CN102311944A

CN102311944A - 一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶及其基因

Info

Publication number: CN102311944A
Application number: CN201110326253A
Authority: CN
Inventors: 黄遵锡; 周峻沛; 高雅洁; 王凤; 唐湘华; 李俊俊; 许波; 潘璐
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2031-10-25
Also published as: CN102311944B

Abstract

本发明涉及一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjb13及其基因。来源于鞘氨醇单胞菌（Sphingobiumsp.）的甘露聚糖酶ManAjb13的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本发明提供了编码上述甘露聚糖酶的编码基因manAjb13，甘露聚糖酶基因manAjb13的重组载体和甘露聚糖酶基因manAjb13的重组菌株。本发明的甘露聚糖酶具有以下性质：最适pH6.5；最适温度为40℃，在10℃和20℃下分别具有~20%和~55%的酶活；在反应体系中加入2M的NaCl，仍然具有80%的酶活；经2M的NaCl（pH6.5）在37℃下处理60min，活力无损失；良好的蛋白酶抗性；较好的水解各种自然底物的能力。本发明的甘露聚糖酶ManAjb13可作为一种添加剂应用于水产饲料及食品行业中。

Description

一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶及其基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjb13及其基因。

背景技术

甘露聚糖是一种丰富的半纤维素，由吡喃甘露糖以β-1,4 糖苷键连接而成，广泛存在于高等植物中，如豆科植物的种子、魔芋的球茎、兰科植物的假鳞茎、称猴桃的茎叶中等。甘露聚糖的降解主要依靠内切甘露聚糖酶（β-mannanase；endo-1,4-β-D-mannanase，EC 3.2.1.78），降解产物为甘露糖或甘露寡糖。根据氨基酸序列同源性，内切甘露聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第5和26家族，其可来源于细菌、放线菌及真菌等（Finn et al., Nucleic Acids Res, 2008, 36: D281–D288.）。

内切甘露聚糖酶在饲料、食品、医药、纺织、造纸、石油开采等领域都具有应用价值。饲料中添加甘露聚糖酶，可显著降低甘露聚糖分子大小，从而改善饲料性能、消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用并提高免疫力（Dhawan and Kaur, Crit Rev Biotechnol, 2007, 27: 197–216.）。具有低温活性的内切甘露聚糖酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程。水产动物体温随水温或气温变化而变化，一般在10–20℃（Zhou et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 85: 323–333.）。因此，水产饲料中应用的内切甘露聚糖酶需要在此低温（10–20℃）环境下具有催化活性。另一方面，大多数水产动物消化道环境呈中性（如鲤科鱼类）并含中性内源蛋白酶，水产饲料中添加的外源内切甘露聚糖酶需在中性条件下具有催化活性，并对中性蛋白酶具有抗性。再一方面，海洋鱼类适于生长在高盐环境中（如石斑鱼最佳养殖盐度为25–33），饲用海洋鱼类的内切甘露聚糖酶需要具有耐盐性。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjb13。

本发明的再一目的是提供编码上述甘露聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述甘露聚糖酶ManAjb13可得自鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）。ManAjb13的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

甘露聚糖酶ManAjb13总共含396个氨基酸，其中N端38个氨基酸为其预测的信号肽序列“MIARRFSNLPESCGAIRSSFFCAIILLAGCGPLGRPNA”，成熟的甘露聚糖酶ManAjb13含358个氨基酸。

本发明通过PCR的方法分离克隆了甘露聚糖酶ManAjb13的编码基因manAjb13，其全长1191bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。该基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。经BLAST比对，该甘露聚糖酶基因manAjb13编码的氨基酸序列与GenBank中Rhodothermus marinus SG0.5JP17-172来源的潜在甘露聚糖酶（AEN72408）具有最高的一致性，为56.2%；与确证活性的Cellvibrio Japonicus来源甘露聚糖酶Cjman26c（2VX4_A）的一致性为44.4%。

本发明还提供了包含上述甘露聚糖酶基因manAjb13的重组载体，优选为pET-manAjb13。将本发明的甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pET-28a（+）上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-manAjb13。

本发明还提供了包含上述甘露聚糖酶基因manAjb13的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/manAjb13。

本发明制备甘露聚糖酶ManAjb13的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；

3）回收并纯化所表达的甘露聚糖酶ManAjb13。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21（DE3），得到重组菌株BL21(DE3)/manAjb13。

本发明的甘露聚糖酶ManAjb13的最适pH值为6.5；最适温度为40℃，在10℃和20℃下分别具有~20%和~55%的酶活；在反应体系中加入2M的NaCl，仍然具有80%的酶活；经2M的NaCl（pH6.5）在37℃下处理60min，活力无损失；经胰蛋白酶和蛋白酶K在37℃处理1h后，仍能分别保持106.9%和98.4%的酶活；可水解木薯粉、玉米粉、麸皮和豆粕。以上性质表明甘露聚糖酶ManAjb13可作为一种添加剂应用于水产饲料和食品行业。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组甘露聚糖酶。

图2：重组甘露聚糖酶的最适pH。

图3：重组甘露聚糖酶的pH稳定性。

图4：重组甘露聚糖酶的最适温度。

图5：重组甘露聚糖酶的热稳定性。

图6：NaCl对重组甘露聚糖酶酶活性的影响。

图7：重组甘露聚糖酶在NaCl中的稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC 01037；大肠杆菌表达载体pET-28a（+）及菌株Escherichia coli BL21（DE3）购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；角豆胶和甘露糖购自Sigma公司；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：鞘氨醇单胞菌甘露聚糖酶基因manAjb13的克隆

提取鞘氨醇单胞菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据糖苷水解酶第26家族的保守氨基酸序列（[N/T/E]-G-[E/G]-W-[F/Y]-W-W-G和Y-P-[G/V]-[D/A]-[E/NS]-Y-V-D）设计合成了简并引物GH26F和GH26R（表1）。

表1. 甘露聚糖酶基因manAjb13的克隆与表达引物

引物名称	引物序列（5'---3'）	引物长度（bp）
			GH26F	ATCGGWGRNTGGTWYTGGT	19
GH26R	TCTACATAAAYRNCNMCNGG	20
			usp1	GAATAAGCGTAGAGCAGGTTGTGG	24
usp2	CGACCGTCATCCGCCACAA	19
			usp3	CCACGCACGCAACTTGTCAGC	21
usp4	CCCTTGCCAGAGGCGAAGAT	20
			dsp1	ATGGCGTCCACAACCTGCTC	20
dsp2	TGTTCGATACGCCCGAGGAC	20
			manAjb13EXF	CCGGAATTCGCATCGCCGCCCGTCGCGCCTG	31
manAjb13EXR	CCGCTCGAGTCGCTGCCGAGCATAGAGATCG	31

以鞘氨醇单胞菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，44℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。得到一约185bp片段，将该片段回收后与pMD 18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计热不对称交错PCR（简称TAIL-PCR）上游特异性引物4条，并将它们分别命名为usp1、usp2、usp3、usp4；另设计下游特异性引物2条，并将它们分别命名为dsp1、dsp2（表1）。特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp4的位置设计在sp3的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度为19–24nt，引物退火温度为57℃。通过TAIL-PCR得到已知基因序列片段的侧翼序列，扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到甘露聚糖酶基因manAjb13，该基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。

实施例2：重组甘露聚糖酶ManAjb13的制备

以manAjb13EXF和manAjb13EXR为引物对（表1），鞘氨醇单胞菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到甘露聚糖酶的基因manAjb13，并在该基因5’和3’端分别引入了EcoRI和XhoI酶切位点。将编码甘露聚糖酶的基因manAjb13进行双酶切（EcoRI和XhoI），同时将表达载体pET-28a（+）进行双酶切（EcoRI和XhoI），将上述酶切的甘露聚糖酶基因manAjb13与表达载体pET-28a（+）相连接，获得含有甘露聚糖酶基因manAjb13的重组质粒pET-manAjb13并转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/manAjb13。

取含有重组质粒pET-manAjb13的E. coli BL21（DE3）菌株和只含有pET-28a（+）空质粒的E. coli BL21（DE3）菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50µg/mL Kan）培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50µg/mL Kan）培养液中，快速振荡培养约2–3h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-Hcl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组甘露聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3：纯化的重组甘露聚糖酶ManAjb13的性质测定

1、重组甘露聚糖酶ManAjb13的活性分析

实施例2纯化的重组甘露聚糖酶ManAjb13的活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸（DNS）法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5%（w/v）；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol甘露糖所需的酶量。

2、重组甘露聚糖酶ManAjb13的最适pH和pH稳定性的测定：

酶的最适pH测定：将甘露聚糖酶ManAjb13在37℃下和0.1M pH5.0–8.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于0.1M pH3.0–8.0的缓冲液中，在37℃下处理1h以上，然后在pH6.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为0.1M McIlvaine buffer。以角豆胶为底物，反应10min，测定纯化的ManAjb13的酶学性质。结果表明：ManAjb13的最适pH为6.5（图2）；经pH4.0–8.0的缓冲液处理1h，酶活剩余~60%（图3）。

3、重组甘露聚糖酶ManAjb13的最适温度及热稳定性测定：

酶的最适温度测定：在pH6.5的缓冲液中，于0–60℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中（37℃，45℃或50℃）处理0–60min后，在pH6.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以角豆胶为底物，反应10min，测定纯化的ManAjb13的酶学性质。结果表明：ManAjb13的最适温度为40℃，在10℃和20℃下分别具有~20%和~55%的酶活（图4）；45℃下ManAjb13的半衰期~15min，50℃下很快失活（图5）。

4、重组甘露聚糖酶ManAjb13的动力学参数测定：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH6.5及40℃下，以0.5%角豆胶为底物，依次在酶促反应的1–30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.05–1.0%角豆胶为底物，在pH6.5、40℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定K _m、V _max和k _cat。经测定，在pH6.5及40℃下，ManAjb13对角豆胶的K _m、V _max和k _cat分别为5.00 mg⁻¹ ml⁻¹、277.78µmol min⁻¹ mg⁻¹和211.94 s⁻¹。

5、甘露聚糖酶ManAjb13的抗蛋白酶和抗盐性测定：

酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶10倍（w/w）的胰蛋白酶（pH7.0）和蛋白酶K（pH7.0）在37℃对重组酶处理1h，然后在pH6.5及37℃下进行酶促反应，底物为角豆胶。以在蛋白酶对应pH缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。经胰蛋白酶和蛋白酶K处理1h后，ManAjb13仍能分别保持106.9%和98.4%的酶活。NaCl对ManAjb13酶活性的影响：在酶促反应体系中加入0.01–2M的NaCl，在37℃、pH6.5条件下测定酶活性，以未加NaCl的酶液作为对照。酶在NaCl中的稳定性：将同样酶量的酶液置于1M或2M NaCl中（pH6.5）处理0–60min后，在pH6.5及37℃下进行酶促反应，底物为角豆胶。以未处理的酶液作为对照。结果表明：ManAjb13在0.01M的NaCl中酶活提高~10%，在2M的NaCl中酶活保持80%以上（图6）；经1M或2M NaCl处理0–60min后，ManAjb13的稳定性可提高10%以上（图7）。

6、甘露聚糖酶ManAjb13的底物特异性测定：

在37℃ pH6.5条件下，ManAjb13对0.5%（w/v）角豆胶的比活分别为119.92 U mg⁻¹，对2%（w/v）的麸皮、木薯粉、玉米粉、豆粕和棉粕的比活分别为0.06、0.02、0.01、0.01和0.01 U mg⁻¹。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南师范大学

<120> 一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjb13及其基因

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 367

<212> PRT

<213> 鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）

<400> 1

Met Arg Ser Ala Arg Leu Val Ile Ala Leu Phe Ala Ala Val Ala Leu

1 5 10 15

Ser Ala Pro Pro Ala Ser Ala Val Ser Ala Pro Pro Asp Val Ser Gly

20 25 30

His Lys Gln Thr Leu Arg Ser Ala Ala Pro Lys Gly Phe His Ile Gly

35 40 45

Thr Ala Val Ala Gly Gly Gly His His Glu Asn Gln Pro Tyr Pro Asp

50 55 60

Pro Phe Thr Ser Asp Ser Glu Tyr Arg Lys Val Leu Ala Ala Glu Phe

65 70 75 80

Asn Ser Val Ser Pro Glu Asn Gln Met Lys Trp Glu Tyr Ile His Pro

85 90 95

Glu Arg Gly Arg Tyr Asn Phe Gly Met Ala Asp Ala Ile Val Arg Phe

100 105 110

Ala Lys Gln Asn Arg Gln Val Val Arg Gly His Thr Leu Met Trp His

115 120 125

Ser Gln Asn Pro Glu Trp Leu Glu Gln Gly Asp Phe Thr Ala Ala Glu

130 135 140

Leu Arg Glu Ile Leu Arg Glu His Ile Met Thr Val Val Gly Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Gly Lys Val Gln Gln Trp Asp Val Ala Asn Glu Ile Phe Thr Asp

165 170 175

Ala Gly Ala Leu Arg Thr Thr Glu Asn Ile Trp Ile Arg Glu Leu Gly

180 185 190

Pro Gly Ile Val Ala Asp Ala Phe Arg Trp Ala His Gln Ala Asp Pro

195 200 205

Lys Ala Lys Leu Phe Phe Asn Asp Tyr Asn Val Glu Ser Val Asn Ala

210 215 220

Lys Ser Asp Ala Tyr Tyr Ala Leu Ile Lys Glu Leu Arg Ala Ala Gly

225 230 235 240

Val Pro Val His Gly Phe Ser Ala Gln Ala His Leu Ser Leu Asp Tyr

245 250 255

Gly Phe Pro Asp Asp Leu Glu Arg Asn Leu Lys Arg Phe Ala Asp Leu

260 265 270

Arg Leu Glu Thr Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val Arg Met Thr Leu Pro

275 280 285

Ala Ser Gly Val Pro Thr Ala Ala Gln Leu Gln Gln Gln Ala Asp Tyr

290 295 300

Tyr Gln Arg Thr Leu Ala Ala Cys Leu Lys Val Arg Thr Cys Lys Ser

305 310 315 320

Phe Thr Ile Trp Gly Phe Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro Val Phe

325 330 335

Phe Gln Gly Gln Gly Ala Ala Thr Val Met Trp Asn Asp Phe Gly Arg

340 345 350

Lys Gln Ala Tyr Tyr Ala Leu Arg Ser Thr Leu Ala Lys Arg Ala

355 360 365

<210> 2

<211> 1191

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）

<400> 2

atgattgcac gccggttcag taacctccct gagagctgcg gagcgatccg cagctcattt 60

ttttgcgcga ttatactgct tgcaggctgt gggccactcg gccgaccaaa cgcggcatcg 120

ccgcccgtcg cgcctgcacc aatcgatcgc ctcgctacgc gcgagacccg tgcgttgttc 180

gcgtcgctgc gcgcgctggc acctgctcat acgctgttcg ggcatcagga cgacctcgct 240

tatggctatg gctggaccgg cgacccgggg cggtccgacg tgaaatcggt cgccggcagt 300

tatccggcgg tttacggctg ggacgtcggt gatatcttcg cctctggcaa ggggccgctg 360

cgttatgatc cgcttcgggc tgacaagttg cgtgcgtgga tcctttcagg ctatcgccgc 420

ggcggcgtca tcacgatgag ttggcacatg ccaaacccgg ttgcgcattc cgatgcctgg 480

gatgtagcga cgccagcggt cgcgcggatc ctgccgggcg gtgatcacca tgccgccttt 540

ctcgccgatc tcgatatcgc tgcccgcttc ttccgcagcc tgcgcgcgcc cgacggcagt 600

ctcgtccccg tcatcttccg cccttggcat gaacagaccg gcgactggtt ctggtgggga 660

gcggcgcatt gcacggccga ccagttcaac gccttgtggc ggatgacggt cgctcgtctc 720

cgcgcggatg gcgtccacaa cctgctctac gcttattcga cggacgtgtt cgatacgccc 780

gaggactatc tcgcgcgcta tccgggagat gatgtcgtcg atatattggg cttcgacgat 840

taccatggca tcgcaagccg agcgaccttg cctcagtttg aacagcggat caggacggtc 900

gtgactttgg cgggcagccg cggcaagatc gcggcggtga ccgaaaccgg actggaagcg 960

attcccgacg cgatctggtg gaccgacatt ctcggtcgcg gccttgatga cgttcccggt 1020

gcggcatggg tgctggtgtg gcgaaacgcc aatcctgcca acgatcgcaa ggaacatttc 1080

ttcgcgccct atcccggaca gaagagcgcc gctgacttcg tgcagttcac gcgtgaccct 1140

cggatcctct tggaggacga actgcccgat ctctatgctc ggcagcgatg a 1191

Claims

1.一种具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjb13，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种编码权利要求1所述的具有低温活性和耐盐性的甘露聚糖酶ManAjb13的甘露聚糖酶基因manAjb13，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.一种包含权利要求4所述甘露聚糖酶基因manAjb13的重组载体。

4.一种包含权利要求4所述甘露聚糖酶基因manAjb13的重组菌株。