CN105112379A - 基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶sod、制备方法及其应用 - Google Patents

基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶sod、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体为一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD、制备方法及其应用。本发明中的超氧化物歧化酶SOD的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:4～6所示。将本发明中的超氧化物歧化酶SOD添加到护肤品中，可使得护肤品在多种极端条件下亦都能发挥其效能，使清除超氧离子自由基的效率增高2.5倍，尤其是增强了高温、高盐、偏酸性环境下清除超氧离子自由基的能力。因此在夏季防晒性产品、沿海地区及易出汗的消费者群体中用广泛应用前景。

Description

基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及超氧化物歧化酶SOD，尤其涉及一种抗极特性超氧化物歧化酶SOD、高效制备方法及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
机体物质和能量代谢会产生一些有毒的副产物，例如超氧离子自由基(O2 -)。机体内O2 -形成分为生理性和病理性两方面。正常生理过程的O2 -主要来源于呼吸链中电子传递过程。多种疾病的发病过程中也会产生大量O2 -。过量的O2 -如不及时清除，会损伤细胞。机体存在应对超氧离子自由基的一套机制，主要包括超氧化物歧化酶SOD，它可以将O2 -歧化为H2O2和O2，而过氧化氢酶等可催化过氧化氢分解，最终清除超氧离子自由基。SOD专一性清除超氧离子自由基，催化反应：2H++O2 -→H2O2+O2。按照SOD所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD(二聚体，蓝绿色)、Mn-SOD(紫红色)和Fe-SOD(黄褐色)三种。SOD对过量超氧离子自由基的及时清除保证了机体内O2 -含量的相对平衡。因SOD具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用，在医药、化妆品及食品工业等方面有广泛应用。
SOD是一种酸性蛋白，具有一定的耐酸、抗热能力。由于护肤品多为中性、高盐、多种有机分子混合物的形式，因此如何提高护肤品中SOD的有效性成为其应用的关键。
发明内容
为了克服现有SOD在耐受极端条件方面的不足，本发明的目的在于提供一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD、制备方法及其应用。本发明的超氧化物歧化酶SOD能耐受极端条件，具有耐热、耐盐或耐酸等特性；本发明的超氧化物歧化酶SOD应用于护肤品，可提高护肤品清除超氧离子自由基的效果。
本发明的具体技术方案介绍如下。
本发明提供一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD，其为敏捷气热菌、沃氏嗜盐富饶菌、嗜酸热硫化叶菌的超氧化物歧化酶SOD，其氨基酸序列分别如SEQIDNO:4～6所示。
本发明还提供一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD的制备方法，具体步骤如下：
(1)构建超氧化物歧化酶SOD的重组表达质粒
基于极端微生物编码的超氧化物歧化酶SOD基因序列，设计引物，扩增基因，并将基因克隆到原核表达载体，构建超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒；
(2)重组表达超氧化物歧化酶SOD
将构建的超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)或Rosetta(DE3)，得到超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行菌超氧化物歧化酶SOD诱导表达；
(3)亲和纯化表达的超氧化物歧化酶SOD
离心收集诱导表达超氧化物歧化酶SOD后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集含有超氧化物歧化酶SOD的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中分别纯化超氧化物歧化酶SOD；
(4)检测超氧化物歧化酶SOD的酶活性和抗极特性
将纯化后超氧化物歧化酶SOD进行酶活性和抗极特性检测，从中筛选出耐受极端条件的的超氧化物歧化酶SOD。活性测定采用邻苯三酚自氧化法，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量定义为1个酶单位。
本发明中，步骤(1)中，所述极端微生物选自敏捷气热菌(Aeropyrumpernix)、沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)或嗜酸热硫化叶菌(Sulfololbusacidocaldarius)中任意一种。
本发明中，步骤(1)中，基于极端微生物编码的超氧化物歧化酶SOD基因序列分别如SEQIDNO:1～3所示。
本发明中，步骤(1)中，原核表达载体为pET28质粒。
本发明中，步骤(2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株培养至OD600＝0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。
本发明中，步骤(3)中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20mmol/LpH值为8.0的Tris-HCl,300mmol/LNaCl,0.5mmol/LDTT，10vol％甘油。
本发明还进一步提供一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD在护肤品中的应用。
与现有普通SOD相比，本发明的SOD能耐极端条件，具有耐热、耐盐、耐酸等显著特点，具体如下：
(1)抗逆性能好，由于极端微生物生存在高温、高盐等极端环境，它们的超氧化物歧化酶SOD具有相应的抗逆性能，在高温、高盐等极端环境下具有很高的活性，满足护肤品等行业的特殊需求。
(2)在护肤品应用中，添加1种或多种具有不同抗逆特性的SOD，可以综合应对高温、高盐、酸碱等特殊环境，大大提高了护肤品中SOD的总效果，使得护肤品在高温、高盐等情况下具有很强的清除超氧离子自由基的能力，改善护肤效果。
附图说明
图1是敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD的抗极特性图。
图2是沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD的抗极特性图。
图3是嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶SOD的抗极特性图；(A耐酸测试；B耐热测试)。
图4是敏捷气热菌、沃氏嗜盐富饶菌、嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶SOD对护肤品消除超氧离子自由基的促进作用对比图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。
实施例1敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD的制备
第一步，设计合成敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD基因，并插入pET28表达载体，构建超氧化物歧化酶SOD的重组表达质粒。重组敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD的N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。
敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD的基因序列如SEQIDNO：1所示。
第二步，重组表达敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD。将敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株。将表达菌株培养至OD600＝0.6，加入0.5mM诱导剂IPTG，在37℃温度下培养3小时，诱导超氧化物歧化酶SOD表达。
敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD重组蛋白的氨基酸序列(氮端→碳端)如SEQIDNO:4所示。
第三步，敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD亲和纯化。将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液(20mmol/LTris-HCl,pH8.0,300mmol/LNaCl,0.5mmol/LDTT，10vol％甘油)。超声波破碎菌体，70℃温度下加热失活大肠杆菌蛋白，离心收集含有敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD的菌体裂解上清液。利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD。
第四步，检测敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD的酶活性和耐热特性。
首先采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量定义为1个酶单位。敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD的比活性约为1560U/mg。
在活性测定基础上，检测敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD的耐热特性。将敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD在60温度保温1、2、4、8、16天，然后测定其剩余的酶活性大小。敏捷气热菌超氧化物歧化酶SOD重组蛋白的耐热特性见图1，结果表明其在60℃保温8天后的剩余活性大于80％，表明其具有很好的耐热性能。
实施例2沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD的制备
按照实施例1的工艺(第三步操作条件为：将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液(20mMTris-HCl,pH8.0,1MKCl,0.5mMDTT，10vol％甘油)。超声波破碎菌体，离心收集含有沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD的菌体裂解上清液。利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD。)制备沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD，该蛋白氨基酸序列(氮端→碳端)如SEQIDNO:5所示，编码该酶蛋白的基因序列如SEQIDNO:2所示。沃氏嗜盐富饶菌SOD耐盐性能见图2。结果表明具有很好耐盐特性，可耐受0.5-1MNaCl。
实施例3嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶SOD的制备
按照实施例1的工艺，制备嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶SOD，该蛋白氨基酸序列(氮端→碳端)如SEQIDNO:6所示，编码该酶蛋白的基因序列如SEQIDNO:3所示。嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶SOD耐酸热性能见图3。结果表明具有较好耐酸热特性。
实施例4基于多种抗极特性超氧化物歧化酶SOD的护肤品
1、分别将敏捷气热菌、沃氏嗜盐富饶菌、嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶SOD单一添加到化妆品中，测定超氧离子自由基的清除能力，发现相比大肠杆菌SOD，三者的清除效率分别提高1.5、1.6、1.8倍。
2、将纯化的敏捷气热菌、沃氏嗜盐富饶菌、嗜酸热硫化叶菌超氧化物歧化酶SOD按等比例混合，然后按1，5，25，100μg/mL的总SOD量添加到护肤品中，与大肠杆菌SOD实验组(添加量为1，5，25，100μg/mL)做比较。两种情况下超氧离子自由基的清除结果见图4。结果表明相比大肠杆菌SOD，本专利中的抗极特性超氧化物歧化酶实验组在45度下的超氧离子自由基清除活性增强3.9倍。

Claims (8)

1.一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD，其特征在于，其为敏捷气热菌、沃氏嗜盐富饶菌、嗜酸热硫化叶菌的超氧化物歧化酶SOD，其氨基酸序列分别如SEQIDNO:4～6所示。
2.一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建超氧化物歧化酶SOD的重组表达质粒
基于极端微生物编码的超氧化物歧化酶SOD基因序列，设计引物，扩增基因，并将基因克隆到原核表达载体，构建超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒；
(2)重组表达超氧化物歧化酶SOD
将构建的超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)或Rosetta(DE3)，得到超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行菌超氧化物歧化酶SOD诱导表达；
(3)亲和纯化表达的超氧化物歧化酶SOD
离心收集诱导表达超氧化物歧化酶SOD后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集含有超氧化物歧化酶SOD的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中分别纯化超氧化物歧化酶SOD；
(4)检测超氧化物歧化酶SOD的酶活性和抗极特性
将纯化后超氧化物歧化酶SOD进行酶活性和抗极特性检测，从中筛选出耐受极端条件的的超氧化物歧化酶SOD。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述极端微生物选自敏捷气热菌(Aeropyrumpernix)、沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)或嗜酸热硫化叶菌(Sulfololbusacidocaldarius)中任意一种。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，基于极端微生物编码的超氧化物歧化酶SOD基因序列分别如SEQIDNO:1～3所示。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，原核表达载体为pET28质粒。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株培养至OD600＝0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20mmol/LpH值为8.0的Tris-HCl,300mmol/LNaCl,0.5mmol/LDTT，10vol％甘油。
8.一种基于耐受极端条件的超氧化物歧化酶SOD在护肤品中的应用。
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Application publication date: 20151202

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