CN101089185A - 一种新的β-甘露聚糖酶基因及其重组酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种新的从芽胞杆菌(Bacillus sp.)克隆到的β－甘露聚糖酶基因及其编码的蛋白质序列。本发明也提供一种新的有效表达重组酶的方法。纯化的重组甘露聚糖酶可以有效分解多种甘露糖底物，比如魔芋胶，瓜尔胶和刺槐胶等。

Description

一种新的β-甘露聚糖酶基因及其重组酶的生产方法

                              技术领域

本发明涉及一种新的甘露聚糖酶基因及其重组酶的生产。进一步讲，它涉及一种从土壤芽胞杆菌(Bacillus sp.)分离的甘露聚糖酶基因，它编码的氨基酸序列及一种有效表达重组酶的载体。

                              背景技术

β-甘露聚糖酶(EC3.3.1.78)是一类能够水解甘露聚糖，葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的内切酶。它以内切的方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖。甘露聚糖是一种半纤维素的主要成分，在植物中广泛存在。其他大量存在于植物种子的半纤维素是半乳甘露聚糖。例如我国西南地区大量种植的魔芋其主要成份为葡甘聚糖。我国饲料中大量应用的玉米和大豆也含有大量的甘露聚糖，占非淀粉多糖的比例高达11.7％和22.7％。面畜禽和鱼类并不产生甘露聚糖酶，因此需添加外源的甘露聚糖酶帮助分解这些甘露聚糖。

目前，甘露聚糖酶已广泛应用于医药、食品、饲料、造纸、纺织、印染、洗涤以及石油开采等工业领域。例如利用甘露聚糖酶处理魔芋粉，生产低聚甘露糖，大大提高了魔芋粉的附加值。这种低聚甘露糖是一种功效显著的双歧因子。具有减少有毒代谢产物的产生、抑制病原菌的生长，保护肝脏，提高免疫力的生理机能。在饲料添加剂方面，甘露聚糖酶可以提高动物对饲料的能量利用率，能有效阻断细菌和寄生虫对肠道的侵害，提高动物的体重。目前已在世界范围内得到广泛应用。

甘露聚糖酶广泛存在于植物和微生物中，特别是许多真菌和细菌均分泌甘露聚糖酶。目前，不同的甘露聚糖酶基因从植物、真菌、霉曲菌和细菌中克隆出来。工业中应用的甘露聚糖酶大多产自Trichederma和Apergiuvs两个属的真菌。这些真菌产生的甘露聚糖酶在酸性条件下活性最大(pH 3-5.5)，最适湿度在40-50℃，往往不耐70℃以上的高温，但在许多工业应用(例如饲料)，经常要求酶能够耐受一定的高温(70℃以上)，因此需要寻找一些适应更广泛生理条件的甘露聚糖酶。

本发明提供一种新的甘露聚糖酶，此酶有宽的活性范围。活性温度范围(37-65℃)和pH值(5-9)都有较高的活性。

                       发明的目标和内容

本发明的主要目标是提供一种DNA序列，该DNA分子编码一种具有高甘露聚糖活性的蛋白质。这种DNA分子是从一种芽胞杆菌(Bacillus sp.)中克隆出来的。

本发明描述了克隆这种新甘露聚糖酶基因的方法，以及在大肠杆菌产生重组酶的方法。

本发明进一步公开了构建一种枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)表达载体，用于高效生产重组的甘露聚糖酶。

                              附图说明

图1是本发明描述的β-甘露聚糖酶核苷酸序列以及它编码的氨基酸序列。这个新的甘露聚糖酶基因全长为1818个核苷酸，它码编了一个全长为606个氨基酸的蛋白质。预计的蛋白质分子量为66.7KD与SDS凝胶电泳所获得的蛋白质分子量一致(见图3)。

图2描述了一种新构建的用于表达重组甘露聚糖酶载体的特征。质粒pBS4302MAN是从pDG148构建而来。质粒含有一个卡那霉素表抗性基因(Kanamycin adenyltransberase)，此基因可在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中表达，提供对卡霉素的抗性。质粒中的氨苄青霉素抗性基因(β-lactamase)仅在大肠杆菌中起作用。此外质粒还有一种愽来霉素抗性基因(Bleomycin resistance protein)，可提供对愽来霉素的抗性。本质粒有一种在枯草芽胞杆菌持续表达的启动子，P43，以期获得高效的甘露聚糖酶表达。

图3是SDS凝胶电泳图。表明在枯草芽胞杆菌表达的甘露聚糖酶和纯化的酶。1为标记蛋白质，2为枯草芽胞杆菌发酵上清液，3是从组氨酸柱纯化的甘露聚糖酶。

图4表明了纯化的甘露聚糖酶在不同的温度和pH值条件下对底物瓜尔胶的水解作用效果。在测试不同温度对纯化酶的影响时，0.1μg纯化的酶被混合于预热到37℃、42℃、50℃、55℃、65℃或者75℃的底物溶液中(pH值为6.0)，保温15℃，然后用DSN法测量甘露聚糖酶的活性。在测量pH值的影响时，0.1μg纯化的酶被混合不同pH值的溶液中，室温下(22℃)保存2个小时，然后用DNS法测酶的活性。

                              具体实施方式

菌株(Bacillus sp.Gx02)可以降解魔芋胶(Konjak gum)和刺槐胶(Guar gum)，说明此菌株可能有甘露聚糖酶基因。我们采用传统方法构建DNA表达文库，转化大肠杆菌之后，用锥虫蓝(Trypan blue)染色检查转化子。我们选到一个有甘露聚糖酶活性的克隆株，然后进一步分离纯化质粒，鉴定出一种新的甘露聚糖酶基因。这种新的基因被克隆到一种大肠杆菌表达载体，并在大肠杆菌中表达。酶活性测试表明，表达的蛋白质具有很高的甘露聚糖酶活性。

试验一：克隆甘露聚糖酶基因。

芽胞杆菌株Bacillus sp.Gx02被接种于20毫升LB液体培养基(酵母膏5克，蛋白胨10克，氯化钠10克)中，培养基预混有每毫升100微克的氨苄青霉素。37℃，150转振荡培养过夜。离心收集菌体，然后用染色体DNA分离柱(Sigma公司产品)分离纯化染色体DNA。纯化的DNA被用来构建一个DNA表达文库(方法参照Mendozn，N，S等1995Biachimira et Biophysica Acca 1243：552-554)。简短地说，2μg纯化的染色体DNA被混合1μl的限制内切酶Sau 3AI(NEB公司产品)，水浴37℃，保温1个小时，然后与1μg限制内切酶BamHI(NEB公司产品)处理过的表达质粒pUC18载体混合，增加5个单位的T4 DNA连接酶，水浴保温2小时，20μl按连接混合液被用来转化感受大肠杆菌DH5a，涂布于含有0.07％锥虫蓝、0.5％魔芋粉和100μ/ml氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养24小时。从大约10万个转化子，我们发现一个转化子具有明显的水解圈，菌落被选作进一步分析。限制内切酶分析表明，一重组的质粒含有一个2.5kb的插入片断。此质粒被命名为pUCMAN。

试验二：甘露聚糖酶基因的序列分析。

质粒pUCMAN被进一步放大的纯化。DNA被使用自动DNA测序仪(ApplliedBiosystems)进行测序。大约2.5kb的插入片断被全部进行了双链测序。DNA序列(图1)分析表明有一个全长开放阅读框(Open Reading Frame)，它编码一种新的甘露聚糖酶(图1)。这新的基因全长为1818个核苷酸，编码一个605氨基酸的蛋白质，估计分子重为66530Da，经序列相似性比较分析发现，新的甘露聚糖酶基因与已公布的其他甘露聚糖酶基因并没有显著相似性。蛋白质序列比较则发现，此种蛋白质与数种耐热细菌分泌的甘露聚糖酶有较高的相似度。与Dictyoglomus thermaphilum，Caldicellulosiruporsaccharclyticus和Rhodothermas marinus新产的甘露聚糖分别有52％，52％和50％的相似性。这些分析表明，新分离的基因编码一种新的甘露聚糖酶，并且可能具有耐热的特性。

试验三：检查大肠杆菌表达的重组甘露聚糖酶的活性。

为了进一步试实我们克隆的基因编码一种新的甘露聚糖酶，我们将质粒pUCMAN转化大肠杆菌MC13菌株。经过24小时培养后，我们选择一个转化子作进一步表达分析。该转化子被接种于5ml LB培养基中，37℃培养过夜。然后5ml的细菌培养液被接种500ml含有100μg/ml的LB培养基中。24小时培养之后，将细菌培养物高速离心分离菌体，收集的菌体被用PBS溶液(pH7.4)洗一次后，重新悬浮在10ml的PBS溶液中，用超声波破碎细胞。经过一次高速离心之后，上清液被用来检测甘露聚糖酶的活性。我们也使用pUC18载体来转化大肠杆菌，一个转化子培养分离，其上清液被用作对照。

甘露聚糖酶的活性检测的方法简述如下(具体方法参照Akino等1982.J.Bicchem.41：1181-1186)。不同的底物(0.5％魔芋胶，刺槐豆胶，瓜尔胶粉)被悬浮在50mol磷酸溶液中(pH6.0)中，加热到100℃，一个小时后冷却到室温待用。50μl细菌培养上清液被增加到950μl的底物溶液中，水浴反应10分钟，用DNA法测定产生的还原糖数量(Sernfield，P.1955.Methods Eneymol.1：149-158)。酶活力的定义为：在上述反应条件下，每分钟释放出1μmol相当于甘露糖的还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位。

表1摘要了表达的甘露聚糖酶在50℃条件下对三种底物水解作用效果：

表1表达的甘露聚糖酶对不同底物的水解作用

底物	酶的特异活性(U/ml)
		魔芋胶	1840
瓜尔胶	1733
		刺槐豆胶	3067

实验结果证实我们克隆的基因编码一种甘露聚糖酶。而且它对葡萄甘露聚糖(魔芋胶)和半乳甘露聚糖(瓜尔胶和刺槐豆胶)都有很高的分解作用。

试验四：构建枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)表达载体。

为了获得一种纯用于工业生产的重组酶表达载体，我们构建了一种新的重组酶表达载体。枯草芽胞杆菌是一种工业上广泛使用的菌种，它能有效分泌表达的外源蛋白到培养基中，使得纯化重组蛋白质变得简单和经济。而且产量也相当高(Chang，S.1987.MethodsEneymol.153：507-516)。我们使用一种B.subtilis表达载体pDG148(Josoph.R.等2001.MS Micyobiol letters 205：91-97)作为基础构建一种新的表达载体pBS1302(图2)，为了提高表达效率，启动子P13(Wang，P.等1984.J.Biol cheml 259：8619-8625)被用PCR方法从B.subtilis基因组中克隆出来，插入pDG148质粒中，简单地说，一对PCR引物：p43-For：ttgatatcaagcttgtgc atgcaggccggggcatatgggaaacagcg和p43-Rev：agatatcctcgagtvtagattcctctcttacctataatggtaccgctatcac被合成，和使用来放大p43启动子，放大的PCR片段被克隆进到质粒pGEM-T(Promege公司产品)。然后pGEMp43质粒被用一种内切酶EcoRV处理和连接到预先用同样内切酶处理过的pDG148上，这样原先pDG148中启动子就被p43取代了，然后我们进一步插入了一种SacB基因的信号多肽序列(Steinmetz，M.等1985.Mol.Gen.Genet.200：220-228)和一种小组氨酸标记片段进到pDG148中，构建了一种新的表达载体pBS4302(图2)。随后我们将克隆的甘露聚糖酶基因pBS4302插入载体中，构建了一个重组酶表达载体pBS4302MAN(图2)。

试验五：纯化和检测表达的甘露聚糖酶

质粒pBS4302MAN DNA被用来B.subtilis转化感受态细胞，我们采用PEG6000转化的方法(Puyef.A.等.1987.Fems Microbiol.lett.40：1-5)将外源DNA引入B.subtilis细胞中，转化子被接种于含有10μs/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养48小时，高速离心分离细胞，上清液被用于纯化表达的重组酶，将10ml的上清液通过一种1ml的镍离子柱(GE公司产品)，结合在柱上的重组酶被洗脱和进一步透析后，用SDS凝胶电泳进行分析。图三表明一种纯化的蛋白质，估计分子量约是67000Da，与克隆的酶分子量一致。

我们进一步用瓜尔胶作为底物检测了纯化蛋白质的特性。在不同pH(5-9)的条件下，纯化的酶可以水解瓜尔胶(图4)，最佳pH值是在pH6.5，但在pH5和9仍有50％以上的活性，这说明此酶能适应相当大范围的pH变化，在温度测试中，我们发现此酶的最适温度是在50℃和可以耐受一定的高温，75℃处理30℃后仍可保持30％左右的活性，在正常的温度下(37℃)酶的活性可达50％以上(图4)。

这些结果表明，这种新的甘露聚糖酶有良好特性，适合用于饲料添加剂。

Claims (5)

1、一种核苷酸序列及其编码的具有β-甘露聚糖酶活性的蛋白质序列(图1)

2、一种携带有第一项要求中描述的核苷酸序列的大肠杆菌(E.coli)表达质粒pUCMAN，以及用此质粒转化的大肠杆菌菌株。

3、一种携带有第一项要求中描述的核苷酸序列的重组表达载体(图2)。

4、一株带有第三项要求中重组载体的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)菌株。

5、使用第一项要求中的β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂。

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