CN102533700A - β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质为序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明提供的蛋白质具有β-甘露聚糖酶活性，且适用范围广，在37-65℃和pH5-9都有较高的活性。本发明提供的重组菌能高效表达序列1所示的蛋白质，并将蛋白质分泌到胞外，使得蛋白的纯化变得简单和经济。本发明提供的蛋白质可以作为饲料添加剂。本发明对于工业生产和动物养殖具有重大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用。
背景技术
β-甘露聚糖酶(EC3.3.1.78)是一类能够水解甘露聚糖，葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的内切酶。它以内切的方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖。
甘露聚糖是一种半纤维素的主要成分，在植物中广泛存在。半乳甘露聚糖是大量存在于植物种子中的半纤维素。例如，我国西南地区大量种植的魔芋的主要成份为葡萄甘聚糖，我国饲料中大量应用的玉米和大豆也含有大量的甘露聚糖(占非淀粉多糖的比例高达11.7％和22.7％)。畜禽和鱼类本身并不产生甘露聚糖酶，因此需添加外源的甘露聚糖酶帮助分解，以促进动物对饲料的能量利用率。
目前，甘露聚糖酶已广泛应用于医药、食品、饲料、造纸、纺织、印染、洗涤以及石油开采等工业领域。例如利用甘露聚糖酶处理魔芋粉，生产低聚甘露糖，大大提高了魔芋粉的附加值，这种低聚甘露糖是一种功效显著的双歧因，具有减少有毒代谢产物的产生、抑制病原菌的生长、保护肝脏、提高免疫力的生理机能。在饲料添加剂方面，甘露聚糖酶可以提高动物对饲料的能量利用率，有效阻断细菌和寄生虫对肠道的侵害、提高动物的体重。
甘露聚糖酶广泛存在于植物和微生物中，特别是许多真菌和细菌均分泌甘露聚糖酶。工业中应用的甘露聚糖酶大多产自Trichederma和Apergiuvs两个属的真菌。这些真菌产生的甘露聚糖酶在酸性条件下活性最大(pH 3-5.5)，最适湿度在40-50℃，往往不耐70℃以上的高温。但在许多工业应用(例如饲料)，经常要求酶能够耐受一定的高温(70℃以上)，因此需要寻找一些适应更广泛生理条件的甘露聚糖酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，为如下(a)或(b)：
(a)序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)序列表中序列1自N末端第2至605位氨基酸残基组成的蛋白质。
为了所述蛋白质便于纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列2自5’末端起第4至1815位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体可为如下(I)或(II)或(III)：
(I)在pUC18载体的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体；
(II)在质粒pDG148的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体；
(III)在质粒pDG148的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组表达载体；所述特异DNA片段中，由序列表的序列5所示的p43启动子启动融合蛋白编码基因的表达；所述融合蛋白编码基因自5’末端至3’末端方向依次包括序列表的序列6自5’末端第7至167位核苷酸所示DNA的反义DNA和编码序列表的序列1所示蛋白质的基因。
重组质粒pBS4302的构建方法如下：(1)将序列表的序列5所示DNA的5’末端融合CTCGAG后，取代质粒pDG148的EcoR V酶切位点之间的小片段，得到重组质粒pDG148-p43；(2)合成序列表的序列6所示的双链DNA并用用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切，回收酶切产物；(3)用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切重组质粒pDG148-p43，回收载体骨架；(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pBS4302。
所述重组表达载体具体可为在重组质粒pBS4302的Hind III和Xba I酶切位点之间插入序列表的序列2第4至1815位核苷酸所示的DNA得到的重组质粒。
所述重组菌具体可为如下(IV)或(V)：
(IV)将(I)所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌；
(V)将(II)或(III)所述重组表达载体导入枯草芽孢杆菌得到的重组菌。
所述大肠杆菌具体可为MC13菌株。
所述枯草芽孢杆菌具体可为168菌株。
本发明还保护一种制备β-甘露聚糖酶的方法，是培养所述重组菌，得到β-甘露聚糖酶。
所述方法可为方法甲或方法乙。
所述方法甲包括如下步骤：
(1)将重组菌接种于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6，作为种子液；
(2)将1体积份所述种子液接种至10体积份含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养24小时，然后4℃、12000g离心10分钟，收集菌体沉淀；
(3)将所述菌体沉淀用pH7.4 0.1M的PBS缓冲液重悬，超声破碎细胞(80HZ，每次30秒，重复4次)，4℃、12000g离心10分钟，收集上清液，即为含有β-甘露聚糖酶的溶液。
所述方法乙包括如下步骤：
(1)将重组菌接种于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6，作为种子液；
(2)将1体积份种子液接种至10体积份含10μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养48小时，然后4℃、12000g离心10分钟，收集上清液，即为含有β-甘露聚糖酶的溶液。
所述方法乙还包括如下步骤：将步骤(2)得到的所述上清液用镍离子柱进行纯化，先用溶液I(溶剂为pH＝8.0、20mM的Tris缓冲液，溶质及其浓度如下：20mM咪唑，300mM NaCl)洗柱，再用溶液II(溶剂为pH＝8.0、20mM的Tris缓冲液，溶质及其浓度如下：250mM咪唑，300mM NaCl)洗脱，收集过柱后的洗脱液，依次进行透析和冻干，得到所述蛋白质。
以上任一所述方法制备得到的β-甘露聚糖酶也属于本发明的保护范围。
所述蛋白质可作为β-甘露聚糖酶。将所述蛋白质作为β-甘露聚糖酶应用时，反应条件可为：pH5-9，37-65℃。
本发明提供的蛋白具有β-甘露聚糖酶活性，且适用范围广，在37-65℃和pH5-9都有较高的活性。本发明提供的重组菌能高效表达所述蛋白，并将蛋白分泌到胞外，使得蛋白的纯化变得简单和经济。本发明提供的蛋白可以作为饲料添加剂。本发明对于工业生产和动物养殖具有重大的应用前景。
附图说明
图1为重组质粒pBS4302MAN的结构示意图。
图2为ZLP蛋白的SDS凝胶电泳图。
图3为ZLP蛋白作为甘露聚糖酶的pH范围。
图4为ZLP蛋白作为甘露聚糖酶的温度范围。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NRS 231菌株：ATCC编号为6633；南京便诊生物科技有限公司，货号BGWW23209。大肠杆菌MC13菌株：中国兽医药品监察所，编号为C83916。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株(又称枯草杆菌BS168)：谢海伟，文冰，王娣，钱时权，杨贤松，许晖.海洋生物抗菌肽在枯草杆菌BS168中的高效表达[J].海洋科学，2011，(03)。
芽孢杆菌Gx02菌株：参考文献：秦燕，宁正祥，胡新宇.β-半乳糖苷酶的应用研究进展[J].沈阳农业大学学报，2000，(06)。
质粒pDG148：参考文献：Josoph.R.等2001.MS Micyobiol letters 205：91-97。
实施例1、甘露聚糖酶及其编码基因的发现
1、将芽孢杆菌(Bacillus sp.)Gx02菌株接种于20毫升LB液体培养基(含100μg/ml的氨苄青霉素)，37℃、150rpm振荡培养过夜。
2、离心收集菌体，用染色体DNA分离柱(Sigma公司产品)分离纯化染色体DNA。
3、用纯化的DNA构建DNA表达文库(方法参照Mendozn，N，S等1995 Biachimira etBiophysica Acca 1243：552-554)。具体步骤为：2μg纯化的染色体DNA与1μl限制内切酶Sau 3AI(NEB公司产品)混合，水浴37℃，保温1小时，然后与1μg被限制内切酶BamHI(NEB公司产品)酶切后的pUC18载体混合，加入5个单位的T4 DNA连接酶，水浴保温2小时，得到连接混合液。
4、将20μl连接混合液被与大肠杆菌DH5a的感受态细胞混合，涂布于含有0.07％锥虫蓝、0.5％魔芋粉和100μ/ml氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养24小时。从大约10万个转化子，发现其中一个转化子具有明显的水解圈，挑取单菌落进一步分析。限制内切酶分析表明，该菌落含有的重组质粒中具有一个2.5kb的插入片段。
5、将重组质粒进行扩大培养和纯化，然后使用自动DNA测序仪(ApplliedBiosystems)进行测序。其中含有一个全长开放阅读框(Open Reading Frame)。
6、将序列表的序列1所示蛋白命名为ZLP蛋白(由605个氨基酸残基组成，估计分子量为67kDa)。将编码ZLP蛋白的基因命名为ZLP基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示(由1815个核苷酸组成)。
实施例2、ZLP基因在大肠杆菌中的表达
一、重组质粒的构建
1、提取芽孢杆菌Gx02菌株的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用F1(下划线标注BamH I识别序列)和R1(斜体为终止密码子，下划线标注EcoR I识别序列)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-ggatccaatggtcagtaaagtactgctgg-3’；
R1：5’-GAATTC TGGATTGATACTACCTATAAAGCTTGGGAGC-3’。
3、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切pUC18载体(购自北京华夏远洋科技有限公司，货号SD1162)，回收载体骨架(约2680bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲(又称重组质粒pUCMAN)。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在pUC18载体的BamHI和EcoR I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。
二、对照质粒的构建
1、合成序列表的序列4所示的双链DNA(对照基因)。
2、以步骤1合成的双链DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切pUC18载体，回收载体骨架(约2680bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在pUC18载体的BamH I和EcoR I酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的DNA分子(编码序列表的序列3所示的对照蛋白)。
三、重组菌的构建
1、将重组质粒甲转化大肠杆菌MC13菌株，得到重组菌甲。
2、将重组质粒乙转化大肠杆菌MC13菌株，得到重组菌乙。
四、ZLP基因及其对照基因在大肠杆菌中的表达
将重组菌甲和重组菌乙分别进行如下实验：
1、将重组菌接种于5ml LB培养基中，37℃培养过夜，使其OD600＝0.6，作为种子液。
2、将50ml种子液接种至500ml LB液体培养基(含100μg/ml的氨苄青霉素)，37℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养24小时，然后4℃、12000g离心10分钟，收集菌体沉淀。
3、将菌体用PBS缓冲液清洗一次后，用10ml PBS缓冲液(pH7.4、0.1M)重悬，超声破碎细胞(80HZ，每次30秒，重复4次)，4℃、12000g离心10分钟，收集上清液。
重组菌甲进行上述实验得到的上清液即为粗酶液。重组菌乙进行上述实验得到的上清液即为对照液。
五、甘露聚糖酶的活性检测(参照Akino等1982.J.Bicchem.41：1181-1186)
魔芋胶：购自陕西盛德生物科技有限公司。刺槐豆胶：购自陕西盛德生物科技有限公司。瓜尔胶粉：购自武汉银河江汉化工有限公司，货号9000-30-0。
1、将底物(魔芋胶、刺槐豆胶或瓜尔胶粉)悬浮于磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0、0.1M)中，使底物的质量百分含量为0.5％，100℃孵育1小时，即为底物溶液，冷却到室温待用。
2、将50μl粗酶液(或对照液)加入950μl底物溶液中，50℃水浴反应10分钟，用DNS法(以甘露糖作为标准品)测定产生的还原糖数量(Sernfield，P.1955.MethodsEneymol.1：149-158)。
酶活力的定义为：每分钟释放出1μmol相当于甘露糖的还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位。
粗酶液和对照液对三种底物的酶活力见表2。
表2 粗酶液和对照液对三种底物降解作用效果
| 底物 | 粗酶液的酶活力(IU/ml) | 对照液的酶活力(IU/ml) |
| 魔芋胶 | 1840 | 1503 |
| 瓜尔胶 | 1733 | 1603 |
| 刺槐豆胶 | 3067 | 2845 |
结果表明，ZLP蛋白是一种活性较高的甘露聚糖酶，而且它对葡萄甘露聚糖(魔芋胶)和半乳甘露聚糖(瓜尔胶和刺槐豆胶)都有很高的分解作用。
实施例3、ZLP基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的表达
一、重组质粒pBS4302的构建
1、提取枯草芽孢杆菌NRS 231菌株的基因组DNA。
2、以步骤1的基因组DNA为模板，用p43-For(下划线标记EcoR V酶切识别序列)和p43-Rev(下划线标记EcoR V酶切识别序列和XhoI酶切识别序列)组成的引物对(靶序列为序列表的序列5所示的p43启动子)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
p43-For：5’-ttgatatcagcttcgtgc atgcaggccggggcatatgggaaacagcg-3’；
p43-Rev：5’-TGATATCCTCGAGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGC-3’。
3、将步骤2的PCR扩增产物和质粒pGEM-T(Promege公司产品)连接，得到重组质粒pGEM-p43。
4、用限制性内切酶EcoR V酶切重组质粒pGEM-p43，回收约440bp的DNA片段。
5、用限制性内切酶EcoR V酶切质粒pDG148，回收载体骨架(约7200bp)。
6、将步骤4的DNA片段和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pDG148-p43。
7、合成序列表的序列6所示的双链DNA(自5’末端第1至6位核苷酸为Kpn I酶切识别序列、第33至119位核苷酸编码编码SacB基因的信号肽、第147至164位核苷酸编码组氨酸标记片段、第168至173位核苷酸为Xho I酶切识别序列)。
8、用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切步骤7的双链DNA，回收酶切产物。
9、用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切重组质粒pDG148-p43，回收载体骨架(约7600bp)。
10、将步骤8的酶切产物和步骤9的载体骨架连接，得到重组质粒pBS4302。根据测序结果，对重组质粒pBS4302进行结构描述如下：将质粒pDG148中的EcoR V酶切位点间的小片段(质粒pDG148具有两个EcoRV酶切位点，且位于原启动子的两端)取代为了序列表的序列2所示的p43启动子(在枯草芽孢杆菌持续表达的启动子)，并在启动子的下游和质粒pDG148的Kpn I酶切位点之间插入了序列表的序列6自5’末端第7至167位核苷酸所示DNA的反义DNA，所述反义DNA与所述启动子之间以限制性内切酶Xho I的识别序列连接。重组质粒pBS4302含有如下筛选标记：卡那霉素表抗性基因(Kanamycin adenyltransberase)，可在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达，提供对卡霉素的抗性；氨苄青霉素抗性基因(β-lactamase)，仅在大肠杆菌中起作用；博来霉素抗性基因(Bleomycin resistance protein)，可提供对博来霉素的抗性。
二、重组质粒丙的构建
1、提取芽孢杆菌Gx02菌株的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用F2(下划线标注Hind III识别序列)和R2(斜体为终止密码子，下划线标注Xba I识别序列)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-aagcttgtcagtaaagtactgctggatgccggcagc-3’；
R2：5’-TCTAGA 
TGGATTGATACTACCTATAAAGCTTGGGAGC-3’。
3、用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切重组质粒pBS4302，回收载体骨架(约7600bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒丙(又称重组质粒pBS4302MAN)。根据测序结果，对重组质粒丙进行结构描述如下：在重组质粒pBS4302的Hind III和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列2第4至1815位核苷酸所示的DNA。重组质粒pBS4302MAN的结构示意图见图1。
三、重组质粒丁的构建
1、合成序列表的序列4所示的双链DNA(对照基因)。
2、以步骤1合成的双链DNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切重组质粒pBS4302，回收载体骨架(约7600bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒丁。根据测序结果，对重组质粒丁进行结构描述如下：在重组质粒pBS4302的Hind III和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列4第4至1818位核苷酸所示的DNA(编码序列表的序列3所示的对照蛋白)。
四、重组菌的构建
1、将重组质粒丙转化枯草芽孢杆菌168菌株，得到重组菌丙。
2、将重组质粒丁转化枯草芽孢杆菌168菌株，得到重组菌丁。
五、ZLP基因在枯草芽孢杆菌中的表达
将重组菌丙和重组菌乙丁分别进行如下实验：
1、将重组菌接种于5ml LB培养基中，37℃培养过夜，使其OD600＝0.6，作为种子液。
2、将50ml种子液接种至500ml LB培养基(含10μg/ml的卡那霉素)，37℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养48小时，4℃、12000g离心10分钟，收集上清液。
3、将步骤2的上清液用镍离子柱(1ml，Qiagen公司产品)进行纯化，先用10mL溶液I(溶剂为pH＝8.0、20mM的Tris缓冲液，溶质及其浓度如下：20mM咪唑，300mMNaCl)洗柱，再用2mL溶液II(溶剂为pH＝8.0、20mM的Tris缓冲液，溶质及其浓度如下：250mM咪唑，300mM NaCl)洗脱ZLP蛋白，收集过柱后的洗脱液。
4、将过柱后的洗脱液依次进行透析和冻干。
重组菌丙进行上述实验得到的干粉即为ZLP蛋白。重组菌丁进行上述实验得到的干粉即为对照蛋白。
SDS凝胶电泳图见图2(1为蛋白质分子量标记，2为重组菌丙步骤2的上清液，3为ZLP蛋白)。可以观察到蛋白的分子量约是67000Da，与预期分子量一致。
六、ZLP蛋白的酶学性质
1、ZLP蛋白作为甘露聚糖酶的pH范围
(1)将瓜尔胶粉分别悬浮于不同缓冲液中，使其质量百分含量为0.5％，100℃孵育1小时，即为底物溶液，冷却到室温待用。分别采用如下缓冲液：pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(浓度均为0.1M)；pH9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(浓度为0.1M)。
(2)将0.1μg ZLP蛋白(或对照蛋白)加入1000μl底物溶液中，室温(22℃)保存2个小时，用DNS法(以甘露糖作为标准品)测定产生的还原糖数量(Sernfield，P.1955.Methods Eneymol.1：149-158)。
ZLP蛋白酶活力如下：1833U/μg(pH5.0)、2303U/μg(pH5.5)、2231U/μg(pH6.0)、2350U/μg(pH6.5)、2345U/μg(pH7.0)、1716U/μg(pH8.0)、1175U/μg(pH9.0)。
对照蛋白酶活力如下：645U/μg(pH5.0)、1283U/μg(pH5.5)、1554U/μg(pH6.0)、1600U/μg(pH6.5)、1590U/μg(pH7.0)、801U/μg(pH8.0)、481U/μg(pH9.0)。
在pH5-9的条件下，ZLP蛋白均可以水解瓜尔胶，最佳pH值是pH6.5。以最高酶活力(2350U/μg)为100％，计算各个pH下的相对酶活力(相对活性)，结果见图3。ZLP蛋白作为甘露聚糖酶在pH5-9的范围内仍有50％以上的酶活力，说明ZLP蛋白作为甘露聚糖酶能适应相当大范围的pH变化。
2、ZLP蛋白作为甘露聚糖酶的温度范围
(1)将瓜尔胶粉悬浮于磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0、0.1M)中，使底物的质量百分含量为0.5％，100℃孵育1小时，即为底物溶液，冷却到室温待用。
(2)将0.1μg ZLP蛋白(或对照蛋白)加入预热好的1000μl底物溶液中，采用不同的温度水浴反应10分钟(水浴温度与预热温度相同，分别采用以下温度：22℃、37℃、42℃、50℃、55℃、65℃或75℃)，用DNS法(以甘露糖作为标准品)测定产生的还原糖数量(Sernfield，P.1955.Methods Eneymol.1：149-158)。
ZLP蛋白酶活力如下：60U/μg(22℃)、867U/μg(37℃)、1248U/μg(42℃)、1733U/μg(50℃)、1698U/μg(55℃)、1213U/μg(65℃)、520U/μg(75℃)。
对照蛋白酶活力如下：0U/μg(22℃)、471U/μg(37℃)、810U/μg(42℃)、1570U/μg(50℃)、1600U/μg(55℃)、640U/μg(65℃)、80U/μg(75℃)。
在37℃-75℃的条件下，ZLP蛋白均可以水解瓜尔胶，最佳温度是50℃。以最高酶活力(1733U/μg)为100％，计算各个温度下的相对酶活力(相对活性)，结果见图4。75℃仍可保持30％左右的酶活力，在正常温度(37℃)下的酶活力可达50％以上。
以上结果表明，序列表的序列1所示的甘露聚糖酶有良好特性。
Claims (10)
1.一种蛋白质，为如下(a)或(b)：
(a)序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)序列表中序列1自N末端第2至605位氨基酸残基组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列2自5’末端起第4至1815位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为如下(I)或(II)或(III)：
(I)在pUC18载体的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体；
(II)在质粒pDG148的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体；
(III)在质粒pDG148的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组表达载体；所述特异DNA片段中，由序列表的序列5所示的p43启动子启动融合蛋白编码基因的表达；所述融合蛋白编码基因自5’末端至3’末端方向依次包括序列表的序列6自5’末端第7至167位核苷酸所示DNA的反义DNA和编码序列表的序列1所示蛋白质的基因。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为如下(IV)或(V)：
(IV)将(I)所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌；
(V)将(II)或(III)所述重组表达载体导入枯草芽孢杆菌得到的重组菌。
7.一种制备β-甘露聚糖酶的方法，是培养权利要求4或6所述重组菌，得到β-甘露聚糖酶。
8.权利要求7所述方法制备得到的β-甘露聚糖酶。
9.权利要求1所述蛋白作为β-甘露聚糖酶的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用中的反应条件为：pH5-9，37-65℃。
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