CN112912059A - 包含极端微生物的sod酶的植物细胞提取物的工业应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗氧化活性的组合物，其包含源自植物细胞培养物的第一干提取物，所述第一干提取物包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶，源自植物细胞培养物的第二干提取物，所述第二干提取物包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶，和源自植物细胞培养物的第三干提取物，所述第三干提取物包含来自耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶，其中所述植物细胞培养物是属于番茄属细胞的培养物。

Description

包含极端微生物的SOD酶的植物细胞提取物的工业应用
技术领域
本发明一般涉及用于皮肤化妆品、生物医学、保健品和食品领域的源自植物细胞培养物的提取物以及包含它们的相关组合物和制剂的工业用途，所述提取物包含极端生物体的酶。
背景技术
已知形成活细胞的蛋白质、DNA、脂质和其他大分子的氧化是由来自内源(代谢和其他细胞过程)或外源(暴露于香烟烟雾、臭氧、电离辐射、重金属和UV辐射)的活性氧(ROS)或其他自由基触发的化学过程。具有重要生理意义的主要ROS是：超氧阴离子(O2 -)、自由基羟基(OH-)和过氧化氢(H2O2)。在中等浓度下，ROS参与细胞的生理过程，但在较高浓度下，ROS可以改变DNA的结构并不可逆地修饰蛋白质和脂质。特别是，膜脂质是最暴露于细胞外环境的分子，因此最先受到ROS的攻击，ROS通过触发“过氧化”过程损害脂质和整个细胞的结构和功能完整性(Ayala等，2014)。
由于ROS的危险性，细胞已发展出保护机制，包括由抗氧化酶介导的“清除剂”，能够将ROS转化为分子氧(O2)和水(H2O)。然而，当ROS水平超过细胞通过保护机制中和它们的能力时，就会发生一种称为“氧化应激”的情况，其中自由基的反应性占主导地位，通常是由外在或外部因素引起的，包括暴露于香烟烟雾、臭氧、电离辐射、重金属(铜、铁、镉、铅和汞)和UV辐射。超氧阴离子(O2 -)是在氧化应激条件下产生的主要自由基，可通过超氧化物歧化酶(SOD)转化为H2O2，再通过过氧化氢酶转化为H2O和O2。超氧化物歧化酶与过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶一起构成氧化应激的所谓“一线防御系统”(Ighodaro和Akinloye，2017年)。
还已知超氧化物歧化酶是“金属蛋白”家族的抗氧化酶，因此需要金属离子作为辅助因子来执行其酶促功能。
根据所结合的金属离子，超氧化物歧化酶可分为Fe-SOD(存在于原核生物和某些植物的叶绿体中)，Mn-SOD(存在于原核生物和真核线粒体中)和Cu/Zn-SOD(存在于真核生物中且位于植物的胞质溶胶、过氧化物酶体和叶绿体中)。
因此，超氧化物歧化酶存在于所有生物体中，并且特别集中在人类的脑、肝、心脏、肾脏和红细胞中。在人类细胞中，Cu/Zn-SOD位于胞质溶胶中，而Mn-SOD位于线粒体中，尽管组织间隙和细胞外液(例如血浆、淋巴液和滑液)中存在细胞外亚型。在动物和人类中都已经观察到SOD缺乏与大量疾病之间的关联。
实际上，作为抗氧化酶的超氧化物歧化酶对于预防神经退行性疾病例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和动脉粥样硬化非常重要，因为它们抵消活性氧的产生。确实，已知SOD的水平随着细胞年龄的增长而显著降低，而自由基则逐渐增加(Valgimigli等，2015)。已经提出，适当的SOD补充可以减慢整个细胞衰老过程，保护免疫系统并显著减少疾病的发生。
氧化现象也影响食品的保鲜。实际上，众所周知，诸如肉和鱼等产品的氧化会导致产品的外观、味道和营养价值迅速恶化；在极端情况下，由于食物中组胺水平高，肉类不正确的储存可能会导致食物中毒。实际上，组胺具有很高的热稳定性，不会被正常的烹饪温度破坏。结果，即使随后煮熟，保存不当的肉也可能含有高水平的组胺(被认为是分解的早期指标)，并且可能损害消费者的健康。
尤其是，红肉鱼例如金枪鱼的外观和颜色是食品定性评估的重要参数，可以确定其商业价值。氧气与肌红蛋白的血红素基团结合时产生的氧合肌红蛋白所呈现的鲜红色通常会吸引消费者。相反，由氧合肌红蛋白自氧化过程转变为高铁肌红蛋白而引起的棕褐色着色是不再新鲜的产品的典型特征。
还已知食品特别是油和不饱和脂肪的另一种氧化过程，即酸败现象。这是由于一系列脂质氧化反应导致短链脂肪酸例如丙酸和丁酸的形成，这产生了令人不愉快的气味并改变了口味。
已知使用抗氧化剂来抵消上述氧化现象，例如维生素C、维生素E和其他合成来源的化合物，例如称为BHA 20的叔丁基-4-羟基茴香醚。尽管BHA是最有效的，但它不能大量使用，因为它是一种有害的化合物，会导致多种副作用，而维生素随着时间的推移不是很稳定，并且经历由高温或高盐浓度条件引起的水解过程(Donnelly等，1989)。
还已知超氧化物歧化酶在皮肤化妆品、生物医学和保健品以及食品领域中的用途，其中强烈需要能够中和自由基形成的化合物。
特别是，工业领域中使用的超氧化物歧化酶通常来自嗜温生物，因此，它们在37℃至50℃的温度条件、1％盐度、7.0-7.5中性pH下稳定且有活性。因此，这些酶在比上述条件更苛刻的温度、盐度和pH条件下以及在暴露于UV辐射的条件下均无活性，这限制了它们在工业水平上的使用。
例如，在用于皮肤的防晒产品中使用SOD会带来抗UV和温度稳定性差的问题；保健品中添加的酶由于胃环境中的极酸性pH表现出与结构稳定性有关的问题；最后，用于食品市场的产品通常以高浓度的盐为特征，这也会对SOD的酶促活性产生负面影响。
此外，已知由从细菌中分离和纯化的过程产生的酶可能会受到细菌来源的有毒或过敏原化合物的可能污染。
本发明解决的问题是提供一种包含超氧化物歧化酶的组合物，该超氧化物歧化酶在宽范围的温度、盐度和pH和/或在UV辐射的存在下是稳定和有活性的，并且不含任何污染物、有毒物质、致敏或细菌衍生的化合物。
发明内容
根据本发明，通过提供一种具有抗氧化活性的组合物来解决上述技术问题，该组合物包含源自植物细胞培养物的第一干提取物，所述第一干提取物包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶，源自植物细胞培养物的第二干提取物，所述第二干提取物包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶，和源自的植物细胞培养物的第三干提取物，所述第三干提物包含来自耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶。优选地，该植物细胞培养物是属于番茄属的细胞的培养物。
优选地，组合物包含一重量份的包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物，0.01至100重量份、优选0.5-2重量份的包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物，和独立地包含0.01至100重量份、优选0.5-2重量份的耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物。
优选地，该组合物包含一重量份的包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物，一重量份的包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物，和一重量份的耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物。
优选地，组合物还包含至少一种亲水性溶剂，其选自水、盐水溶液和有机溶剂。
在一方面，本发明涉及如上定义的组合物的化妆品用途。
在另一方面，本发明涉及如上定义的组合物作为食品保鲜剂的用途。
本发明还涉及用于局部施用的化妆品制剂，其包含如上定义的组合物，至少一种化妆品活性物质和化妆品可接受的载体。
优选地，上述的制剂为凝胶、乳霜或洗剂的形式。
在一方面，本发明还涉及包含如上定义的组合物的食品或保健品。
本发明还涉及具有抗氧化活性的组合物，其包含源自植物细胞培养物的干提取物，所述提取物包含耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶。
优选地，上述组合物还包含至少一种亲水性溶剂，其选自水、盐水溶液和有机溶剂。
优选地，该植物细胞培养物是属于番茄属的细胞培养物。
在一方面，本发明涉及上述组合物的化妆品用途。
在一方面，本发明涉及上述组合物作为食品保鲜剂的用途。
在一方面，本发明还涉及用于局部施用的化妆品制剂，其包含如上所定义的组合物、至少一种化妆品活性物质和化妆品可接受的载体。
优选地，该制剂为凝胶、乳霜或洗剂的形式。
在另一方面，本发明还涉及包含如上定义的组合物的食品或保健品。
本发明还涉及具有抗氧化活性的组合物，其包含源自植物细胞培养物的干提取物，所述提取物包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶。
优选地，上述组合物还包含至少一种亲水性溶剂，其选自水、盐水溶液和有机溶剂。
优选地，该植物细胞培养物是属于番茄属的细胞培养物。
在一方面，本发明涉及上述组合物的化妆品用途。
在一方面，本发明涉及上述组合物作为食品保鲜剂的用途。
在一方面，本发明还涉及用于局部施用的化妆品制剂，其包含如上所定义的组合物、至少一种化妆品活性物质和化妆品可接受的载体。
优选地，该制剂为凝胶、乳霜或洗剂的形式。
在另一方面，本发明还涉及包含如上定义的组合物的食品或保健品。
本发明还涉及具有抗氧化活性的组合物，其包含源自植物细胞培养物的干提取物，所述提取物包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶。
优选地，前述组合物还包含至少一种亲水性溶剂，其选自水、盐水溶液和有机溶剂。
优选地，该植物细胞培养物是属于番茄属的细胞培养物。
在一方面，本发明涉及上述组合物的化妆品用途。
在一方面，本发明涉及上述组合物作为食品保鲜剂的用途。
在一方面，本发明还涉及用于局部施用的化妆品制剂，其包含如上定义的组合物、至少一种化妆品活性物质和化妆品可接受的载体。
优选地，该制剂为凝胶、乳霜或洗剂的形式。
在另一方面，本发明还涉及包含如上定义的组合物的食品或保健品。
有利地，本发明的组合物包含植物细胞培养物提取物，该植物细胞培养物提取物包含源自极端微生物的超氧化物歧化酶，该超氧化物歧化酶在宽范围的温度、盐度和pH下和/或在UV辐射的存在下是稳定的和有活性的。与使用单独的制剂相比，在混合物中使用三种提取物具有优势，因为在混合物中存在三种极端微生物SOD，它们各自在不同的物理条件下具有不同的特性和高催化性能，使得能够覆盖在高温、高盐度、低pH值或高剂量紫外线条件下需要抗氧化作用的广泛应用。
该有利特征使本发明的组合物适用于皮肤化妆品领域，因为即使在长时间暴露于紫外线和/或热之后，它也能够发挥稳定和持久的抗氧化作用。
此外，它适用于在食品保鲜领域中使用，因为本发明的提取物中所含的超氧化物歧化酶即使在高浓度盐和/或甚至与中性相差很远的pH值(例如在3至10的pH值下)的存在下也保持稳定和活性，可显著抵消食品氧化过程和与之相关的产品的外观变化。
另一个优点是本发明的组合物中所含的提取物是从体外植物细胞培养物中获得的，因此不含任何细菌来源的致敏物质和/或刺激物以及有毒污染物(例如，杀虫剂和/或肥料)和环境病原体试剂(environmental pathogen agents)，因为植物细胞培养物在实验室的受控条件下生长。
在一个实施方案中，植物细胞培养物是属于番茄属(番茄)的细胞的培养物。
有利地，由于存在几种有益的次生代谢产物，来自该特定植物物种的细胞培养物的提取物特别有效地保护皮肤细胞免受重金属的毒性作用并诱导内源性胶原蛋白的产生(Tito等，2011)。此外，源自番茄细胞的提取物不含对细胞潜在地致敏或有毒的物质，例如茄碱和番茄碱生物碱，它们反而存在于番茄植物的叶子和果实中。
附图说明
图1A表示在未转化的番茄细胞(WT)和转化细胞系(1-5)中扩增的硫磺矿硫化叶菌的SOD基因(SsSOD)电泳后的凝胶图像；将基因表达相对于参考标准基因18S核糖体RNA归一化。M-g：含有已知分子量的DNA片段的基因标记。
图1B表示存在十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的图像，在其上对未转化的番茄细胞(WT)和转化的番茄细胞系(1-5)的提取物进行了蛋白质印迹(Western-Blot)分析。将约20μg的总蛋白在18％SDS-PAGE凝胶上分离，转移至膜上并与抗SOD一抗(1∶1000)孵育。M-p：蛋白标记(Precision Plus蛋白标准品，Bio-Rad)。
图2表示未转化细胞培养物(WT)和用编码SsSOD的基因转化的细胞系1的细胞培养物(SsSOD#1)的提取物在非变性条件下电泳后的聚丙烯酰胺凝胶(native-PAGE)的图像。凝胶的每个泳道分析了15μg的总蛋白，并对于SOD活性，通过染色揭示其活性。
图3A和3B分别示出了未转化的番茄细胞培养物(WT)的提取物和来自细胞系1(SsSOD#1)的番茄细胞提取物的抗氧化活性随温度(A)和pH(B)变化的图。WT提取物和SsSOD#1细胞系提取物的酶活性值已经相对于最高酶活性来表示，该最高酶活性对应于100％。
图4A表示在未转化的番茄细胞(WT)和转化的番茄细胞系(1-4)中对嗜热泉生古细菌SOD基因扩增(ApSOD)进行电泳后的凝胶图像；将基因表达相对于标准基因18S归一化。M-g：含有已知分子量的DNA片段的基因标记；C+：由含有ApSOD基因的质粒代表的阳性对照。
图4B表示十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的图像，在其上对未转化的番茄细胞(WT)和转化的番茄细胞系(1-4)的提取物进行了蛋白质印迹(Western-Blot)分析。将约20μg的总蛋白在18％SDS-PAGE上分离，转移至印迹并与抗SOD一抗(1∶1000)孵育。M-p：蛋白标记(Precision Plus蛋白标准品，Bio-Rad)；C+：从细菌中表达和纯化的SOD蛋白。
图5显示未转化的番茄细胞培养物(WT)和用编码ApSOD的基因转化的细胞系2的细胞培养物(ApSOD#2)的提取物在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)的图像。每个泳道分析了15μg的总蛋白，并通过染色来揭示SOD活性。
图6A和6B分别示出了未转化的番茄细胞培养物(WT)和细胞系2(ApSOD#2)的番茄细胞的提取物的抗氧化活性随温度(A)和NaCl浓度(B)变化的图。WT提取物和ApSOD#2的酶活性值已经相对于最高酶活性来表示，该最高酶活性对应于100％。
图7A表示在未转化的番茄细胞培养物(WT)的提取物中和转化的番茄细胞系(1-5)的提取物中扩增的耐辐射奇球菌的SOD基因(DrSOD)进行电泳后的凝胶图像。将基因表达相对于标准基因18S归一化。M-g：含有已知分子量的DNA片段的基因标记；C+：由含有DrSOD基因的质粒代表的阳性对照。
图7B表示十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的图像，在其上对未转化的番茄细胞(WT)和转化的细胞系(1-4)的提取物进行了蛋白质印迹(Western-Blot)分析。将约20μg的总蛋白在18％SDS-PAGE上分离，转移至印迹并与抗SOD一抗(1∶1000)孵育。M-p：蛋白标记(Precision Plus蛋白标准品，Bio-Rad)；C+：从细菌中表达和纯化的SOD蛋白。
图8表示未转化的番茄细胞培养物提取物(WT)和用编码DrSOD的基因转化的细胞系3的番茄细胞培养物提取物(DrSOD#3)在非变性条件下电泳后的聚丙烯酰胺凝胶(native-PAGE)的图像。每个泳道分析了15μg的总蛋白，并通过染色来揭示SOD活性。
图9A表示在非变性条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)的图像显示了暴露于UVB射线7小时对包含DrSOD的蛋白质提取物的影响。通过在用UV处理之前(t＝0)和在用UV处理7小时之后(t＝7小时)染色来揭示蛋白条带和SOD活性。
图9B显示与图9A中所示凝胶的SOD活性的条带强度的光密度分析相关的直方图(以相对于在t＝0时每个SOD活性条带的信号强度(设定为100％)的百分比值报告在t＝7h时的SOD活性条带的信号强度)。
图10举例说明了在人成纤维细胞(HDF)中p21基因表达水平的柱状图。用WT番茄细胞提取物和含有浓度为0.002％的极端微生物SOD的源自3种转基因细胞系(SsSOD#1，ApSOD#2，DrSOD#3)的提取物处理HDF细胞。使细胞经受H2O2过氧化氢(100μM)存在下的氧化应激2天后，测定p21基因的表达水平，并将其与仅用过氧化氢处理的HDF细胞的表达水平(设为100％)进行比较。星号表示相对于对照的显著性差异。
图11显示了根据“彗星”试验，由WT番茄细胞提取物和DrSOD转化细胞(DrSOD#3)的提取物处理的人角质形成细胞(HaCaT)暴露于过氧化氢引起的细胞核彗尾平均长度的条形图。WT细胞样品和转基因细胞系样品均用紫外线处理7小时，并比较了不同样品的核尾长度。作为阳性检测对照，使用了扁豆(Dolichos)细胞培养物的水溶性提取物，已被Arterra表征其具有防止H2O2损害的能力(Bimonte等人，2013)。
图12显示了在时间为0天和8天后用WT番茄细胞提取物(对照)和源自表达SsSOD(SsSOD#1)和ApSOD(ApSOD#2)的细胞的提取物处理的金枪鱼切片的照片。
图13显示：(A)在非变性条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)图像，其显示了在90℃的温度下的处理对来自未转化的番茄细胞(WT)的对照提取物的影响和对由来自包含SsSOD、ApSOD和DrSOD的番茄细胞的提取物组成的混合物(MIX)的影响。在90℃加热处理之前和之后，通过染色揭示凝胶上的条带和SOD活性；(B)与A中所示的凝胶的SOD活性条带的强度的光密度分析相关的直方图(以相对于未处理样品的每个SOD活性条带的信号强度(对应于100％)的百分比值报告热处理时SOD活性条带的信号强度)。
图14显示：(A)在非变性条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)图像，其显示了pH 1.0时的处理对来自未转化的番茄细胞(WT)的蛋白质提取物的影响和对由来自包含SsSOD、ApSOD和DrSOD的番茄细胞的提取物组成的混合物(MIX)的影响。通过染色揭示SOD活性条带；(B)与A中所示的凝胶的SOD活性条带的强度的光密度分析相关的直方图(以相对于pH 8时的每个SOD活性条带的信号强度(对应于100％)的百分比值报告pH 1时SOD活性条带的信号强度)。
图15显示：(A)在非变性条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)图像，其显示了暴露于UVB射线7小对来自未转化的番茄细胞(WT)的蛋白质提取物的影响和对由来自包含SsSOD、ApSOD和DrSOD的番茄细胞的提取物组成的混合物(MIX)的影响。通过染色揭示SOD活性条带；(B)与A中所示的凝胶的SOD活性条带的强度的光密度分析相关的直方图(以相对于在时间＝0时每个SOD活性条带的信号强度(对应于100％)的百分比值报告UVB处理7小时后SOD活性条带的信号强度)。
具体实施方式
本发明描述了一种包含植物细胞培养物提取物的组合物，该植物细胞培养物提取物包含极端微生物细菌的超氧化物歧化酶。极端微生物细菌在极端的物理和/或地球化学条件下增殖，这些条件对于地球上的大多数生物都是致命的。
极端细菌分为以下几类，包括：嗜热细菌，能够在高温环境下生存；嗜酸细菌，能够在酸性环境中生存；嗜盐细菌，能够在高盐浓度的环境中生存；嗜碱细菌，能够在碱性环境中生存；嗜冷细菌，能够在低温环境中生存。这些特殊细菌所定居的典型栖息地包括温泉、水下热液系统、盐湖和盐水、寒冷的海水、极地土壤和高山冰川，以及深水沉积物。
这些极端微生物包含酶，即所谓的“极端酶”，它们能够在上述极端环境条件下保持其结构和催化活性；在所述极端酶中，也有超氧化物歧化酶。
为了利用这类酶的稳定性特征，本申请人从三种不同的极端微生物中分离了超氧化物歧化酶(SOD)：硫磺矿硫化叶菌、嗜热泉生古细菌和耐辐射奇球菌。
硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)是一种嗜热嗜酸细菌，其生活在极端酸性(pH值为2至4)和高温(80℃)的条件下，例如间歇泉。
嗜热泉生古细菌(Aeropyrum pemix)是一种嗜热嗜盐细菌，从日本沿海的海洋沉积物中分离出来，其在70℃至100℃的温度和1.8％至7％(最佳3.5％)的盐度下生长。
耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)是世界上已知的最耐辐射的生物之一。它能够承受与任何其他生物的生命都不相容的很高剂量的辐射。此外，它能够在极端寒冷、脱水和酸性条件下生存，因此，它也被认为是一种多极端细菌。
为了研究它们的特性，首先已在细菌系统模型大肠杆菌(E.coli)中分离并表达了上述极端微生物的超氧化物歧化酶基因，然后在植物细胞培养物中表达，以产生含有超氧化物歧化酶极端酶的植物提取物。
特别地，细胞培养物代表了表达异源蛋白质的非常有利的选择。实际上，从植物细胞培养物中获得的提取物富含次生代谢产物，特别对于生产化妆品应用的活性成分尤为重要(Barbulova等，2014)。
在一个实施方案中，由于先前描述的有益特性，其中表达了极端微生物超氧化物歧化酶的植物培养物是番茄(solanum lycopersicum)。或者，可以使用源自其他植物物种的细胞(例如，烟草属、悬钩子属、咖啡属、葡萄属、百脉根属细胞)的培养物来生产极端微生物SOD：几种植物培养物已成功用于生产富含有益物质的提取物并已被证明对化妆品/皮肤病学应用有效(Apone等，2017)。
由于存在从上述微生物分离的超氧化物歧化酶，本发明的组合物显示出稳定的抗氧化活性。
实际上，即使在高温(最高90℃)、低pH(最高1.0)、高浓度盐(最高7％)和高剂量UVC辐射(λ＝254nm和E＝10J/cm2，最多暴露7小时)和UVB(λ＝300-315nm，E＝0.6mW/cm2，最多暴露7小时)下也显示出酶活性。
由于该特性，本发明的组合物适合用于工业应用，在该工业应用中，极端物理因素对包括酶在内的蛋白质的结构稳定性起决定性作用。实际上，蛋白质结构的维持是必不可少的，这样蛋白质(例如超氧化物歧化酶)才能够行使其生物学活性。
此外，这些从极端微生物中获得的酶表达并包含在番茄细胞培养物的提取物中，该提取物完全不含致敏或刺激性物质(例如植物叶片和果实中存在的生物碱)，因此无论在皮肤(和其他组织)上应用还是摄入，均不会对人体造成过敏性反应的任何潜在风险。
特别地，最令人感兴趣的应用领域是皮肤化妆品、保健品和食品保鲜领域。
在皮肤化妆品中，由于SOD的存在，本发明的组合物可在舒缓或皮肤保护产品中特别有用，该产品适合对比氧化剂。由于极端微生物SOD的热和紫外线稳定性，直接在防晒剂中使用该组合物可能引起更大的兴趣。实际上，即使在长时间暴露于阳光下，这也将保证抗氧化作用，而在这种情况下化妆品产品中常用的嗜温酶或抗氧化剂的稳定性可能会受到损害。在保健品领域，本发明的组合物特别令人感兴趣，因为它甚至在低pH值(1-3)下也能发挥其抗氧化作用，这是胃液的典型特征。实际上，食品中所含的多种氧化剂对胃和肠的组织具有炎症作用，通常会导致较严重的病理状况。此外，具有抗氧化作用的天然物质或酶被胃壁产生的酸水解或灭活。有利地，本发明组合物的极端微生物酶显示出对酸性pH和胃酶的蛋白水解作用的高抗性，这允许它们在人类或动物用保健品或食品补充剂中使用。
在罐头制造领域中，本发明组合物中所含的提取物由于存在硫磺矿硫化叶菌超氧化物歧化酶(SsSOD)或嗜热泉生古细菌超氧化物歧化酶(ApSOD)，即使在食品保存过程中很典型的高盐度和高温条件下也表现出稳定的抗氧化活性。用本发明的组合物处理的食品保持其感官特性不变，因为它们受到氧化现象的保护。
本发明的组合物还包括载体、溶剂、赋形剂和/或佐剂。此外，它可以是用于皮肤应用的凝胶、乳霜、洗剂的形式，或者是用于生物医学/保健品应用的丸剂、片剂、粉剂、溶液的形式，最后是可以用于食品领域应用、特别是用于食品保鲜的水溶液的形式。
借助于本发明的非限制性实施例，以下是涉及制备表达并含有从极端微生物中分离的超氧化物歧化酶的番茄属(番茄)植物细胞培养物提取物、及其旨在抑制氧化作用引起的损害的生物学特性的实施例。
实施例
实施例1
属于微生物硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶(SOD)在番茄细胞培养物中的表达以及源自细胞的提取物的表征。
为了在番茄细胞(MicroTom细胞系)中表达编码极端微生物硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶(SsSOD)(SEQ ID NO 1)的基因，将用上述基因改造的二元载体pBI121转移至根癌农杆菌(LBA4404 trunk)用于番茄子叶(S.lycopersicum)的基因转化。
然后将感染的植物组织转移到用于诱导愈伤组织的特定培养基上，所述培养基含有抗生素卡那霉素，用于选择转化细胞。从基因转化大约6周后，大量的愈伤组织得以再生，从剩余的植物组织中被分离出来，转移到新鲜培养基上，并通过半定量RT-PCR分析。图1A显示了涉及一些SsSOD表达细胞系的分析。通过对SsSOD序列使用特异性的寡核苷酸，将获得的扩增产物相对于在相同反应(多重PCR)中获得的扩增的18S核糖体RNA归一化。所有分析的克隆(1-5)均显示出高水平的SOD表达，而正如预期的那样，在用作对照的未转化番茄细胞(WT)中未发现扩增条带。通过蛋白印迹(WB)用特异性抗SOD抗体分析细胞系中蛋白质的存在。蛋白印迹的结果报告在图1B中：在分析的细胞系中，突出显示了预期分子量(24kDa)的SsSOD蛋白的存在，特别是在细胞系1中，而对照细胞(WT)中不存在该蛋白。
使细胞系1细胞在液体培养物中生长，收集并处理以获得含有SsSOD的提取物。提取物以抗氧化活性为特征，这主要归因于重组酶的存在。在非变性条件(Native-PAGE)和随后的活性染色下对野生型细胞(WT，未表达SsSOD)和表达SsSOD的细胞系1(SsSOD#1)的提取物进行电泳分析(图2)。对非变性凝胶的分析表明，WT样品中还存在一个对应于内源性SOD的条带，其分子量类似于SsSOD；但是它的强度远低于SsSOD#1样品中的强度，表明后者中的抗氧化活性要强得多。
通过优化酶活性剂量的测定条件，对细胞系1的提取物中存在的重组SsSOD进行了表征，通过改变pH和温度值确定了活性方面的主要功能参数。如图3所示，可以确定提取物活性的最佳条件，其显示为pH值等于5且温度为70℃(用分光光度法活性测定而测量的值)。此外，在温度为57℃至90℃和pH为1至8的情况下，含SsSOD的提取物的酶活性均显著高于WT提取物，表明SsSOD保证了番茄细胞的提取物在极端温度和pH条件下保持抗氧化活性，而野生型提取物则不显示。
方法
a)硫磺矿硫化叶菌超氧化物歧化酶基因的克隆。
-基因组DNA纯化。
为了从古细菌硫磺矿硫化叶菌中分离DNA，使用了专用协议的改编本(Sulfolobusprotocols，Stedman Lab，http：//web.pdx.edu)，概述如下：
a)将从1ml生长稳定期的培养物中获得的沉淀置于2ml管中，并重悬于250μL TEN(10mM Tris/HCl pH 8.0，1mM EDTA，150mM NaCl)中；
b)加入250ml TENST(加入0.12％Triton X-100和1.6％肌氨酸的TEN)，并通过颠倒管重复混合；
c)在室温下孵育30分钟后，加入500μl三元酚/氯仿/异戊醇混合物(25∶24∶1)，并以最大强度(40赫兹)将混合物涡旋2分钟；
d)分离较重的有机相(底层)、固相(中间层)和水相(上清液)，并向后者中加入50μl 3M乙酸钠和1ml乙醇；
e)在冰上孵育15分钟后，将管离心(转速14000rpm)15分钟，得到由基因组DNA和RNA组成的沉淀；然后，除去上清液，并用500μl 70％的乙醇洗涤沉淀物；
f)将沉淀物风干15分钟，然后溶于含有核糖核酸酶A(RNAsi A)酶的15μl TE缓冲液中；在37℃孵育30分钟后，通过在1％琼脂糖上的电泳检查DNA制备物，并通过荧光计测量浓度。获得了约5μg的微生物基因组DNA。
-引物设计。
硫磺矿硫化叶菌的基因组，以及嗜热泉生古细菌和耐辐射奇球菌的基因组已完全测序，并可以从数据库中获得，因此可以容易地设计用于所选基因的PCR扩增的引物。
引物必须允许整个编码区的扩增；因此，“正向”引物必须从起始翻译的ATG密码子开始，而“反向”引物必须从相同编码序列的终止密码子开始。此外，为了使扩增条件足够严格，已设计出退火假定温度为52℃-60℃的引物。
以下是用于扩增硫磺矿硫化叶菌超氧化物歧化酶的引物：
引物 序列 退火温度(℃) 基因
正向 SEQ ID NO 4 54.9 sod(基因座SSO_0316)
反向 SEQ ID NO 5 52.6 Sod(基因座SSO_0316)
-扩增反应。
使用高保真度Pfu DNA聚合酶“Phusion Green Hot Start II High-Fidelity”(Thermo Fisher Scientific)，序列SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的引物和微生物DNA为模板进行PCR反应，以扩增超氧化物歧化酶基因。
使用推荐的“富含GC”底物的条件，制备20μl反应混合物，所述反应混合物包含：25-50ng DNA，每种dNTP 200μM，每种引物0.5μM，3％DMSO和0.4个单位的DNA聚合酶，进行以下扩增程序：在98℃、30秒的初始变性循环，由98℃、10秒的变性阶段，54℃至60℃、30秒的“退火”阶段，72℃、45秒的延伸阶段组成的随后的30个循环，和72℃、7分钟的最后延伸循环。
-扩增的DNA的纯化和测序。
使用“Zymoclean Gel DNA Recovery”产品(Zymo Research)的体系和程序纯化扩增的DNA，其允许通过亲和色谱柱从含有目的扩增子的琼脂糖凝胶片段开始分离DNA。
这些DNA的等分试样用于序列分析，获得专业实验室的服务，该实验室确认了与目的基因的一致性。
-在质粒载体中克隆基因并转化农杆菌。
通过“StrataClone Ultra Blunt PCR Cloning Kit”试剂盒将纯化的DNA克隆到质粒载体中以保存和增殖，该试剂盒是利用Pfu DNA聚合酶扩增的DNA的专用试剂盒，利用DNA拓扑异构酶I特性的技术保证了高产量。
然后，通过限制性内切酶分析验证含有SOD基因的质粒。
克隆的基因通过“SureVector Cloning System”(Agilent)转移到植物表达载体中，该系统基于在单个反应中构建体的组装，该反应包含目的基因和对应于载体各种元件(启动子、选择标记、复制起点、可能的N-和/或C-标记)的合成模块，通过识别每个片段的末端区域来将它们组合成正确的序列。
通过用嵌合引物扩增来制备用于组装反应的目的基因，所述嵌合引物包含在最终构建体中正确放置所必需的末端部分。按照此程序，制备了表达载体Sure-SsSOD，其中包含T7启动子、氨苄青霉素抗性基因以及具有大量pUC拷贝的复制起点。通过基因转化将该载体插入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
对于农杆菌(LBA4404 trunk)的转化，农杆菌用CaCl2处理为感受态，使用了冻融技术。向感受态细胞的等分试样中(约100μl)加入1μg载体Sure SsSOD的DNA；首先将细胞在冰中放置5分钟，然后在-130℃的温度放置5分钟，最后在37℃放置10分钟。将800μl液体YEP(酵母粉10g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，pH 7.2)加入细胞中，并在28℃下孵育4小时。然后将培养物铺板在固体YEP上，其中固体YEP补充了抗生素壮观霉素(100mg/l)用于重组农杆菌细胞的选择。
b)用SOD基因转化番茄子叶和愈伤组织诱导。
将10-12天的番茄子叶(MicroTom品种)在70％乙醇(1分钟)、1％次氯酸钠(15分钟)中灭菌，然后在无菌蒸馏水中冲洗3次后，使其在培养基MS30(Murashige and SkoogBasal Medium，4.4g/L，蔗糖30g/L，pH7.2)上生长。细菌根癌农杆菌(LBA4404 trunk)在28℃下于10ml液体YEP中生长18小时，然后在室温下以4000rpm离心5分钟，然后将沉淀物重悬于10ml AM1培养基中，该AM1培养基基于包含以下成分的B5 Gamborg培养基(微量和大量元素包括维生素，Duchefa，Netherlands)：肌醇500mg/L，水解酪蛋白500mg/L，蔗糖30mg/L，2,4D 1mg/L，激动素0.1mg/L，NAA(萘乙酸)0.01mg/L，腺嘌呤1mg/L，pH 5.7。
将子叶与农杆菌在皮氏培养皿中共培养15分钟，并加入乙酰丁香酮(370μM)。将外植体转移至固体AM1培养基中，并置于生长室(24℃，16小时光照和8小时黑暗的光周期)中放置两天。然后，将它们转移到添加了抗生素头孢噻肟(500mg/l)的液体AM1中30分钟以从外植体中除去农杆菌。外植体进一步用单独的培养基AM1洗涤，然后转移到包含AM1的培养皿中，AM1具有250mg/l头孢噻肟和卡那霉素(50mg/l)以诱导和选择转化的细胞。转化大约4周后，外植体周围出现了第一愈伤组织；当达到0.5cm的大小时，从叶组织上切下愈伤组织，并转移至含有头孢噻肟和卡那霉素抗生素的新鲜AM1中。
c)表征转化的番茄细胞系。
通过半定量RT-PCR分析转化的番茄愈伤组织，以评估转基因的表达水平。
为此目的，将0.5ml细胞离心以除去培养基，并使用提取试剂盒“RNeasy PlantMini Kit”(Qiagen)将细胞沉淀用于提取总RNA。将RNA样品用DNasi I(Ambion)处理以消除污染的基因组DNA。在“上样染料”(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖水溶液)存在下，将2μl的每个样品上样到1％琼脂糖凝胶上，并使用RNA的特定定量标记(RiborulerRNA ladder，Fermentas)作为参考进行定量。使用基因工具软件(Perkin Elmer)进行定量。使用逆转录酶(Thermo-Scientific)逆转录300ng总RNA。
使用以3：7比率的引物对“通用18S引物/竞争物”(Ambion)作为内标进行半定量RT-PCR反应。
用0.4μM正向引物(Fw)，0.4μM反向引物(Rev)和1.25单位的Wonder Taq聚合酶在25μl的体积中进行扩增反应。所用的扩增循环包括在95℃下初始变性1分钟的，然后是包括以下的35个循环：在95℃下变性15秒，在50℃下退火15秒和在72℃下延伸30秒。
将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，通过Geliance工具(Perkin Elmer)观察并通过Genetools软件进行光密度分析。图10的图表中所示的值表示与所分析基因相关的条带强度和与标准参照物(18S核糖体RNA)相关的条带强度之间的比率。
扩增特异的引物序列是SEQ ID No 10(Fw引物)和SEQ ID No 11(Rv引物)。
为了验证重组蛋白的存在，从野生型和转基因细胞收集细胞并用加入了植物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的300μl缓冲液提取总蛋白，缓冲液包含Tris-HCl 0.125M pH 6和4％SDS。在缓冲液中对愈伤组织进行机械研磨后，将细胞在4℃下以14000rpm离心10分钟。然后将上清液转移至新试管(Eppendorf)中，用Bradford试剂对提取的蛋白质进行分光光度计定量。
在18％SDS-PAGE上分离20μg的蛋白质，并用特异性抗SOD抗体在PVDF膜(Millipore)上进行蛋白印迹分析，该抗体在含5％Blotting-Grade Blocker(Bio-Rad)的1×TBS中按1：1000稀释。与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(抗兔)按1：5000的稀释使用，并使用“PierceTM1-Step Ultra TMB blotting-solution”试剂(Bio-Rad)使印迹显影。作为与抗体杂交的阳性对照，使用了表达耐辐射奇球菌SOD的大肠杆菌提取物(在蛋白印迹分析中表示为C+)。
d)液体培养物的制备、生长和收集
愈伤组织在固体培养基(重约50mg)中生长达到约2cm后，取按外源SOD表达水平选择的愈伤组织，并将其放入装有150ml含抗生素的液体AM1培养基的烧瓶中。
将烧瓶置于温度为24℃至26℃的生长室中的120rpm的轨道摇床上。约4周后，达到所需密度，即约300g/L，从而可以收集细胞用于后续处理。通过具有受控孔隙率的过滤器进行细胞收集，以除去培养基。随后细胞在无菌蒸馏水中洗涤并冷冻于-80℃。通过以下步骤制备番茄细胞的提取物。
将番茄细胞(100g)以4：1体积/重量比(每100g新鲜细胞约400ml缓冲液)悬浮于冷盐水缓冲液PBS 1×(NaCl 136mM，KC1 2.7mM，NaH2PO412mM，KH2PO4 1.76mM，pH 7.4)中，并在机械搅拌器中均质化15分钟。术语“均质化”是指对植物材料进行研磨的处理，该处理在合适的容器中进行，例如预先冷却的陶瓷研钵和陶瓷杵，或者对于较大体积，可以使用较大容器，甚至金属，其中可以使用搅拌机或实验室或工业压机(press)用金属刀片将材料均质化。
获得均匀的裂解物后，将悬浮液在4℃下以4000g离心约15分钟，然后过滤以除去其他残留物并回收上清液(约700mL)。
通过冷冻干燥方法干燥上清液，直到溶剂被完全除去，得到约3克粉末。作为冷冻干燥的替代方案，可以使用干燥室或喷雾干燥器。
e)番茄细胞提取物中SOD酶活性的分析。
对于植物提取物中SOD酶活性的剂量，进行了分光光度测定和在非变性条件下的丙烯酰胺凝胶(Native-PAGE)测定，然后进行活性染色。
-分光光度法测试
测试了表达SOD的提取物的抗氧化活性，即抑制无色硝基蓝四唑(NBT)光化学还原为紫色甲瓒的能力。
将含有从未转化的番茄细胞(WT)或由编码各种极端微生物SOD的基因转化的番茄细胞获得的2μg植物提取物的反应混合物(最终体积为260μl)用H2O2(20μM)在37℃下预孵育20分钟，H2O2在Tris-HCl 50mM pH 8.0中用作Cu/Zn-和Fe-SOD亚型的抑制剂。预孵育后，将以下物质添加到反应混合物中：EDTA(0.1M)和NBT(1.5mM)，最终体积为1ml。将含有该溶液的比色皿暴露于光下8分钟，然后加入核黄素(0.12mM)，再将混合物暴露于光下12分钟，以使光化学反应得以进行。样品的颜色变为紫色表示NBT氧化为甲瓒的明显迹象。通过测量其抑制光化学还原的能力来确定含有极端微生物超氧化物歧化酶的提取物的活性。用分光光度法在560nm处测量反应中产生的紫色。特别是，提取物中所含的SOD减少了超氧阴离子的数量，从而抑制NBT的还原并确定560nm处的吸光度降低。在反应的第一分钟，NBT的还原速率是线性的。活性剂量在不同的酶样品上进行三次重复。
以牛血清白蛋白(BSA)为标准，根据Bradford法(Noble，2014)测定植物提取物中的蛋白质含量。
使用分光光度法在不同温度、pH和盐浓度下对转化和未转化的植物蛋白提取物进行生化表征。
用H2O2处理后，将反应混合物(最终体积260μL)在不同温度条件(70℃、80℃和90℃)、pH(pH＝3.0、50mM甘氨酸-HCl；pH＝5.0、50mM乙酸钠；pH＝8.0、50mM Tris-HCl)或盐浓度(0.5M、1M、1.5M NaCl)下预孵育15分钟。在不同pH和盐浓度条件下用于实验的预孵育温度为37℃。预孵育后，按如上所述进行NBT/核黄素测定。
-在非变性条件下在丙烯酰胺凝胶(Native-PAGE)上进行SOD活性测试。
在非变性条件下(不存在SDS、β-巯基乙醇和煮沸)进行电泳后，通过特异性染色在10％聚丙烯酰胺凝胶上测定SOD的抗氧化活性。在这些条件下，蛋白质保留其天然结构，酶保留其活性。
电泳结束时，将凝胶浸入含有硝基蓝四唑(NBT，306μM)和核黄素(265μM)的溶液中，并在室温下于黑暗中孵育15分钟(Beauchamp和Fridovich，1971)。然后通过添加0.1％TEMED来终止反应并在黑暗中将凝胶再孵育15分钟。通过凝胶上亮条带的出现来揭示SOD活性，这是由于酶使O2阴离子发生歧化而导致NBT缺失还原所致。通过Bradford方法估算，将相同量的总蛋白上样到每个泳道上(在附图的说明中表明)。
为了研究番茄细胞提取物对UVB射线的抗性，将含有在Tris-HCl 50mM pH 8.0中的10μg植物蛋白提取物的反应混合物(最终体积为50μl)暴露于UVB射线(300-315nm)下，距离光源约4厘米，并在冰中辐射长达7个小时以避免样品在辐射期间蒸发。在暴露结束时，将反应混合物上样到凝胶上并如上所述进行分析。
实施例2
属于微生物嗜热泉生古细菌的SOD在植物细胞培养物中的表达和源自细胞的提取物的表征。
如实施例1中所述，使用土壤农杆菌(Agrobacterium tumefanciens)，用嗜热泉生古细菌SOD(ApSOD)(SEQ ID NO 2)对番茄进行基因转化。使用ApSOD的特异性引物通过RT-PCR分析了四个转化细胞系，并将扩增产物与在相同反应(多重PCR)中获得的扩增的18S核糖体RNA进行了比较(图4A)。所有分析的克隆均显示出高水平的SOD表达，正如预期的那样，在用作对照的未加工的番茄细胞(野生型，WT)中未发现扩增条带。
蛋白印迹分析表明转基因细胞系包含可检测量的ApSOD蛋白，而在未转化细胞系中，由于内源番茄SOD与极端微生物SOD之间的高度相似性，轻微的杂交条带勉强可见(图4B)。
从表达ApSOD的细胞系2生产水溶性提取物，并将其用于表征极端微生物SOD的抗氧化和生化活性。在非变性条件下的电泳分析(native-PAGE)和随后的活性染色显示，与WT样品相比，存在于细胞系2中的重组SOD具有很强的活性(图5)。随后，改变温度和盐度条件，对含ApSOD的番茄细胞提取物的酶活性进行了研究(分光光度分析)。
图6A和图6B所示的结果表明，最佳的酶活性条件出现在80℃的温度和1M的盐浓度处，这些因素表明了重组酶的超嗜热性和嗜盐性；在相同条件下，WT提取物显示出非常低的酶活性。
方法
a)嗜热泉生古细菌超氧化物歧化酶基因的克隆。
-纯化基因组DNA
如实施例1中所述进行嗜热泉生古细菌基因组DNA的纯化。
-引物设计
用于扩增嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶的引物如下：
引物 序列 退火温度(℃) 基因
正向 SEQ ID No 6 56.3 sod(基因座APE_0741)
反向 SEQ ID No 7 57.1 sod(基因座APE_0741)
-扩增反应
根据实施例1的方法，使用序列SEQ ID No 6和SEQ ID No 7的引物进行扩增反应。
-纯化扩增的DNA，在质粒载体中对基因测序和克隆，并转化农杆菌。
根据实施例1的方法进行扩增的DNA的纯化及其在用于根癌农杆菌转化的质粒载体中的克隆。
b)用SOD基因转化番茄子叶和愈伤组织诱导。
根据实施例1的方法进行番茄子叶的转化。
c)加工的番茄细胞系的表征。
使用具有序列SEQ ID No 12(正向引物)和SEQ ID No 13(反向引物)的引物，根据实施例1的方法进行转化细胞系的表征。
d)液体培养物的制备、生长和收集
按照实施例1的方法进行液体培养物的制备、生长和收集。
e)番茄细胞提取物中SOD酶活性的分析。
按照实施例1的方法进行番茄细胞培养物提取物的超氧化物歧化酶酶活性的分析。
实施例3
属于耐辐射奇球菌微生物的SOD在植物细胞培养物中的表达以及源自细胞的提取物的表征。
通过根癌农杆菌将耐辐射奇球菌SOD(DrSOD)(SEQ ID NO 3)稳定地转移至番茄。
使用SOD转移序列的特异性引物，通过RT-PCR分析在选择性培养基上选择的愈伤组织。图7A显示了5个转基因细胞系的RT-PCR。将使用针对DrSOD序列的特定寡核苷酸获得的扩增产物相对于在相同反应(多重PCR)中获得的扩增的18S核糖体RNA进行归一化。所有分析的克隆都显示高水平的SOD表达。然后在蛋白印迹中分析细胞系，如图7B所示，转基因番茄细胞系以高水平表达DrSOD，而在WT细胞提取物中存在对应于内源SOD的轻微条带。
含有DrSOD的细胞系3提取物用于表征极端微生物SOD的抗氧化和生化活性。样品活性染色后的Native-PAGE分析证实，与WT相比，细胞系3的提取物具有最高的抗氧化活性(图8)。从该图还可以明显看出，DrSOD#3细胞系中存在的SOD比WT细胞系中存在的内源性SOD在凝胶上迁移更快，此外，它以双条带的形式出现，可能是因为重组蛋白的一部分为糖基化形式，因此分子量与未修饰的蛋白不同。
通过确定抗UVB辐射方面的主要的生化参数，对含有重组DrSOD的细胞系3细胞提取物的抗氧化活性进行了研究。图9(A和B)显示的结果表明，与WT(仅保留20％的活性)相比，含有DrSOD的提取物在暴露7小时后(保留90％的活性)表现出对UVB射线的出色抗性，即表示本发明重组酶的极端微生物性质的性能。
方法
a)耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶基因的克隆
-纯化基因组DNA
按照“
Figure BDA0002958240090000211
Genomic DNA Mini Kit”(Invitrogen)的体系和方法进行耐辐射奇球菌基因组DNA的纯化，该方法涉及使用包含通过亲和力保留DNA的疏水性树脂的色谱柱。从过夜生长获得的约5×108个细胞开始，获得了量等于1μg的基因组DNA。
-引物设计
以下是用于扩增耐辐射奇球菌超氧化物歧化酶的引物：
引物 序列 退火温度(℃) 基因
正向 SEQ ID No 8 58.1 sod(基因座DR_1279)
反向 SEQ ID No 9 59.7 sod(基因座DR_1279)
-扩增反应。
根据实施例1的方法，使用序列SEQ ID No 8和SEQ ID No 9的引物进行扩增反应。
-纯化扩增的DNA、在质粒载体中进行基因测序和克隆以及转化农杆菌。
根据实施例1的方法进行扩增的DNA的纯化及其在用于根癌农杆菌转化的质粒载体中的克隆。
b)用SOD基因转化番茄子叶并诱导愈伤组织。
根据实施例1的方法进行番茄子叶的转化。
c)转化的番茄细胞系的表征。
使用具有序列SEQ ID No 14(正向引物)和SEQ ID No 15(反向引物)的引物，根据实施例1的方法进行转化细胞系的表征。
d)液体培养物的制备、生长和收集
根据实施例1的方法进行液体培养物的制备、生长和收集。
e)番茄细胞提取物中SOD酶活性的分析。
按照实施例1的方法进行番茄细胞培养物提取物的超氧化物歧化酶酶活性的分析。
实施例4
包含极端微生物细菌SOD的植物提取物对人成纤维细胞的抗氧化活性的分析。
测试了含有极端微生物SOD的番茄提取物保护人体细胞免受氧化应激的不利影响的能力，氧化应激是细胞衰老的主要原因之一。
为此目的，使人成纤维细胞经受H2O2存在下的氧化应激两天，并用WT番茄细胞提取物和转基因提取物SsSOD#1、ApSOD#2、DrSOD#3处理。通过RT-PCR分析衰老标记p21基因的表达水平。
将特异性PCR产物相对于内标(18S核糖体RNA)归一化，并将三个独立实验获得的平均值转换为百分比，将H2O2处理的值指定为100％(图10)。
p21的表达分析表明，用表达SOD的提取物处理的细胞比仅用H2O2或加入WT细胞提取物的细胞更少衰老；实际上，在分别用表达SsSOD、ApSOD和DrSOD的提取物处理的细胞中，p21的表达显著降低了31％、36％和15％。
因此，用含有极端微生物SOD的提取物处理细胞显著降低了由H2O2引起的应激，从而确定了细胞衰老的减慢。因此，这些结果表明，含有极端微生物SOD的提取物，特别是含有SsSOD和ApSOD的提取物，由于其更高的稳定性特征，可潜在地用于与人类福祉有关的应用(保健品和生物医学领域)，以对抗氧化应激对细胞的损害。
方法
对人类成纤维细胞的分子和细胞检测。
对于人成纤维细胞(HDF)的诱导衰老和表达分析，将细胞以8×104的密度接种在6孔板中，用WT和转基因番茄细胞培养物提取物(浓度为0.02％)处理，经受使用H2O2(100μM)的应激两天，每天两次，每次1小时。
使用“GenEluteTM Mannalian Total RNA Miniprep kit”(SIGMA)从细胞中提取RNA，并按照实施例1中所述进行处理。
扩增反应(PCR)在由以下成分组成的25μl体积中进行，：包含1mM dNTP(脱氧核苷三磷酸)的1דWonder Taq反应缓冲液”、0.4μM正向引物(正向，Fw)，0.4μM反向引物(反向，Rev)、1.25个单位的酶“Wonder Taq”。扩增循环由以下组成：95℃、1分钟的初始变性，随后35个95℃、15秒的变性循环，53℃、15秒的退火和72℃、30秒的延伸。
对Cdkn1A基因(p21)扩增具有特异性的引物序列如下所示：
CdknlA正向引物(Fw)：SEQ ID No 16
CdknlA反向引物(Rv)：SEQ ID No 17
如上所述对获得的PCR产物进行分析。将三个独立实验获得的平均值转换为百分比，将H2O2处理的值指定为100％。
实施例5
表达DrSOD的番茄细胞提取物对人表皮角质形成细胞中核DNA的保护作用的研究。
由于氧化应激，UV辐射是造成皮肤细胞大部分损伤的因素之一。
对于本发明组合物的化妆品/皮肤病学应用，在UV射线和热的极端条件下测量了含有DrSOD的提取物的抗氧化活性。
尤其是，即使在长时间暴露于UV后，用含有DrSOD的番茄细胞培养物提取物进行的处理是否仍保留了其对核DNA的保护作用，以防止人角质形成细胞中H2O2引起的损害，已经被证实。这通过彗星试验进行评估(它专门用于通过在光学显微镜下直接观察细胞来测量基因组DNA片段化水平)。
为了获得有关该提取物的保护活性的定量数据，测量了细胞核的50个“尾巴”(彗尾)的长度，DNA片段化指数，并计算了平均值。如图11的图表所示，仅用H2O2处理的细胞核的“尾巴”的平均长度大于未处理的对照细胞。用WT提取物处理的细胞显示出减少的核碎片，表明WT细胞的提取物已经对角质形成细胞发挥了部分保护作用(尾巴减少约23％)；但是将相同的提取物用UV预处理7小时后该效果消失。
相比之下，源自细胞系3的转基因DrSOD提取物不仅对经受H2O2应激的细胞具有更大的保护作用(彗星尾巴减少了约37％)，而且在用UV处理提取物7小时后，它们保持活性，确保了核降解的显著降低(彗尾减少了28.5％)。因此，这些结果表明，含有DrSOD的提取物由于其对紫外线具有高抗性的特性，可潜在地用于防晒产品中用于对抗氧化应激的皮肤治疗。
方法
人类角质形成细胞的“彗星”试验
使每孔1.5×105HaCaT细胞在6孔板中在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Lonza)中生长24小时。首先用表达极端微生物SOD的番茄提取物和对照提取物过夜处理角质形成细胞，然后使它们经受300μM的H2O2应激3小时。
然后，使用1ml/孔的“非酶细胞解离溶液”(Sigma)从板中去除细胞，并将其转移到1.5ml管(Eppendorf)中，以1500rpm离心5分钟。
根据回收的细胞数量，将细胞在PBS 1×中洗涤并重悬于约10-20μl PBS中。向该细胞中加入80μl含0.5％“低熔点琼脂糖”(LPMA)的PBS，在37℃下平衡。将分散的细胞置于预先覆盖有一薄层“普通熔融琼脂糖”(NMA)的载玻片上。将盖玻片置于一滴细胞上，然后将载玻片置于4℃的冰箱中，直到具有细胞的琼脂糖层完全凝固(10-15分钟)。从琼脂糖上移除盖玻片，并将载玻片置于冷裂解溶液(2.5M NaCl，100mM EDTA，10mM Trizma Base pH8.5、1％TritonX-100)中，并在4℃放置约2小时。
从溶液中移出载玻片后，将其浸入含有电泳缓冲液(300mM NaOH，1mM EDTA，pH>13)的电泳室中。10分钟后，将载玻片用24V的电进行电泳。分离约20分钟后，将载玻片转移至中和缓冲液(0.4M Tris-HCl，pH 7.5)中至少10分钟。干燥载玻片后，为了突出细胞核荧光，琼脂中的细胞用10μg/ml溴化乙锭溶液处理。然后，用盖玻片覆盖细胞以在荧光显微镜下观察。
实施例6
含SsSOD和ApSOD的番茄细胞培养物提取物对金枪鱼切片的抗氧化活性的分析。
由于它们具有较高的耐高温和高盐浓度特性，将含有SsSOD和ApSOD的番茄细胞培养物提取物用于对金枪鱼切片的实验，以评估其作为食品中天然抗氧化添加剂的潜在用途，特别是对于那些易腐烂的食品。
将含ApSOD的番茄细胞提取物和含SsSOD的番茄细胞提取物的水溶液(每升蒸馏水的干提取物浓度均为100mg)注入金枪鱼切片，而对照样品则用野生型番茄细胞培养物提取物处理。随后，将切片暴露于空气和光照下8天。
对样品进行比色测量，根据CieLab方法以亮度(L)，红色指数(a*)和黄色指数(b*)表示，这被认为是在鱼产品中对评估质量和新鲜度有用的参数。如图12中报告的照片所示，与用源自WT细胞系的提取物处理过的金枪鱼切片相比，用来自细胞系SsSOD#1和ApSOD#2的提取物处理过的切片甚至在8天后仍保留其颜色和亮度。亮度和比色参数几乎保持不变，而在对照切片中，这两个参数均显著降低。
此外，还测定了金枪鱼切片的组胺水平。所获得的数据表明，用富含极端微生物SOD的提取物处理的金枪鱼切片的组胺含量与初始时间(时间0)相比没有增加。这些结果表明，包含SsSOD和ApSOD的提取物可用于罐头制造工业，因为它们特别适合于防止新鲜食品中的氧化引起的损害而不会引起感官特性的改变。
实施例7
含有极端微生物超氧化物歧化酶的番茄细胞培养物提取物的混合物的表征。
将根据实施例1、2和3中所述的实施例获得的提取物以1：1：1的比例混合。在不同的温度条件、暴露于UVB射线和酸度下对混合物进行抗氧化活性测定。
图13表明，即使在暴露于90℃温度的加热后，提取物的混合物(MIX)仍保持其酶活性而没有显著降低；相反，WT提取物的抗氧化活性降低了60％。该结果尤其归因于超嗜热的ApSOD和SsSOD的作用，如图3和6所示。
同样，酸性pH(pH 1.0)对MIX的影响并未决定活性的任何变化，这与对WT所观察到的相反，在WT中在该pH值下活性被完全消除(图14)。这种性能主要归因于MIX中SsSOD的存在，它在pH 1.0时具有极高的活性，如图3所示。最后，图15所示的结果涉及用UVB射线处理MIX和WT 7小时：与WT不同，MIX由于存在DrSOD酶对UVB射线的照射具有很高的抗性，它在这些条件下是有活性且稳定的，如图9所示。
方法
含有极端微生物超氧化物歧化酶的番茄细胞培养提取物的混合物(MIX)的酶活性 分析。
在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，通过与NBT/核黄素溶液孵育确定细胞培养物提取物的混合物(MIX)的抗氧化活性。
将从未转化的番茄细胞(WT)获得的提取物的总蛋白12μg和包含分别从含SsSOD(4μg)、ApSOD(4μg)和DrSOD(4μg)的番茄培养物中获得的三种提取物混合物(MIX)12μg进行以下处理：i)在90℃下预孵育15分钟；ii)在甘氨酸-HCl pH 1.0缓冲液中预孵育15分钟；iii)暴露于UVB射线7小时。在每次处理结束时，使样品在非变性条件下进行电泳，然后用NBT/核黄素方法进行SOD活性染色(如实施例1中所述)。
文献目录
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序列表
<110> 阿特拉生物科技股份公司
<120> 包含极端微生物的SOD酶的植物细胞提取物的工业应用
<130> ATR003BWO
<150> IT102018000008320
<151> 2018-09-03
<160> 17
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 636
<212> DNA
<213> Sulfolobus solfataricus P2
<220>
<223> 基因SOD基因座 SSO_0316
<400> 1
atgactctcc aaattcagtt taaaaagtac gagctacctc cattacccta caagatagat 60
gcattagaac cgtatataag taaagatata attgatgtac attataacgg acatcataaa 120
ggctatgtaa atggagcaaa ttcactccta gaaagactag aaaaagtagt aaaaggagat 180
ttacaaacag ggcaatatga tattcaaggt attatacgtg gtcttacgtt taacattaat 240
ggacacaagt tacacgcctt gtattgggaa aatatggcac caagtggaaa aggtggtgga 300
aaacctggtg gtgcactagc agacttaata aacaagcaat atggtagttt tgataggttt 360
aagcaagtat ttactgaaac tgctaattca ctacccggga ctggttgggc tgttctctat 420
tacgatactg agtctggcaa tttgcaaatt atgacgttcg aaaatcactt ccaaaatcat 480
atagcggaaa taccaataat attaatacta gatgagttcg agcatgcgta ctatcttcag 540
tataagaaca agagagctga ttacgttaat gcttggtgga atgtagtaaa ttgggatgca 600
gcggaaaaga agttacagaa atatttaacg aagtaa 636
<210> 2
<211> 645
<212> DNA
<213> Aeropyrum pernix K1
<220>
<223> 基因 SOD基因座APE_0741
<400> 2
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ccctacatta tagaggagat aatgaagctg caccaccaga agcatcacaa cacgtatgtc 120
aaaggggcta acgccgcact cgagaagata gagaagcatc tcaagggcga gatacagata 180
gacgttaggg ctgtcatgag ggacttcagc ttcaactacg caggccacat aatgcacacc 240
atattctggc ccaacatggc cccgcccggc aagggcggtg gaacacctgg cggcagggtg 300
gctgacctca tagagaagca gttcggcggc ttcgagaagt tcaaggccct cttcagcgcc 360
gctgcgaaga cggtggaggg cgtcgggtgg ggcgtgctcg cgttcgaccc tctgacagag 420
gagctcagga tactgcaggt ggagaagcac aacgtcctca tgacggcggg ccttgtgccc 480
atactagtta ttgacgtgtg ggagcacgcc tactacctcc agtacaagaa cgacaggggc 540
agctacgtcg agaactggtg gaacgtggtc aactgggacg acgttgagaa gaggctggag 600
caggctctaa acaacgcgaa gcccctctac ctgctccccc agtag 645
<210> 3
<211> 636
<212> DNA
<213> Deinococcus radiodurans R1
<220>
<223> 基因SOD基因座DR_1279
<400> 3
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aaggcgctcg aaggcaccga attcgccgac ctgcccgtcg aacaactcat tcagcagctc 180
gaccgcgtgc ccgccgacaa gaagggcgcc ctgcgcaaca atgcgggcgg ccacgccaac 240
cacagcatgt tctggcagat catgggccag ggtcagggcc agaacggcgc caaccagccc 300
agcggcgaac tgctggacgc catcaacagc gccttcggca gcttcgacgc cttcaagcag 360
aagttcgaag acgccgccaa gacccgcttc ggctcgggct gggcgtggct ggtcgtcaag 420
gacggcaagc tcgatgtcgt gtccaccgcc aaccaggaca acccgctgat gggcgaagcc 480
atcgcgggcg tcagcggcac cccgattctg ggtgtggacg tgtgggaaca cgcctactac 540
ctcaactacc agaaccgccg ccccgactac ctcgccgcct tctggaacgt ggtgaactgg 600
gacgaagtct cgaagcgcta cgccgccgcg aagtaa 636
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<213> Unknown
<220>
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<400> 4
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<213> Unknown
<220>
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<400> 5
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<213> Unknown
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<213> Unknown
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<400> 7
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<213> Unknown
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<400> 8
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<213> Unknown
<220>
<223> 反向引物DrSOD
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<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 正向引物SsSOD
<400> 10
gagctacctc cattacccta c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 反向引物SsSOD
<400> 11
cttcttttcc gctgcatccc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 正向引物ApSOD
<400> 12
ctttaagagg tacgagctcc 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 反向引物ApSOD
<400> 13
gtgctcccac acgtcaataa c 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 正向引物DrSOD
<400> 14
cttgagcccc atatcgacgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 反向引物DrSOD
<400> 15
cagaaggcgg cgaggtagtc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 正向引物Cdkn1A
<400> 16
ttcggcccag tggacagcga g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 反向引物Cdkn1A
<400> 17
gcttcctctt ggagaagatc a 21

Claims (17)

1.一种具有抗氧化活性的组合物，其包含：
源自植物细胞培养物的第一干提取物，所述第一干提取物包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶，源自植物细胞培养物的第二干提取物，所述第二干提取物包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶，和源自植物细胞培养物的第三干提取物，所述第三干提取物包含耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述植物细胞培养物是属于番茄属的细胞的培养物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，包含一重量份的包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物，0.01至100重量份、优选0.5-2重量份的包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物，和独立地0.01至100重量份、优选0.5-2重量份的包含耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物。
4.根据权利要求3所述的组合物，包含一重量份的包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物，一重量份的包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物，和一重量份的包含耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶的所述干提取物。
5.根据前述权利要求任一项所述的组合物，还包含至少一种亲水性溶剂，所述亲水性溶剂选自水、盐水溶液和有机溶剂。
6.根据权利要求1-5任一项所述的组合物的化妆品用途。
7.根据权利要求1-5任一项所述的组合物用作食品保鲜剂的用途。
8.用于局部应用的化妆品制剂，包含根据权利要求1-5任一项所述的组合物，至少一种化妆品活性物质和化妆品可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的化妆品制剂，其中所述制剂是凝胶、乳霜或洗剂。
10.一种食品或保健品，包含根据权利要求1-5任一项所述的组合物。
11.一种具有抗氧化活性的组合物，包含源自植物细胞培养物的干提取物，所述干提取物包含耐辐射奇球菌的超氧化物歧化酶。
12.一种具有抗氧化活性的组合物，包含源自植物细胞培养物的干提取物，所述干提取物包含硫磺矿硫化叶菌的超氧化物歧化酶。
13.一种具有抗氧化活性的组合物，包含源自植物细胞培养物的干提取物，所述干提取物包含嗜热泉生古细菌的超氧化物歧化酶。
14.根据权利要求11-13任一项所述组合物，还包含至少一种亲水性溶剂，所述亲水性溶剂选自水、盐水溶液和有机溶剂。
15.根据权利要求11-14任一项所述组合物，所述植物细胞培养物是属于番茄属的细胞的培养物。
16.根据权利要求11-15任一项所述组合物的化妆品用途。
17.根据权利要求11-15任一项所述组合物作为食品保鲜剂的用途。
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