CN107988249A - 一种耐有机试剂的超氧化物歧化酶sod的制备方法及其应用 - Google Patents

一种耐有机试剂的超氧化物歧化酶sod的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备方法及其应用。本发明中将具有耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD添加到护肤品中，增加护肤品清除超氧离子自由基的效果，起到抗氧化护理效果。本发明的有益效果在于：由于添加了耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD，使得SOD的酶活性得到了很好的保护，改善了护肤品的使用效果。

Description

一种耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及超氧化物歧化酶，尤其涉及抗极特性超氧化物歧化酶SOD的高效制备技术及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
机体物质和能量代谢会产生一些有毒的副产物，例如超氧离子自由基（O2-）。过量的O2-如不及时清除，会损伤细胞。机体存在应对超氧离子自由基的一套机制，主要包括超氧化物歧化酶SOD，它可以将O2-歧化为H2O2和O2，而过氧化氢酶等可催化过氧化氢分解，最终清除超氧离子自由基。SOD专一性清除超氧离子自由基，催化反应：2H+ + O2- →H2O2 +O2。SOD对过量超氧离子自由基的及时清除保证了机体内O2-含量的相对平衡。因SOD具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用，在医药、化妆品及食品工业等方面有广泛应用。
由于护肤品多为中性、高盐、多种有机分子混合物的形式，因此如何提高护肤品中SOD的有效性成为其应用的关键。基于护肤品的这些特点，我们从极端微生物中筛选到了能够耐有机试剂的SOD，并将其应用于护肤品中。
发明内容
为了克服现有SOD耐有机试剂能力等方面的不足，我们从沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)中筛选到了1种SOD，具有耐有机试剂等特性，提高了SOD的性能，扩大了SOD的使用范围。并将SOD应用于护肤品，提高了护肤品清除超氧离子自由基的效果。
本发明提供耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备技术，并应用于护肤品中，具体步骤如下：
（1）构建超氧化物歧化酶SOD的重组表达质粒
基于嗜热微生物超氧化物歧化酶SOD基因，设计引物序列，通过PCR扩增超氧化物歧化酶SOD基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28，构建超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒；
（2）重组表达超氧化物歧化酶SOD
将构建的超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）或Rosetta2（DE3），得到超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株；用诱导剂IPTG进行超氧化物歧化酶SOD诱导表达；
（3）亲和纯化表达的超氧化物歧化酶SOD
离心收集诱导表达超氧化物歧化酶SOD后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集含有超氧化物歧化酶SOD的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化超氧化物歧化酶SOD；
（4）检测超氧化物歧化酶SOD的酶活性和耐有机试剂特性，筛选出耐有机试剂特性好、活性高的超氧化物歧化酶SOD。
活性测定采用邻苯三酚自氧化法，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。
本发明中，步骤（1）中，所述微生物为沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)。
本发明中，步骤（2）中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将SOD重组表达菌株培养至OD600=0.4-1.0，再加入0.5mM 诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。
本发明中，步骤（3）中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20 mM pH值为 8.0的Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0.5mM DTT，10vol% 甘油。
本发明中，所述超氧化物歧化酶SOD来源于沃氏嗜盐富饶菌，其中：编码沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD的基因序列如SEQ ID NO:1所示；沃氏嗜盐富饶菌的超氧化物歧化酶SOD的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
与现有普通SOD相比，本发明的SOD具有耐有机试剂等显著特点，具体如下：
（1）耐有机试剂性能好，满足护肤品等行业的特殊需求。
（2）在护肤品应用中，添加耐有机试剂的SOD，大大提高了护肤品中SOD的总效果，使得护肤品具有很强的清除超氧离子自由基的能力，改善护肤效果。
附图说明
图1为沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD的耐有机试剂的特性图。
图2为沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD对护肤品消除超氧离子自由基的促进作用对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1：沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD的制备
第一步，设计合成超氧化物歧化酶SOD基因，并插入pET28表达载体，构建超氧化物歧化酶SOD的重组表达质粒。重组超氧化物歧化酶SOD的N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。
超氧化物歧化酶SOD的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
atgagctacg aactcgaccc gcttccgtac gagtacgacg ccctcgaacc gcacatctcc 60
gagcaggtgc tgacgtggca tcacgacacc caccaccagg gctacgtcaa cggctggaac 120
gcggacgacg agaccctcgc cgagaaccgc gaagcaggcg agttcggctc gtccgccggc 180
gccgtccgca acgtcaccca caacggctcg ggacacattc tgcacgacct gttctggcag 240
aacatgtcgc cggaaggcgg cgacgagccc gagggactgc tcgcagagcg catcgcggag 300
gacttcggtt cctacgaggc gtggaagggt gaattcgaag cggcggccgg cgcggccgcg 360
ggctgggcgc ttctggtgta cgactcgttc tcgaaccagc ttcggaacgt cgtcgtcgac 420
aagcacgacc agggcgcgct ctggggtagc catcccatcc tcgcgctgga cgtctgggag 480
cactcgtact accacgacta cggcccggcc cgcggcgact tcgtctccgc gttcttcgag 540
gtcgtcgact gggacgaacc cgccgctcgc tacgagcagg ccgtcgaact cttcgagtaa 600
第二步，重组表达超氧化物歧化酶SOD。将超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株。将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM 诱导剂IPTG，在37℃温度下培养3小时，诱导超氧化物歧化酶SOD表达。
超氧化物歧化酶SOD重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如SEQ ID NO:2所示。
MSYELDPLPY EYDALEPHIS EQVLTWHHDT HHQGYVNGWN ADDETLAENR EAGEFGSSAG 60
AVRNVTHNGS GHILHDLFWQ NMSPEGGDEP EGLLAERIAE DFGSYEAWKG EFEAAAGAAA 120
GWALLVYDSF SNQLRNVVVD KHDQGALWGS HPILALDVWE HSYYHDYGPA RGDFVSAFFE 180
VVDWDEPAAR YEQAVELFE 199
第三步，超氧化物歧化酶SOD亲和纯化。将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液（20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5mM DTT，10vol% 甘油）。超声波破碎菌体，70℃温度下加热失活大肠杆菌蛋白，离心收集含有超氧化物歧化酶SOD的菌体裂解上清液。利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化超氧化物歧化酶SOD。
第四步，检测超氧化物歧化酶SOD的酶活性和耐有机试剂特性。
首先采用邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。超氧化物歧化酶SOD的比活性约为1560U/mg。
在活性测定基础上，检测超氧化物歧化酶SOD的耐有机试剂特性。将超氧化物歧化酶SOD在各种有机试剂中测定其酶活性大小。结果表明其在多种去垢剂型有机试剂中具有很好的耐热性能。
实施例2 基于耐有机试剂超氧化物歧化酶SOD的护肤品
将纯化的沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD按1，5，25，100μg/mL 的总SOD量添加到护肤品中，与大肠杆菌SOD实验组（添加量为1，5，25，100μg/mL）做比较。两种情况下超氧离子自由基的清除结果表明相比大肠杆菌SOD，本专利中的耐有机试剂超氧化物歧化酶实验组的酶活性最高增强2.5倍。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1）SEQ ID NO：1
atgagctacg aactcgaccc gcttccgtac gagtacgacg ccctcgaacc gcacatctcc 60
gagcaggtgc tgacgtggca tcacgacacc caccaccagg gctacgtcaa cggctggaac 120
gcggacgacg agaccctcgc cgagaaccgc gaagcaggcg agttcggctc gtccgccggc 180
gccgtccgca acgtcaccca caacggctcg ggacacattc tgcacgacct gttctggcag 240
aacatgtcgc cggaaggcgg cgacgagccc gagggactgc tcgcagagcg catcgcggag 300
gacttcggtt cctacgaggc gtggaagggt gaattcgaag cggcggccgg cgcggccgcg 360
ggctgggcgc ttctggtgta cgactcgttc tcgaaccagc ttcggaacgt cgtcgtcgac 420
aagcacgacc agggcgcgct ctggggtagc catcccatcc tcgcgctgga cgtctgggag 480
cactcgtact accacgacta cggcccggcc cgcggcgact tcgtctccgc gttcttcgag 540
gtcgtcgact gggacgaacc cgccgctcgc tacgagcagg ccgtcgaact cttcgagtaa 600
2）SEQ ID NO:2
MSYELDPLPY EYDALEPHIS EQVLTWHHDT HHQGYVNGWN ADDETLAENR EAGEFGSSAG 60
AVRNVTHNGS GHILHDLFWQ NMSPEGGDEP EGLLAERIAE DFGSYEAWKG EFEAAAGAAA 120
GWALLVYDSF SNQLRNVVVD KHDQGALWGS HPILALDVWE HSYYHDYGPA RGDFVSAFFE 180
VVDWDEPAAR YEQAVELFE 199

Claims (6)

1.一种抗耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤（1）构建超氧化物歧化酶SOD的重组表达质粒
基于嗜盐菌编码的超氧化物歧化酶SOD基因序列，设计引物，扩增基因，并将基因克隆到原核表达载体pET28，构建超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒；
步骤（2）重组表达超氧化物歧化酶SOD
将构建的超氧化物歧化酶SOD重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）或Rosetta(DE3)，得到超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行菌超氧化物歧化酶SOD诱导表达；
步骤（3）亲和纯化表达的超氧化物歧化酶SOD
离心收集诱导表达超氧化物歧化酶SOD后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集含有超氧化物歧化酶SOD的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中分别纯化超氧化物歧化酶SOD；
步骤（4）检测超氧化物歧化酶SOD的酶活性和抗极特性
将纯化后超氧化物歧化酶SOD进行酶活性和抗极特性检测，得到具有耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD。
2.根据权利要求1所述的一种抗耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述嗜盐菌为沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)。
3.根据权利要求1所述的一种抗耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将超氧化物歧化酶SOD重组表达菌株培养至OD600=0.4-1.0，再加入0.5mM诱导剂IPTG在37℃温度下培养3小时或22℃温度下培养12小时进行诱导表达。
4.根据权利要求1~3所述的一种抗耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备方法制备得到的超氧化物歧化酶SOD。
5.根据权利要求4所述的一种抗耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备方法制备得到的超氧化物歧化酶SOD，其特征在于：所述超氧化物歧化酶SOD为沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD；所述沃氏嗜盐富饶菌超氧化物歧化酶SOD的基因序列为：
1）SEQ ID NO：1
atgagctacg aactcgaccc gcttccgtac gagtacgacg ccctcgaacc gcacatctcc 60
gagcaggtgc tgacgtggca tcacgacacc caccaccagg gctacgtcaa cggctggaac 120
gcggacgacg agaccctcgc cgagaaccgc gaagcaggcg agttcggctc gtccgccggc 180
gccgtccgca acgtcaccca caacggctcg ggacacattc tgcacgacct gttctggcag 240
aacatgtcgc cggaaggcgg cgacgagccc gagggactgc tcgcagagcg catcgcggag 300
gacttcggtt cctacgaggc gtggaagggt gaattcgaag cggcggccgg cgcggccgcg 360
ggctgggcgc ttctggtgta cgactcgttc tcgaaccagc ttcggaacgt cgtcgtcgac 420
aagcacgacc agggcgcgct ctggggtagc catcccatcc tcgcgctgga cgtctgggag 480
cactcgtact accacgacta cggcccggcc cgcggcgact tcgtctccgc gttcttcgag 540
gtcgtcgact gggacgaacc cgccgctcgc tacgagcagg ccgtcgaact cttcgagtaa 600
所述沃氏嗜盐富饶菌的超氧化物歧化酶SOD的氨基酸序列：
2）SEQ ID NO:2
MSYELDPLPY EYDALEPHIS EQVLTWHHDT HHQGYVNGWN ADDETLAENR EAGEFGSSAG 60
AVRNVTHNGS GHILHDLFWQ NMSPEGGDEP EGLLAERIAE DFGSYEAWKG EFEAAAGAAA 120
GWALLVYDSF SNQLRNVVVD KHDQGALWGS HPILALDVWE HSYYHDYGPA RGDFVSAFFE 180
VVDWDEPAAR YEQAVELFE 199。
6.根据权利要求1~3所述的一种抗耐有机试剂的超氧化物歧化酶SOD的制备方法制备得到的超氧化物歧化酶SOD在护肤品中的应用。
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