利用镍柱亲和层析；

C：超滤脱盐，冻干保存。

优选的，所述耐高温重组突变型SOD的纯化方法，镍柱洗脱液咪唑浓度为500mmol/L。

所述SEQ ID NO.1序列，或编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列核苷酸序列或SEQID NO.2所示的核苷酸序列，或所述的重组表达载体，或所述的重组菌，或所述的耐高温重组突变型SOD的制备方法，在制备超氧化物歧化酶产品中的应用。

有益效果：

1、突变型SOD和未突变SOD酶活分别为1860U/mg、1130U/mg，因此，经过突变酶活显著提高。

2、本发明提供的耐高温突变型SOD，在pH 2-10的条件下具有较高的稳定性。

3、本发明提供的耐高温突变型SOD，在pH 4-10的条件下具有较高的活性，具有较强的耐酸碱性。

4、本发明提供的耐高温突变型SOD，经过60摄氏度处理后，活性提高，且是高温处理的最佳温度。

5、本发明提供的耐高温突变型SOD，能够耐胰蛋白酶消化，具有较高蛋白稳定性，可应用于口服，市场前景广阔。

附图说明

图1：扩增突变SOD基因双酶切图；

图2：扩增突变SOD基因与载体双酶切电泳图；

图3：菌落PCR扩增图；

图4：重组载体pET-28a-SOD的酶切鉴定图；

图5：耐高温突变型重组SOD蛋白的诱导表达和表达模式鉴定图；

图6：耐高温突变型重组SOD蛋白纯化图；

图7：耐高温突变型重组SOD与野生型SOD耐高温实验图；

图8：不同pH条件处理耐高温突变型重组SOD蛋白的酶活鉴定图；

图9：不同浓度的胰蛋白酶对耐高温重组突变型SOD蛋白的稳定性影响图。

图7中：不同pH条件处理耐高温突变型重组SOD蛋白的稳定性鉴定，M为maker，1为常温突变型SOD上清，2为常温野生型SOD上清，3为80℃处理30分钟后的突变型SOD上清，4为80℃处理30分钟后的野生型SOD上清，5为60℃处理30分钟后的突变型SOD上清，6为60℃处理30分钟后的野生型SOD上清。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

本发明提供的耐高温突变型SOD及其编码基因，利用生物信息学方法，以耐高温菌Acidilobus saccharovorans的SOD序列为基础，将为164L突变为I、168V突变为E，从而提高SOD的活性、热稳定性、耐酸碱性以及耐胰蛋白酶消化性，其活性提高60％以上，且活性显著高于现有技术生产的SOD的活性，如专利文献CN201810105875.6记载的纯化耐高温SOD的比活为1315U/mg；CN200510061502.6记载的大肠杆菌表达SOD的比活为1100U/mg，本申请突变型SOD酶活为1860U/mg。本申请突变体蛋白生产成本低，产量大，具有较大的应用价值，在医药、食品、化妆品等行业有广泛的应用前景。

实施例1

突变型耐高温SOD基因的获得

1.通过NCBI序列检索分析，得到耐高温菌Acidilobus saccharovorans(GenBank登录号：NC_014374.1)，将其编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO.5：MVVSLKRYELPPLPYNYDALEPIISAETLRYHHDKHHLGYVNGANAALDKLEKYLNGQLTDIDVRAVSRDFEFNYGGHILHTLYWLNMAPKGKGGGTPGGAIGDAINKFFGSFDKFKKLFGDAAKNVEGVGWAILAYDPVTGDLRILQVEKHNNVVTTNLIPLLAVDVFEHAYYIDYRNDRAKYVDSWWDLINWDDVEARYQKALNTPKLI中164L突变为I、168V突变为E。突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MVVSLKRYELPPLPYNYDALEPIISAETLRYHHDKHHLGYVNGANAALDKLEKYLNGQLTDIDVRAVSRDFEFNYGGHILHTLYWLNMAPKGKGGGTPGGAIGDAINKFFGSFDKFKKLFGDAAKNVEGVGWAILAYDPVTGDLRILQVEKHNNVVTTNLIPLIAVDEFEHAYYIDYRNDRAKYVDSWWDLINWDDVEARYQKALNTPKLIL。根据氨基酸序列SEQ ID NO.1设计可以翻译得到SEQ ID NO.1序列的DNA序列。实际可根据表达菌的密码子偏爱性进行设计，本实施例采用如SEQ ID NO.2所示的DNA序列：

ATGGTGGTCTCCCTCAAGAGGTACGAGCTCCCGCCTCTTCCGTATAATTATGATGCTCTCGAGCCAATAATAAGCGCTGAAACGCTAAGGTATCACCACGACAAGCACCACCTGGGCTACGTCAACGGCGCCAACGCTGCTCTTGACAAGCTTGAGAAGTACCTCAACGGCCAGCTGACTGACATAGACGTGAGGGCCGTGAGCAGGGACTTCGAGTTCAACTACGGAGGACACATACTTCACACGCTCTACTGGCTTAACATGGCTCCCAAGGGCAAGGGTGGAGGAACCCCTGGAGGCGCCATTGGGGACGCAATAAACAAGTTCTTCGGCTCCTTTGACAAGTTTAAGAAGCTCTTCGGCGACGCGGCCAAGAACGTTGAGGGCGTGGGATGGGCCATACTTGCATATGACCCGGTCACAGGCGACCTGAGGATACTGCAGGTTGAGAAGCACAACAACGTCGTCACCACAAACCTGATACCACTGATCGCGGTTGACGAGTTCGAGCACGCCTACTACATAGACTACAGGAACGACAGGGCCAAGTACGTTGACAGCTGGTGGGACCTGATAAACTGGGACGACGTCGAGGCCAGGTACCAGAAGGCCTTGAACACGCCAAAACTGATACTTTGA

2.人工合成SEQ ID NO.2并连接到T载体上。

实施例2

含有突变型耐高温SOD基因的重组载体构建

根据SEQ ID NO.2设计引物，分别引入酶切位点(优选BamH I和EcoRI)，引物序列如下：F1：SEQ ID NO.3:CGggatccATGGTGGTCTCCCTCAAGAG(小写为BamH I位点)R1：SEQ IDNO.4:CGgaattcTCAAAGTATCAGTTTTGGCG(小写为EcoR I位点)以含有SEQ ID NO.2所示基因序列的T载体为模板，F1和R1为引物，进行PCR反应，获得目的基因的PCR产物(如图1-2所示)。

具体反应体系和步骤如下：

1、按如下体积加样进行PCR反应：

2、用漩涡震荡期混匀反应液。

3、用离心机短暂快速离心使EP管壁上的液体流下来。

4、在PCR仪上设置好程序，按下列条件在PCR仪上进行PCR反应。

5、取出样品4℃保存，以备后续凝胶电泳鉴定分析PCR结果。

6、将PCR产物用BamH I和EcoR I双酶切(如图1所示)，与同样经过BamH I和EcoR I双酶切的表达载体(优选pET28a)(如图2所示)连接，获得重组表达载体pET28a-SOD。

实施例3

重组表达菌的构建

一)感受态细胞制备

1、从LB平板上挑取新活化的BL21(DE3)单菌落，播种于4ml的LB培养基中，于37℃摇床上振动培养2小时。

2、从步骤1中培养的菌液中取100μL菌液于4mL培养基中，37℃摇床上培养2小时，将后续所需的EP管预冷10min。

3、取1mL步骤2中的菌液于无菌EP管中，冰上放置10min，4℃，4000转速离心5min(如出现大量黑色沉淀则表明细胞大量死亡)。

4、弃去上清液，加入1mL预冷的氯化钙溶液，轻轻吹打，冰浴30min。

5、将步骤4中冰浴后的溶液放在4℃，4000转速离心机中离心5min，弃去上清液，回收细胞，加入200μL预冷的氯化钙溶液，轻轻吹打混匀，冰浴2-4小时备用。

6、如需要长期使用，按照1:1比例加入甘油，在-80℃中可以长期保存。

二)连接与转化

1、在EP管中分别加入10μL的Solution I，7μL前面获得的PCR扩增纯化产物(重组表达载体pET28a-SOD)和3μL纯化的酶切载体，使总体积保持在20μL。

2、在16℃水浴中反应30min，获得连接产物。

3、将上述10μL连接产物加入到100μL感受态细胞的EP管中，用枪头轻轻搅拌，不可吹打。

4、将步骤3中的EP管冰浴30min，30min之后将EP管放置42℃恒温水浴锅里水域90秒，90秒过后，再将冰浴3min。

5、在步骤4的EP管中加入1mL的预热LB培养基，放37℃摇床振荡培养1小时。

6、将步骤5中的EP管放置4℃、3000转速的离心机中离心10min，去部分上清液，留400μL菌液。

7、将步骤6中的菌液用枪头吹打，取200μL菌液涂板，涂板后放置37℃培养箱里培养，半小时后翻板(倒置一次)，培养过夜。

8、挑取单克隆进行菌落PCR以及双酶切鉴定，鉴定结果如图3、图4所示。获得阳性克隆，即获得可表达耐高温突变重组SOD的重组表达菌BL21-pET28a-SOD。

实施例4

重组耐高温突变型SOD蛋白的诱导表达

取重组BL21-pET28a-SOD大肠杆菌100μL分别加入5ml含有Kan的LB液体培养基中。放入37℃培养摇床中220rpm振荡培养至OD_600nm约为0.5，菌液呈混浊状(约5-6h)。取菌液300μL分别加入5ml含有Kan的LB液体培养基中。放入37℃培养摇床中220rpm振荡培养至OD_600nm约为0.5-1.0，菌液呈混浊状(约3-4h)。取两份1ml菌液，加入5ml的LB液体培养基中，一份加入5μL IPTG，37℃振荡培养，诱导过夜。另一份不加，作为对照组。

SDS-PAGE检测

1、样品处理：取上述诱导、未诱导菌液各1ml，12000rpm离心1min，弃上清，加入100μLPBS重悬菌体沉淀；取上述诱导后的菌液1.5ml于ep管，12000rmp，离心1min，弃上清，加500μLPBC重悬；破碎：将ep管置于冰上，用细胞破碎仪，转3s，停3s，破碎10min；后12000rpm，离心5min，收集上清100μL，向沉淀中加入100μLPBS重悬；向上述100μL SOD诱导菌、100μLSOD未诱导菌、100μL SOD诱导菌破碎后上清、100μL SOD诱导菌破碎后沉淀100μL均加入20μL，5×loading buffer，混匀，沸水(100℃)中煮10min；冷却后12000rpm，3min离心，上清作为样品备用。

2、电泳按说明书配制12％PAGE胶，加样，80V电泳20min，待样品进入分离胶将电流调至120V 60min。结果如图5(M:蛋白预染Marker；1：未诱重组导菌；2：诱重组菌；3:诱导重组菌破碎后上清；4：诱导重组菌破碎后沉淀；)所示，由图5可以得出结论：和未诱导的工程菌相比SOD获得成功表达，大小都在25kDa左右，与理论一致表达产物主要存在于超声上清中，表明重组蛋白没有形成包涵体。上述结果表明，已成功通过基因工程的方法制备得到了来自于极端嗜热菌的重组突变型耐高温SOD酶。

实施例5

重组耐高温突变型SOD蛋白的纯化

重组表达菌诱导后，离心去菌体，按照菌液：洗涤液15:1-3的比例向菌体中加入50mM的咪唑洗脱液，超声破碎，12000rpm，离心10min，取上清。

纯化步骤如下：

1、缓冲液预处理镍柱，冰上摇晃10min后，将镍柱内的缓冲液利用重力作用流尽；

2、加入50mM的咪唑洗脱液洗涤4次，留样；

3、将5mL超声破碎上清蛋白样加入到镍柱中，冰上缓慢摇晃结合2h以上；

4、结合完毕后，同样利用重力作用使镍柱内的结合液缓慢流出，收集流穿液；

5、分别加入50mM、100mM、200mM和500mM的咪唑洗脱液，冰上缓慢摇晃洗脱20-40min，收集洗脱液；(优选先加50mM咪唑洗脱液洗脱30min，再加入500mM的咪唑洗脱液洗脱20min，收集500mM的咪唑洗脱的洗脱液)即得到纯化的重组耐高温突变型SOD蛋白。

6、5kD超滤膜脱盐，冻干保存。

实验结果如图6(图中，M：蛋白Marker；1：超声破碎上清；2：流穿样；3：洗涤液①；4：洗涤液②；5：洗涤液③；6:50mM咪唑洗脱液；7:100mM咪唑洗脱液；8:200mM咪唑洗脱液；9:500mM咪唑洗脱液)所示，500mM咪唑洗脱液洗脱效果最佳。

实施例6

重组耐高温突变型SOD蛋白的浓度及活性检测

按照GBT5009.171第一法检测实施例5得到的SOD冻干粉酶活。重组耐高温突变型SOD蛋白酶活结果测得为突变的耐高温菌SOD酶活为1860U/mg，未突变的重组野生型SOD酶活为1130U/mg。其中，未突变的重组野生型SOD是采用实施例1-5提到的方法，表达纯化得到的如SEQ ID NO.5所示的未突变的重组野生型SOD蛋白。

实施例7

重组耐高温突变型SOD蛋白的热稳定性实验

1、分别取3管5ml实施例4得到的诱导表达菌超声离心后的上清液，以及按照实施例1-4的方法同步获得的野生型重组表达菌超声离心后的上清液；

2、分别于常温、60℃、80℃水浴锅水浴30分钟；

3、待其恢复到室温后，测定SOD变性情况。

结果发现该耐高温重组突变SOD经高温处理后活性明显高于未突变的野生型SOD。尤其是经过80摄氏度处理后，突变型SOD耐高温性显著高于野生型。结果见图7

实施例8

耐高温重组突变型SOD蛋白耐酸碱性实验

1、取7个15ml的离心管，分别编号为1-6；

2、分别加入pH为2、4、6、7、8、10的PBS缓冲液于上述离心管；

3、加入100微升的耐高温重组突变型SOD蛋白，混匀；

4、于37℃恒温箱反应30分钟；

5、评估酶活性，并进行琼脂糖凝胶电泳检测稳定性。

稳定性结果如图8所示，其中各泳道样品如下：M:蛋白预染Marker；1：pH为2(上清)；2：pH为2(沉淀)3：pH为4(上清)；4：pH为4(沉淀)；5：pH为6(上清)；6：pH为6(沉淀)7：pH为7(上清)；8：pH为7(沉淀)9：pH为8(上清)；10：pH为8(沉淀)11：pH为10(上清)；12：pH为10(沉淀)。由该图可知，pH在2～10的范围，SOD蛋白的稳定性较高。不同pH条件下耐高温突变型SOD酶活，在pH为2的情况下，和pH为7的样品相比，AsSOD的活性显著降低，但pH在4～10的范围内其酶活较pH为7时的酶活无显著差异。表明目的本发明得到的耐高温突变型SOD蛋白具有较强的耐酸碱能力。

实施例9

不同浓度的胰蛋白酶对耐高温重组突变型SOD蛋白的稳定性影响

1、取3个15ml试管，编号为1、2、3；

2、向其中分别加入0.05％、0.025％、0.0125％的胰蛋白酶溶液；

3、向试管中加入100μL 0.5mg/mL重组蛋白；

4、于37℃孵育30min；

5、待其恢复到室温后，测定酶活性并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

经过0.05％、0.025％、0.0125％的胰蛋白酶消化处理，结果如图9所示，泳道1、泳道2、泳道3中都有突变重组SOD条带存在，证明突变重组的SOD蛋白能够耐胰蛋白酶消化，具有较高蛋白稳定性。

实施例10

本发明提供的重组耐高温突变SOD在生物医药、保健品、食品、化妆品、农业等方面的应用。

最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

发明名称：一种耐高温重组突变型SOD及其编码基因和应用

申请人：浙江安各洛生物技术有限公司

氨基酸序列SEQ ID NO.1：

MVVSLKRYELPPLPYNYDALEPIISAETLRYHHDKHHLGYVNGANAALDKLEKYLNGQLTDIDVRAVSRDFEFNYGGHILHTLYWLNMAPKGKGGGTPGGAIGDAINKFFGSFDKFKKLFGDAAKNVEGVGWAILAYDPVTGDLRILQVEKHNNVVTTNLIPLIAVDEFEHAYYIDYRNDRAKYVDSWWDLINWDDVEARYQKALNTPKLIL。

核苷酸序列SEQ ID NO.2：

ATGGTGGTCTCCCTCAAGAGGTACGAGCTCCCGCCTCTTCCGTATAATTATGATGCTCTCGAGCCAATAATAAGCGCTGAAACGCTAAGGTATCACCACGACAAGCACCACCTGGGCTACGTCAACGGCGCCAACGCTGCTCTTGACAAGCTTGAGAAGTACCTCAACGGCCAGCTGACTGACATAGACGTGAGGGCCGTGAGCAGGGACTTCGAGTTCAACTACGGAGGACACATACTTCACACGCTCTACTGGCTTAACATGGCTCCCAAGGGCAAGGGTGGAGGAACCCCTGGAGGCGCCATTGGGGACGCAATAAACAAGTTCTTCGGCTCCTTTGACAAGTTTAAGAAGCTCTTCGGCGACGCGGCCAAGAACGTTGAGGGCGTGGGATGGGCCATACTTGCATATGACCCGGTCACAGGCGACCTGAGGATACTGCAGGTTGAGAAGCACAACAACGTCGTCACCACAAACCTGATACCACTGATCGCGGTTGACGAGTTCGAGCACGCCTACTACATAGACTACAGGAACGACAGGGCCAAGTACGTTGACAGCTGGTGGGACCTGATAAACTGGGACGACGTCGAGGCCAGGTACCAGAAGGCCTTGAACACGCCAAAACTGATACTTTGA

引物F1 SEQ ID NO.3 :CGggatccATGGTGGTCTCCCTCAAGAG

引物R1 SEQ ID NO.4 :CGgaattcTCAAAGTATCAGTTTTGGCG

SEQ ID NO.5：

MVVSLKRYELPPLPYNYDALEPIISAETLRYHHDKHHLGYVNGANAALDKLEKYLNGQLTDIDVRAVSRDFEFNYGGHILHTLYWLNMAPKGKGGGTPGGAIGDAINKFFGSFDKFKKLFGDAAKNVEGVGWAILAYDPVTGDLRILQVEKHNNVVTTNLIPLLAVDVFEHAYYIDYRNDRAKYVDSWWDLINWDDVEARYQKALNTPKLI

Claims (9)

1.一种耐高温重组突变型SOD，其特征在于：所述耐高温突重组变型SOD为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.一种编码如权利要求1所述的耐高温重组突变型SOD的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列为编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于：包含如权利要求2或3所述的核苷酸序列。

5.一种重组菌，其特征在于：包含如权利要求4所述的重组表达载体。

6.一种如权利要求1所述的耐高温重组突变型SOD的制备方法，其特征在于其制备方法包含以下步骤：培养权利要求5所述的重组菌，从重组菌中得到超氧化物歧化酶。

7.一种如权利要求1所述的耐高温重组突变型SOD的纯化方法，其特征在于其纯化方法包含以下步骤：

A：诱导表达权利要求5所述的重组菌，菌液离心集菌后，超声破碎，收集破碎后上清；

B：上清利用镍柱亲和层析；

C ：超滤脱盐，冻干保存。

8.根据权利要求7所述的纯化方法，其体征在于：镍柱洗脱液咪唑浓度为500mmol/L。

9.一种如权利要求1中所述的氨基酸序列，或权利要求2或3所述的核苷酸序列，或权利要求4所述的重组表达载体，或权利要求5所述的重组菌，或权利要求6所述的方法在制备超氧化物歧化酶产品中的应用。