CN110846296A - 枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供枯草芽孢杆菌β‑甘露聚糖酶的克隆表达与应用，为实现对魔芋葡甘聚糖具有高度专一性的β‑甘露聚糖酶基因的异源表达，从枯草芽孢杆菌G1中克隆出β‑甘露聚糖酶基因BsmanA，将该基因与表达载体pACYCDuet‑1连接并转化到E.coil BL21(DE3)中。结果表明:该β‑甘露聚糖酶基因BsmanA序列全长为1098 bp，编码366个氨基酸；经Ni柱亲和层析纯化后，测得重组酶分子量大小为38 kD；酶学性质研究结果显示：该酶促反应的最适温度为65℃，最适pH值为6.5，在温度50~70℃间，pH4.5~7.0的范围内能保持较好的稳定性。本研究实现了β‑甘露聚糖酶的异源表达，为生物催化制备低聚甘露糖的工业化提供了新的选择。

Description

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA的克隆表达、重组酶及其应用。
背景技术
β-甘露聚糖酶(β-mannanase)属于半纤维素酶类，是一类能够切断甘露聚糖(包括线性甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖等)主链中β-1,4-D-甘露糖苷键(图1)的内切水解酶，水解产生的甘露低聚糖具有优异的生理活性，能够有效改善肠道环境和功能，增强人体机能，是一种优良的保健品。甘露聚糖酶在食品、饲料、医药、生物能源等的开发领域具有较大的应用价值，同时也是降解植物生物量的重要自然资源。
甘露聚糖酶在自然界中普遍存在，微生物是其最主要的生产来源，而细菌产的β-甘露聚糖酶比真菌来源的温度稳定性更好，尤其是以芽孢杆菌来源的甘露聚糖酶。虽然目前有大量不同种类不同来源的β-甘露聚糖酶被发现，但野生型β-甘露聚糖酶尚不能完全满足工业化生产的需求，酶学性质上都存在一定的缺陷，如野生型甘露聚糖酶活性较低，部分野生型甘露聚糖酶对于魔芋粉的降解能力较差，无法充分利用我国丰富的魔芋资源。通过异源表达提高β-甘露聚糖酶的酶活和适用范围，获取活性较高的、生产成本较低的甘露聚糖酶，进一步拓宽魔芋的应用范围，开发高附加值的魔芋产品，无疑是甘露聚糖酶进一步扩大应用市场的重要方式。目前已经实现了甘露聚糖酶基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、黑曲霉和里氏木霉中的成功表达，马威等将枯草芽孢杆菌MA139中的β-甘露聚糖酶基因进行优化设计并在毕赤酵母X-33中进行表达，10L发酵罐培养诱导72h时，可达到最大酶活2100U/mL，异源表达后甘露聚糖酶酶学性质更优良。但目前对魔芋葡甘聚糖具有高度专一性的β-甘露聚糖酶的克隆表达及性质解析仍有待进一步深入。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的技术方案前期以魔芋粉为唯一碳源，从土壤中定向筛选出可高效降解魔芋葡甘聚糖为魔芋低聚糖的细菌Bacillus subtilis G1。本发明将Bacillus subtilis G1中的β-甘露聚糖酶基因BsmanA转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达，利用表达载体中的His-Tag编码序列对重组酶进行分离纯化，得到重组酶。
一种枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA，其氨基酸序列如SED ID No.2所示。
作为改进的是，编码上述氨基酸序列的核苷酸序列如SED ID No.1所示。
一种重组表达载体，含有所述编码枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA基因的核苷酸序列的重组表达载体。
一种重组菌，含有上述枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA基因的表达载体的重组菌。
枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA的克隆表达，包括以下步骤：
(1)PCR扩增SED ID No.1所示的核苷酸序列；
(2)构建重组表达载pACYCDuet-1-BsmanA；
将PCR扩增的DNA序列和pACYCDuet-1经同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经T4连接酶切产物，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含氯霉素的LB平板上，避光培养，筛选阳性转化子培养提取质粒，即得到重组表达载pACYCDuet-1-BsmanA；
(3)将重组表达载体pACYCDuet-1-BsmanA转入表达宿主E.coil BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含氯霉素的LB抗性平板上，筛选阳性转化子，得到含有pACYCDuet-1-BsmanA的E.coli BL21(DE3)的单菌落；
(4)挑选含有pACYCDuet-1-BsmanA的E.coli BL21(DE3)的单菌落转接到含氯霉素的LB液体培养基中，继续培养，加入诱导剂IPTG进行诱导表达后收集菌体；
(5)用磷酸缓冲液洗涤菌体后用磷酸缓冲液重悬细胞，超声波破碎后，离心收集上清液，上清液经Ni-NTA柱纯化、过滤、咪唑缓冲液洗脱，收集活性液冷冻保存。
步骤(1)中扩增所用引物为：
上游引物Man-F：5'-CAGCCAGGATCCAGGGGAGTTGCATTTG-3'，
下游引物Man-R：5'-GGCCGCAAGCTTTTACTCAACGATTGGCGTTAAAG-3'。
步骤(2)中PCR扩增的DNA序列与pACYCDuet-1经BamH I和Hind III双酶切。
本发明的又一技术方案是将所述的枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA在水解魔芋粉中的魔芋葡甘聚糖中的应用。
所述的枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA的反应温度为45-70℃，pH为5.0-7.0。
与现有技术相比，本发明从魔芋生长的土壤里分离出一株具有甘露聚糖水解能力的枯草芽孢杆菌G1，研究发现产生的甘露聚糖酶对魔芋粉水解效率较高，能水解魔芋粉中的魔芋葡甘聚糖得到魔芋低聚糖，有效提高魔芋的深加工利用价值。
本发明中成功克隆枯草芽孢杆菌G1中的甘露聚糖酶BsmanA编码基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了异源表达，重组β-甘露聚糖酶为胞内酶，对魔芋粉的比活性为220U/mg，纯化后的酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为60℃；在50℃处理90min后残留酶活性为64％，80℃处理30min后残留酶活性为35％；其最适pH为6.5，在pH4.5～7.0的范围内较稳定；所测酶的最适底物为魔芋粉，其对魔芋粉的Km和Vmax值分别为4.09mg/mL和9.86μmol/(mL·min)。本研究描述了BsmanA的克隆和详细的序列分析，这些研究为生物催化制备低聚甘露糖的工业化生产奠定了基础，展示了其在食品和动物饲料技术中的潜在应用价值，也为其它新酶在的基因进一步开发和应用上提供了新的思路和策略。
附图说明
图1β-甘露聚糖酶作用位点。
图2重组表达载体pACYCDuet-1-BsmanA结构示意图。
图3PCR扩增产物电泳图，M为DL 5000DNA Marker；泳道1、2为BsmanA基因。
图4PCR产物与质粒进行双酶切，M为DL5000 DNA Marker；泳道1为目的基因BsmanA；泳道2为BamH I和Hind III双酶切目的基因BsmanA；泳道3为BamH I和Hind III双酶切质粒pACYCDuet-1；泳道4为质粒pACYCDuet-1。
图5重组表达质粒pACYCDuet-1-BsmanA的酶切电泳图谱，M为DL5000 DNA Marker；泳道1为BamH I和Hind III双酶切质粒pACYCDuet-1；泳道2为质粒pACYCDuet-1；泳道3为BamH I和Hind III双酶切重组质粒pACYCDuet-1-BsmanA。
图6重组蛋白氨基酸序列比对。
图7重组菌株与空载菌株酶活检测。
图8重组蛋白纯化SDS-PAGE电泳，M为蛋白Marker；泳道1为40mmol/L咪唑平衡缓冲液第10毫分；泳道2为40mmol/L咪唑平衡缓冲液第1毫分；泳道3为20mmol/L咪唑平衡缓冲液第6毫分；泳道4为粗酶液。
图9重组甘露聚糖酶最适反应温度和温度稳定性，A：重组β-甘露聚糖酶的最适温度；B：重组β-甘露聚糖酶的温度稳定性。
图10重组甘露聚糖酶最适pH和pH稳定性，A：重组β-甘露聚糖酶的最适pH；B：重组β-甘露聚糖酶的pH稳定性。
具体实施方式
实施例1
菌株来源
枯草芽孢杆菌G1(Bacillus subtilis G1)、Escherichia coil DH5α、E.coilBL21(DE3)本实验室保存菌株，(筛选培养方法见β-甘露聚糖酶产生菌的筛选及魔芋低聚糖制备工艺的研究，中国酿造，2018年第37卷第8期)；质粒pACYCDuet-1上海生工生物工程有限公司；Taq DNA polymerase、DL 5000bp Marker、蛋白质电泳Marker、6×loadingBuffer、5×蛋白上样缓冲液TAKARA有限公司；BamH I和Hind III限制性内切酶上海生工生物工程有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒Vazyme生物技术有限公司；魔芋粉宜昌一致魔芋公司葡甘聚糖纯度>95％；瓜尔胶源叶生物分析纯；刺槐豆胶SIGMA公司分析纯；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)calbiochem公司纯度>99.9％；其它试剂国产或进口分析纯；PCR引物合成及测序上海生工生物技术有限公司。
C1000 Touch PCR仪、Gel Doc XR+凝胶成像仪Bio-Rad公司；UV1800紫外可见分光光度计岛津企业管理有限公司；SX-700蒸汽灭菌器、MX-307落地高速冷冻离心机日本Tomy公司；NanoDrop One超微量紫外可见分光光度计Thermo公司；SW-CJ-2FD超净工作台苏州净化设备有限公司；ZQLY-180S恒温培养摇床上海知楚仪器有限公司；LRH-250A生化培养箱泰宏医疗器械有限公司。
表达载体的构建：依据TIANamp Soil DNA Kit试剂盒的方法从B.subtilis G1提取基因组DNA，根据文献报道的β-甘露聚糖酶基因序列及表达载体pACYCDuet-1的多克隆位点设计引物。引物设计如下：
上游引物Man-F：5'-CAGCCAGGATCCAGGGGAGTTGCATTTG-3'(下划线处为BamH I酶切位点)，
下游引物Man-R：5'-GGCCGCAAGCTTTTACTCAACGATTGGCGTTAAAG-3'(下划线处为Hind III酶切位点)。
PCR反应体系：1μL基因组DNA模板，2μL Man-F(10μmol/L)，2μL Man-R(10μmol/L)，25μL Prime STAR MAX Premix(2X)，20μL ddH2O。PCR扩增反应条件：98℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min 30s，30个循环，最后72℃保温5min。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收扩增产物送至上海生工生物技术有限公司测序。
将质粒pACYCDuet-1经BamH I和Hind III双酶切，胶回收目的条带，与经同样双酶切的目的基因PCR产物通过T4连接酶16℃过夜连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃避光培养，筛选阳性转化子培养提取质粒，经BamH I和Hind III双酶切验证及送至上海生工生物技术有限公司测序，将验证正确的克隆载体命名为pACYCDuet-1-BsmanA(如图2)。
重组蛋白的表达与纯化：将重组表达载体pACYCDuet-1-BsmanA转入表达宿主E.coil BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含100g/mL氯霉素的LB抗性平板上，筛选阳性转化子。将验证正确的含有pACYCDuet-1-BsmanA的E.coli BL21(DE3)单菌落接种于含100μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养14h。按OD600 0.1的接种量转接到含100μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，继续培养OD600至0.6。加入诱导剂IPTG使其终浓度为0.8mmol/L，于20℃，160r/min诱导表达8h后4℃、11000r/min离心10min收集菌体。用50mmol/L、pH6.5的磷酸缓冲液洗涤菌体3次后，按菌体与缓冲液1:10的比例加0.05mol/L磷酸缓冲液重悬细胞，超声波破碎后于4℃、11000r/min离心30min收集上清液。
本实验pACYCDuet-1-BsmanA中含有His-Tag编码序列，采用Ni-NTA柱纯化目标蛋白的方法纯化，将目的蛋白上清液经0.45μm滤膜过滤后上柱，分别用10mL含20、40和300mmol/L咪唑的缓冲液进行洗脱，并按照每流出液1mL为1毫分收集，收集活性部分保存于-20℃备用。
酶活力及蛋白质的分析：重组蛋白分析采用SDS-PAG，浓缩胶5％，分离胶10％，考马斯亮蓝R-250染色显示蛋白带；蛋白质含量测定采用Bradford法。
最适温度及温度稳定性将纯化后的β-甘露聚糖酶用pH6.5的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液稀释，分别于30～80℃的温度下保温10min，测定酶活力，研究温度对酶促反应的影响；将酶液置于50～80℃下保温90min，每隔10min取样测定酶活力，研究酶在不同温度下的稳定性。
最适pH及pH稳定性：分别在60℃，pH3.0～8.0的条件测定β-甘露聚糖酶的酶活力，研究酶的最适pH；将酶液加入上述不同梯度pH的缓冲液中稀释，置于4℃条件下放置1h后测定其残留酶活力，研究酶在不同pH下的稳定性。
酶的反应动力学分析:用pH6.5、50mmol/L的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液配制质量浓度为5g/L的魔芋粉、瓜尔胶、刺槐豆胶，测定β-甘露聚糖酶对不同底物的催化活力。以不同浓度(3～10g/L)魔芋粉、瓜尔胶、刺槐豆胶(用pH6.5的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液配制)为底物，在pH6.5，60℃的条件下测定酶的催化活力，Km和Vmax值通过Linewear-Burk方法得到。
运用NCBI数据库中的Blast对PCR扩增的基因序列进行在线比对，采用DNA STAR进行蛋白的多序列比对并绘制质粒pACYCDuet-1-BsmanA图谱；采用Excel对重组酶酶学性质数据作图；采用Oridin 9.5软件并进行非线性拟合，计算β-甘露聚糖酶的Km和Vmax值。实验重复3次取平均值为最终结果。
β-甘露聚糖酶(BsmanA)基因的表达与纯化：
扩增及序列分析：PCR扩增结果如图3所示，获得一条约为1100bp的特异性单一亮条带，与预期条带大小一致。将扩增产物经胶回收后送至上海生工生物工程公司进行测序，对测序结果通过在线BLAST程序对GENBANK中登录的基因和蛋白质序列进行比对发现，扩增所获得的基因序列及推断的蛋白质序列与GenBank中已经登录的枯草芽孢杆菌WL-7和枯草芽孢杆菌CICC9011中的β-甘露聚糖酶基因和蛋白质序列具有高度一致性，最高分别达到99％和98％，初步鉴定扩增的基因为β-甘露聚糖酶基因，将其命名为BsmanA基因。
表达载体的构建：将上述PCR扩增所得产物纯化后，与质粒pACYCDuet-1分别用BamH I和Hind III双酶切(如图4)，酶切位点位于目的基因两端，经双酶切后目的基因大小变化很小，电泳结果与预期相符，胶回收产物后将分别经酶切的载体pACYCDuet-1与PCR产物通过T4连接酶过夜连接，得到重组表达质粒pACYCDuet-1-BsmanA。
对筛选到的阳性克隆pACYCDuet-1-BsmanA再次用BamH I和Hind III进行双酶切(图5)，1号泳道为BamH I和Hind III双酶切质粒pACYCDuet-1结果，于5000bp位置附近可见一条清晰地条带，3号泳道为双酶切结果，可以清晰观察到5000bp和1100bp附近两条电泳带，条带大小与质粒及目的基因大小相符，可初步验证目的基因BsmanA成功连接至pACYCDuet-1。
序列分析：将酶切验证正确的质粒送至上海生工公司测序，并在NCBI数据库中进行比对，结果显示：该β-甘露聚糖酶基因的序列全长为1098bp，包含366个氨基酸的编码序列。通过NCBI中的Blast比对β-甘露聚糖酶的氨基酸序列结果如图6所示：该酶的氨基酸序列与芽孢杆菌属来源的MK-2(2016)β-mannanase(man)gene(GenBank登录号:ANG59296.1)和Bacillus subtilis subsp.subtilis str.SC-8(GenBank登录号:EHA29041.1)的序列相似性高达99％。
重组蛋白的异源表达和纯化：将样品组(构建成功的重组菌株E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA)和空白组(没有整合BsmanA基因的pACYCDuet-1空载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达的空白菌株E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-1)，分别以IPTG为诱导剂以相同的条件进行重组蛋白的诱导表达，收集的菌体经超声破碎破壁后测定酶活(图7)，测得空白组菌株E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-1无明显β-甘露聚糖酶活力，诱导表达的样品组重组菌株E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA破壁上清的β-甘露聚糖酶活力高达220U/mg。而没有IPTG诱导作用的重组菌株E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA培养后也无法测得甘露聚糖酶活性。由此可证明，枯草芽孢杆菌G1中的β-甘露聚糖酶基因BsmanA成功地在大肠杆菌中获得了表达。
重组菌菌体破壁上清液蛋白SDS-PAGE电泳分析如图8所示，重组菌E.coli BL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA在IPTG诱导下进行异源表达的β-甘露聚糖酶含有His标签，经镍柱亲和层析纯化后，与重组菌菌体破壁上清液相比，纯化后的目的蛋白条带较单一，目的条带分子量约为38kD，与预期相符，这与已报道的Bacillus subtilis BCC41051中的β-甘露聚糖酶蛋白分子量相近，均为38kD。
最适反应温度和温度稳定性：温度对重组甘露聚糖酶活力的影响结果如图9所示，酶的最适温度为60℃，在45～70℃间保持60％以上的酶活，由Srivastava等研究可知，微生物来源的甘露聚糖酶在37～70℃的不同温度下具有活性，从各种芽孢杆菌分离出的甘露聚糖酶在50～70℃范围内具有活性。一般来说，细菌甘露聚糖酶比真菌甘露聚糖酶更耐热，这是纸浆漂白等工业应用的一个重要特性。将该重组酶置于不同温度下孵育90min后，测定其剩余酶活力的结果显示，在50～70℃保温70min时，剩余酶活力在70％以上，可以认为具有较好的热稳定性；当处理温度提高至80℃以上，酶活显著降低。
最适pH和pH稳定性：不同pH对重组甘露聚糖酶活力的影响结果如图10所示，纯化后的甘露聚糖酶蛋白在pH6.5条件下酶活最高，且在pH5.0～7.0之间表现出显著(P＜0.05)活性，保留最高酶活79％以上的活性。酸碱度对酶功能的影响与酶底物复合物的形成有关，催化作用往往依赖于酶和底物上的电荷分布。据报道，细菌来源的甘露聚糖酶在中性至碱性的pH下具有最大活性，例如Srivastava等研究报道的Bacillus sp.CFR1601产的一种β-甘露聚糖酶(GH-26)在pH7下具有最佳活性。在pH稳定性方面，许多真菌来源获得的-β-甘露聚糖酶在酸性到中性范围(pH4.0～7.0)内可保持最高酶活的80％活性，细菌甘露聚糖酶在pH6.0～9.0范围内表现出显著的稳定性，本实验中，在pH4.5～7.0，重组酶的酶活表现出高度的稳定性，于4℃保温1h，剩余酶活仍达75％以上。
β-甘露聚糖酶的反应动力学分析：通过改变底物的浓度，测定纯化后的重组甘露聚糖酶对不同底物的活性，结果显示重组酶对魔芋粉精粉催化活性最高，将其对魔芋粉的催化活性定为100％，该酶对刺槐豆胶和瓜尔胶的催化活性远低于魔芋精粉，相对酶活分别为20.9％和0.08％。重组甘露聚糖酶对魔芋粉的Km和Vmax值分别为4.09mg/mL和9.86μmol/(mL·min)。
Figure BDA0002271906520000081
Figure 15014537993
Figure 15014538037

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA，其特征在于，其氨基酸序列如SED ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA，其特征在于，编码上述氨基酸序列的核苷酸序列如SED ID No.1所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，含有所述编码枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA基因的核苷酸序列的重组表达载体。
4.一种重组菌，含有上述枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA基因的表达载体的重组菌。
5.枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA的克隆表达，其特征在于，包括以下步骤：
（1）PCR扩增SED ID No.1所示的核苷酸序列；
（2）构建重组表达载pACYCDuet-1-BsmanA；
将PCR扩增的DNA序列和pACYCDuet-1经同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经T4连接酶切产物，将连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，涂布于含氯霉素的LB平板上，避光培养，筛选阳性转化子培养提取质粒，即得到重组表达载pACYCDuet-1-BsmanA；
（3）将重组表达载体pACYCDuet-1-BsmanA转入表达宿主E.coil BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含氯霉素的LB抗性平板上，筛选阳性转化子，得到含有pACYCDuet-1-BsmanA的E.coli BL21(DE3) 的单菌落；
（4）挑选含有pACYCDuet-1-BsmanA的E.coli BL21(DE3) 的单菌落转接到含氯霉素的LB液体培养基中，继续培养，加入诱导剂IPTG进行诱导表达后收集菌体；
（5）用磷酸缓冲液洗涤菌体，再既然磷酸缓冲液重悬细胞，超声波破碎后，离心收集上清液，上清液经Ni-NTA柱纯化、过滤、咪唑缓冲液洗脱，收集活性液冷冻保存。
6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA的克隆表达，其特征在于，步骤（1）中扩增所用引物为：
上游引物Man-F：5'-CAGCCAGGATCCAGGGGAGTTGCATTTG-3'，
下游引物Man-R：5'-GGCCGCAAGCTTTTACTCAACGATTGGCGTTAAAG-3'。
7.根据权利要求6所述的枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA的克隆表达，其特征在于，步骤（2）中PCR扩增的DNA序列与pACYCDuet-1经BamH I和Hind III双酶切。
8.权利要求5-7任一项所述的枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA在水解魔芋粉中的魔芋葡甘聚糖中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶BsmanA的反应温度为45-70℃，pH为5.0-7.0。
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