CN102533700A - β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用 - Google Patents

β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质为序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明提供的蛋白质具有β-甘露聚糖酶活性,且适用范围广,在37-65℃和pH5-9都有较高的活性。本发明提供的重组菌能高效表达序列1所示的蛋白质,并将蛋白质分泌到胞外,使得蛋白的纯化变得简单和经济。本发明提供的蛋白质可以作为饲料添加剂。本发明对于工业生产和动物养殖具有重大的应用前景。

Description

β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用。
背景技术
β-甘露聚糖酶(EC3.3.1.78)是一类能够水解甘露聚糖,葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的内切酶。它以内切的方式降解β-1,4糖苷键,降解产物的非还原末端为甘露糖。
甘露聚糖是一种半纤维素的主要成分,在植物中广泛存在。半乳甘露聚糖是大量存在于植物种子中的半纤维素。例如,我国西南地区大量种植的魔芋的主要成份为葡萄甘聚糖,我国饲料中大量应用的玉米和大豆也含有大量的甘露聚糖(占非淀粉多糖的比例高达11.7%和22.7%)。畜禽和鱼类本身并不产生甘露聚糖酶,因此需添加外源的甘露聚糖酶帮助分解,以促进动物对饲料的能量利用率。
目前,甘露聚糖酶已广泛应用于医药、食品、饲料、造纸、纺织、印染、洗涤以及石油开采等工业领域。例如利用甘露聚糖酶处理魔芋粉,生产低聚甘露糖,大大提高了魔芋粉的附加值,这种低聚甘露糖是一种功效显著的双歧因,具有减少有毒代谢产物的产生、抑制病原菌的生长、保护肝脏、提高免疫力的生理机能。在饲料添加剂方面,甘露聚糖酶可以提高动物对饲料的能量利用率,有效阻断细菌和寄生虫对肠道的侵害、提高动物的体重。
甘露聚糖酶广泛存在于植物和微生物中,特别是许多真菌和细菌均分泌甘露聚糖酶。工业中应用的甘露聚糖酶大多产自Trichederma和Apergiuvs两个属的真菌。这些真菌产生的甘露聚糖酶在酸性条件下活性最大(pH 3-5.5),最适湿度在40-50℃,往往不耐70℃以上的高温。但在许多工业应用(例如饲料),经常要求酶能够耐受一定的高温(70℃以上),因此需要寻找一些适应更广泛生理条件的甘露聚糖酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质,为如下(a)或(b):
(a)序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)序列表中序列1自N末端第2至605位氨基酸残基组成的蛋白质。
为了所述蛋白质便于纯化,可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
  标签   残基   序列
  Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR
  Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH
  FLAG   8   DYKDDDDK
  Strep-tag II   8   WSHPQFEK
  c-myc   10   EQKLISEEDL
所述蛋白质可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。
编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下1)-4)中任一所述的DNA分子:
1)序列表中序列2自5’末端起第4至1815位核苷酸所示的DNA分子;
2)序列表中序列2所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子;
4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1%SDS的溶液中,65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体可为如下(I)或(II)或(III):
(I)在pUC18载体的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体;
(II)在质粒pDG148的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体;
(III)在质粒pDG148的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组表达载体;所述特异DNA片段中,由序列表的序列5所示的p43启动子启动融合蛋白编码基因的表达;所述融合蛋白编码基因自5’末端至3’末端方向依次包括序列表的序列6自5’末端第7至167位核苷酸所示DNA的反义DNA和编码序列表的序列1所示蛋白质的基因。
重组质粒pBS4302的构建方法如下:(1)将序列表的序列5所示DNA的5’末端融合CTCGAG后,取代质粒pDG148的EcoR V酶切位点之间的小片段,得到重组质粒pDG148-p43;(2)合成序列表的序列6所示的双链DNA并用用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切,回收酶切产物;(3)用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切重组质粒pDG148-p43,回收载体骨架;(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接,得到重组质粒pBS4302。
所述重组表达载体具体可为在重组质粒pBS4302的Hind III和Xba I酶切位点之间插入序列表的序列2第4至1815位核苷酸所示的DNA得到的重组质粒。
所述重组菌具体可为如下(IV)或(V):
(IV)将(I)所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌;
(V)将(II)或(III)所述重组表达载体导入枯草芽孢杆菌得到的重组菌。
所述大肠杆菌具体可为MC13菌株。
所述枯草芽孢杆菌具体可为168菌株。
本发明还保护一种制备β-甘露聚糖酶的方法,是培养所述重组菌,得到β-甘露聚糖酶。
所述方法可为方法甲或方法乙。
所述方法甲包括如下步骤:
(1)将重组菌接种于LB培养基中,37℃培养至OD600=0.6,作为种子液;
(2)将1体积份所述种子液接种至10体积份含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养24小时,然后4℃、12000g离心10分钟,收集菌体沉淀;
(3)将所述菌体沉淀用pH7.4 0.1M的PBS缓冲液重悬,超声破碎细胞(80HZ,每次30秒,重复4次),4℃、12000g离心10分钟,收集上清液,即为含有β-甘露聚糖酶的溶液。
所述方法乙包括如下步骤:
(1)将重组菌接种于LB培养基中,37℃培养至OD600=0.6,作为种子液;
(2)将1体积份种子液接种至10体积份含10μg/ml卡那霉素的LB液体培养基,37℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养48小时,然后4℃、12000g离心10分钟,收集上清液,即为含有β-甘露聚糖酶的溶液。
所述方法乙还包括如下步骤:将步骤(2)得到的所述上清液用镍离子柱进行纯化,先用溶液I(溶剂为pH=8.0、20mM的Tris缓冲液,溶质及其浓度如下:20mM咪唑,300mM NaCl)洗柱,再用溶液II(溶剂为pH=8.0、20mM的Tris缓冲液,溶质及其浓度如下:250mM咪唑,300mM NaCl)洗脱,收集过柱后的洗脱液,依次进行透析和冻干,得到所述蛋白质。
以上任一所述方法制备得到的β-甘露聚糖酶也属于本发明的保护范围。
所述蛋白质可作为β-甘露聚糖酶。将所述蛋白质作为β-甘露聚糖酶应用时,反应条件可为:pH5-9,37-65℃。
本发明提供的蛋白具有β-甘露聚糖酶活性,且适用范围广,在37-65℃和pH5-9都有较高的活性。本发明提供的重组菌能高效表达所述蛋白,并将蛋白分泌到胞外,使得蛋白的纯化变得简单和经济。本发明提供的蛋白可以作为饲料添加剂。本发明对于工业生产和动物养殖具有重大的应用前景。
附图说明
图1为重组质粒pBS4302MAN的结构示意图。
图2为ZLP蛋白的SDS凝胶电泳图。
图3为ZLP蛋白作为甘露聚糖酶的pH范围。
图4为ZLP蛋白作为甘露聚糖酶的温度范围。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NRS 231菌株:ATCC编号为6633;南京便诊生物科技有限公司,货号BGWW23209。大肠杆菌MC13菌株:中国兽医药品监察所,编号为C83916。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株(又称枯草杆菌BS168):谢海伟,文冰,王娣,钱时权,杨贤松,许晖.海洋生物抗菌肽在枯草杆菌BS168中的高效表达[J].海洋科学,2011,(03)。
芽孢杆菌Gx02菌株:参考文献:秦燕,宁正祥,胡新宇.β-半乳糖苷酶的应用研究进展[J].沈阳农业大学学报,2000,(06)。
质粒pDG148:参考文献:Josoph.R.等2001.MS Micyobiol letters 205:91-97。
实施例1、甘露聚糖酶及其编码基因的发现
1、将芽孢杆菌(Bacillus sp.)Gx02菌株接种于20毫升LB液体培养基(含100μg/ml的氨苄青霉素),37℃、150rpm振荡培养过夜。
2、离心收集菌体,用染色体DNA分离柱(Sigma公司产品)分离纯化染色体DNA。
3、用纯化的DNA构建DNA表达文库(方法参照Mendozn,N,S等1995 Biachimira etBiophysica Acca 1243:552-554)。具体步骤为:2μg纯化的染色体DNA与1μl限制内切酶Sau 3AI(NEB公司产品)混合,水浴37℃,保温1小时,然后与1μg被限制内切酶BamHI(NEB公司产品)酶切后的pUC18载体混合,加入5个单位的T4 DNA连接酶,水浴保温2小时,得到连接混合液。
4、将20μl连接混合液被与大肠杆菌DH5a的感受态细胞混合,涂布于含有0.07%锥虫蓝、0.5%魔芋粉和100μ/ml氨苄青霉素的LB固体培养板上,37℃培养24小时。从大约10万个转化子,发现其中一个转化子具有明显的水解圈,挑取单菌落进一步分析。限制内切酶分析表明,该菌落含有的重组质粒中具有一个2.5kb的插入片段。
5、将重组质粒进行扩大培养和纯化,然后使用自动DNA测序仪(ApplliedBiosystems)进行测序。其中含有一个全长开放阅读框(Open Reading Frame)。
6、将序列表的序列1所示蛋白命名为ZLP蛋白(由605个氨基酸残基组成,估计分子量为67kDa)。将编码ZLP蛋白的基因命名为ZLP基因,其开放阅读框如序列表的序列2所示(由1815个核苷酸组成)。
实施例2、ZLP基因在大肠杆菌中的表达
一、重组质粒的构建
1、提取芽孢杆菌Gx02菌株的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板,用F1(下划线标注BamH I识别序列)和R1(斜体为终止密码子,下划线标注EcoR I识别序列)组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
F1:5’-ggatccaatggtcagtaaagtactgctgg-3’;
R1:5’-GAATTC TGGATTGATACTACCTATAAAGCTTGGGAGC-3’。
3、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切pUC18载体(购自北京华夏远洋科技有限公司,货号SD1162),回收载体骨架(约2680bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒甲(又称重组质粒pUCMAN)。根据测序结果,对重组质粒甲进行结构描述如下:在pUC18载体的BamHI和EcoR I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。
二、对照质粒的构建
1、合成序列表的序列4所示的双链DNA(对照基因)。
2、以步骤1合成的双链DNA为模板,用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamH I和EcoR I双酶切pUC18载体,回收载体骨架(约2680bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒乙。根据测序结果,对重组质粒乙进行结构描述如下:在pUC18载体的BamH I和EcoR I酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的DNA分子(编码序列表的序列3所示的对照蛋白)。
三、重组菌的构建
1、将重组质粒甲转化大肠杆菌MC13菌株,得到重组菌甲。
2、将重组质粒乙转化大肠杆菌MC13菌株,得到重组菌乙。
四、ZLP基因及其对照基因在大肠杆菌中的表达
将重组菌甲和重组菌乙分别进行如下实验:
1、将重组菌接种于5ml LB培养基中,37℃培养过夜,使其OD600=0.6,作为种子液。
2、将50ml种子液接种至500ml LB液体培养基(含100μg/ml的氨苄青霉素),37℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养24小时,然后4℃、12000g离心10分钟,收集菌体沉淀。
3、将菌体用PBS缓冲液清洗一次后,用10ml PBS缓冲液(pH7.4、0.1M)重悬,超声破碎细胞(80HZ,每次30秒,重复4次),4℃、12000g离心10分钟,收集上清液。
重组菌甲进行上述实验得到的上清液即为粗酶液。重组菌乙进行上述实验得到的上清液即为对照液。
五、甘露聚糖酶的活性检测(参照Akino等1982.J.Bicchem.41:1181-1186)
魔芋胶:购自陕西盛德生物科技有限公司。刺槐豆胶:购自陕西盛德生物科技有限公司。瓜尔胶粉:购自武汉银河江汉化工有限公司,货号9000-30-0。
1、将底物(魔芋胶、刺槐豆胶或瓜尔胶粉)悬浮于磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0、0.1M)中,使底物的质量百分含量为0.5%,100℃孵育1小时,即为底物溶液,冷却到室温待用。
2、将50μl粗酶液(或对照液)加入950μl底物溶液中,50℃水浴反应10分钟,用DNS法(以甘露糖作为标准品)测定产生的还原糖数量(Sernfield,P.1955.MethodsEneymol.1:149-158)。
酶活力的定义为:每分钟释放出1μmol相当于甘露糖的还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位。
粗酶液和对照液对三种底物的酶活力见表2。
表2 粗酶液和对照液对三种底物降解作用效果
  底物   粗酶液的酶活力(IU/ml)   对照液的酶活力(IU/ml)
  魔芋胶   1840   1503
  瓜尔胶   1733   1603
  刺槐豆胶   3067   2845
结果表明,ZLP蛋白是一种活性较高的甘露聚糖酶,而且它对葡萄甘露聚糖(魔芋胶)和半乳甘露聚糖(瓜尔胶和刺槐豆胶)都有很高的分解作用。
实施例3、ZLP基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的表达
一、重组质粒pBS4302的构建
1、提取枯草芽孢杆菌NRS 231菌株的基因组DNA。
2、以步骤1的基因组DNA为模板,用p43-For(下划线标记EcoR V酶切识别序列)和p43-Rev(下划线标记EcoR V酶切识别序列和XhoI酶切识别序列)组成的引物对(靶序列为序列表的序列5所示的p43启动子)进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
p43-For:5’-ttgatatcagcttcgtgc atgcaggccggggcatatgggaaacagcg-3’;
p43-Rev:5’-TGATATCCTCGAGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGC-3’。
3、将步骤2的PCR扩增产物和质粒pGEM-T(Promege公司产品)连接,得到重组质粒pGEM-p43。
4、用限制性内切酶EcoR V酶切重组质粒pGEM-p43,回收约440bp的DNA片段。
5、用限制性内切酶EcoR V酶切质粒pDG148,回收载体骨架(约7200bp)。
6、将步骤4的DNA片段和步骤5的载体骨架连接,得到重组质粒pDG148-p43。
7、合成序列表的序列6所示的双链DNA(自5’末端第1至6位核苷酸为Kpn I酶切识别序列、第33至119位核苷酸编码编码SacB基因的信号肽、第147至164位核苷酸编码组氨酸标记片段、第168至173位核苷酸为Xho I酶切识别序列)。
8、用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切步骤7的双链DNA,回收酶切产物。
9、用限制性内切酶Kpn I和Xho I双酶切重组质粒pDG148-p43,回收载体骨架(约7600bp)。
10、将步骤8的酶切产物和步骤9的载体骨架连接,得到重组质粒pBS4302。根据测序结果,对重组质粒pBS4302进行结构描述如下:将质粒pDG148中的EcoR V酶切位点间的小片段(质粒pDG148具有两个EcoRV酶切位点,且位于原启动子的两端)取代为了序列表的序列2所示的p43启动子(在枯草芽孢杆菌持续表达的启动子),并在启动子的下游和质粒pDG148的Kpn I酶切位点之间插入了序列表的序列6自5’末端第7至167位核苷酸所示DNA的反义DNA,所述反义DNA与所述启动子之间以限制性内切酶Xho I的识别序列连接。重组质粒pBS4302含有如下筛选标记:卡那霉素表抗性基因(Kanamycin adenyltransberase),可在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达,提供对卡霉素的抗性;氨苄青霉素抗性基因(β-lactamase),仅在大肠杆菌中起作用;博来霉素抗性基因(Bleomycin resistance protein),可提供对博来霉素的抗性。
二、重组质粒丙的构建
1、提取芽孢杆菌Gx02菌株的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板,用F2(下划线标注Hind III识别序列)和R2(斜体为终止密码子,下划线标注Xba I识别序列)组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
F2:5’-aagcttgtcagtaaagtactgctggatgccggcagc-3’;
R2:5’-TCTAGA
Figure BDA0000128112260000071
TGGATTGATACTACCTATAAAGCTTGGGAGC-3’。
3、用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切重组质粒pBS4302,回收载体骨架(约7600bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒丙(又称重组质粒pBS4302MAN)。根据测序结果,对重组质粒丙进行结构描述如下:在重组质粒pBS4302的Hind III和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列2第4至1815位核苷酸所示的DNA。重组质粒pBS4302MAN的结构示意图见图1。
三、重组质粒丁的构建
1、合成序列表的序列4所示的双链DNA(对照基因)。
2、以步骤1合成的双链DNA为模板,用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切步骤2的PCR扩增产物,回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Hind III和Xba I酶切重组质粒pBS4302,回收载体骨架(约7600bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接,得到重组质粒丁。根据测序结果,对重组质粒丁进行结构描述如下:在重组质粒pBS4302的Hind III和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列4第4至1818位核苷酸所示的DNA(编码序列表的序列3所示的对照蛋白)。
四、重组菌的构建
1、将重组质粒丙转化枯草芽孢杆菌168菌株,得到重组菌丙。
2、将重组质粒丁转化枯草芽孢杆菌168菌株,得到重组菌丁。
五、ZLP基因在枯草芽孢杆菌中的表达
将重组菌丙和重组菌乙丁分别进行如下实验:
1、将重组菌接种于5ml LB培养基中,37℃培养过夜,使其OD600=0.6,作为种子液。
2、将50ml种子液接种至500ml LB培养基(含10μg/ml的卡那霉素),37℃、250rpm(旋转半径为13mm)培养48小时,4℃、12000g离心10分钟,收集上清液。
3、将步骤2的上清液用镍离子柱(1ml,Qiagen公司产品)进行纯化,先用10mL溶液I(溶剂为pH=8.0、20mM的Tris缓冲液,溶质及其浓度如下:20mM咪唑,300mMNaCl)洗柱,再用2mL溶液II(溶剂为pH=8.0、20mM的Tris缓冲液,溶质及其浓度如下:250mM咪唑,300mM NaCl)洗脱ZLP蛋白,收集过柱后的洗脱液。
4、将过柱后的洗脱液依次进行透析和冻干。
重组菌丙进行上述实验得到的干粉即为ZLP蛋白。重组菌丁进行上述实验得到的干粉即为对照蛋白。
SDS凝胶电泳图见图2(1为蛋白质分子量标记,2为重组菌丙步骤2的上清液,3为ZLP蛋白)。可以观察到蛋白的分子量约是67000Da,与预期分子量一致。
六、ZLP蛋白的酶学性质
1、ZLP蛋白作为甘露聚糖酶的pH范围
(1)将瓜尔胶粉分别悬浮于不同缓冲液中,使其质量百分含量为0.5%,100℃孵育1小时,即为底物溶液,冷却到室温待用。分别采用如下缓冲液:pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(浓度均为0.1M);pH9.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(浓度为0.1M)。
(2)将0.1μg ZLP蛋白(或对照蛋白)加入1000μl底物溶液中,室温(22℃)保存2个小时,用DNS法(以甘露糖作为标准品)测定产生的还原糖数量(Sernfield,P.1955.Methods Eneymol.1:149-158)。
ZLP蛋白酶活力如下:1833U/μg(pH5.0)、2303U/μg(pH5.5)、2231U/μg(pH6.0)、2350U/μg(pH6.5)、2345U/μg(pH7.0)、1716U/μg(pH8.0)、1175U/μg(pH9.0)。
对照蛋白酶活力如下:645U/μg(pH5.0)、1283U/μg(pH5.5)、1554U/μg(pH6.0)、1600U/μg(pH6.5)、1590U/μg(pH7.0)、801U/μg(pH8.0)、481U/μg(pH9.0)。
在pH5-9的条件下,ZLP蛋白均可以水解瓜尔胶,最佳pH值是pH6.5。以最高酶活力(2350U/μg)为100%,计算各个pH下的相对酶活力(相对活性),结果见图3。ZLP蛋白作为甘露聚糖酶在pH5-9的范围内仍有50%以上的酶活力,说明ZLP蛋白作为甘露聚糖酶能适应相当大范围的pH变化。
2、ZLP蛋白作为甘露聚糖酶的温度范围
(1)将瓜尔胶粉悬浮于磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0、0.1M)中,使底物的质量百分含量为0.5%,100℃孵育1小时,即为底物溶液,冷却到室温待用。
(2)将0.1μg ZLP蛋白(或对照蛋白)加入预热好的1000μl底物溶液中,采用不同的温度水浴反应10分钟(水浴温度与预热温度相同,分别采用以下温度:22℃、37℃、42℃、50℃、55℃、65℃或75℃),用DNS法(以甘露糖作为标准品)测定产生的还原糖数量(Sernfield,P.1955.Methods Eneymol.1:149-158)。
ZLP蛋白酶活力如下:60U/μg(22℃)、867U/μg(37℃)、1248U/μg(42℃)、1733U/μg(50℃)、1698U/μg(55℃)、1213U/μg(65℃)、520U/μg(75℃)。
对照蛋白酶活力如下:0U/μg(22℃)、471U/μg(37℃)、810U/μg(42℃)、1570U/μg(50℃)、1600U/μg(55℃)、640U/μg(65℃)、80U/μg(75℃)。
在37℃-75℃的条件下,ZLP蛋白均可以水解瓜尔胶,最佳温度是50℃。以最高酶活力(1733U/μg)为100%,计算各个温度下的相对酶活力(相对活性),结果见图4。75℃仍可保持30%左右的酶活力,在正常温度(37℃)下的酶活力可达50%以上。
以上结果表明,序列表的序列1所示的甘露聚糖酶有良好特性。
Figure IDA0000128112340000011
Figure IDA0000128112340000021
Figure IDA0000128112340000031
Figure IDA0000128112340000051
Figure IDA0000128112340000061
Figure IDA0000128112340000071

Claims (10)

1.一种蛋白质,为如下(a)或(b):
(a)序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)序列表中序列1自N末端第2至605位氨基酸残基组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因,其特征在于:所述基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子:
1)序列表中序列2自5’末端起第4至1815位核苷酸所示的DNA分子;
2)序列表中序列2所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子;
4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体为如下(I)或(II)或(III):
(I)在pUC18载体的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体;
(II)在质粒pDG148的多克隆位点间插入所述基因得到的重组表达载体;
(III)在质粒pDG148的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组表达载体;所述特异DNA片段中,由序列表的序列5所示的p43启动子启动融合蛋白编码基因的表达;所述融合蛋白编码基因自5’末端至3’末端方向依次包括序列表的序列6自5’末端第7至167位核苷酸所示DNA的反义DNA和编码序列表的序列1所示蛋白质的基因。
6.根据权利要求4所述的重组菌,其特征在于:所述重组菌为如下(IV)或(V):
(IV)将(I)所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌;
(V)将(II)或(III)所述重组表达载体导入枯草芽孢杆菌得到的重组菌。
7.一种制备β-甘露聚糖酶的方法,是培养权利要求4或6所述重组菌,得到β-甘露聚糖酶。
8.权利要求7所述方法制备得到的β-甘露聚糖酶。
9.权利要求1所述蛋白作为β-甘露聚糖酶的应用。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于:所述应用中的反应条件为:pH5-9,37-65℃。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031913A (zh) * 2013-03-07 2014-09-10 华东理工大学 一种用于在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的表达设备
CN104789515A (zh) * 2015-04-20 2015-07-22 天津科技大学 可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用
CN107083374A (zh) * 2017-06-28 2017-08-22 青岛红樱桃生物技术有限公司 酶活性提高的β‑甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN107129958A (zh) * 2017-06-09 2017-09-05 华南理工大学 一种β‑甘露聚糖酶工程菌的筛选方法
CN110846296A (zh) * 2019-11-13 2020-02-28 三峡大学 枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1351169A (zh) * 2000-10-26 2002-05-29 中国科学院微生物研究所 一种β-甘露聚糖酶的基因序列及其编码的重组酶的制备
CN1904052A (zh) * 2005-07-26 2007-01-31 中国农业科学院饲料研究所 一种β-甘露糖酶及其编码基因和应用
CN101089185A (zh) * 2006-06-16 2007-12-19 罗科 一种新的β-甘露聚糖酶基因及其重组酶的生产方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1351169A (zh) * 2000-10-26 2002-05-29 中国科学院微生物研究所 一种β-甘露聚糖酶的基因序列及其编码的重组酶的制备
CN1904052A (zh) * 2005-07-26 2007-01-31 中国农业科学院饲料研究所 一种β-甘露糖酶及其编码基因和应用
CN101089185A (zh) * 2006-06-16 2007-12-19 罗科 一种新的β-甘露聚糖酶基因及其重组酶的生产方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031913A (zh) * 2013-03-07 2014-09-10 华东理工大学 一种用于在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的表达设备
CN104031913B (zh) * 2013-03-07 2018-01-05 华东理工大学 一种用于在枯草芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的表达设备
CN104789515A (zh) * 2015-04-20 2015-07-22 天津科技大学 可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用
CN104789515B (zh) * 2015-04-20 2019-02-12 天津科技大学 可调控芽孢生成的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用
CN107129958A (zh) * 2017-06-09 2017-09-05 华南理工大学 一种β‑甘露聚糖酶工程菌的筛选方法
CN107083374A (zh) * 2017-06-28 2017-08-22 青岛红樱桃生物技术有限公司 酶活性提高的β‑甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN107083374B (zh) * 2017-06-28 2019-11-26 青岛红樱桃生物技术有限公司 酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN110846296A (zh) * 2019-11-13 2020-02-28 三峡大学 枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达与应用

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