CN104152428B - 一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因 - Google Patents

一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因、重组载体和重组菌。本发明提供了一种来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)的甘露聚糖酶ManAGN25，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码所述甘露聚糖酶的编码基因manAGN25，甘露聚糖酶基因manAGN25的重组载体和甘露聚糖酶基因manAGN25的重组菌。本发明的甘露聚糖酶具有以下性质：最适pH为6.5–7.0；最适温度为35–40℃，在10℃和20℃下分别具有约15％和约45％的酶活；经0.1M pH5.0–8.0缓冲液在37℃下处理60min，仍能保持60％以上的活性；37℃时半衰期约为60min。本发明的甘露聚糖酶ManAGN25可应用于水产饲料及食品行业中。

Description

一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因、重组载体和重组菌。
背景技术
植物半纤维素约占植物干重的35％，是在自然界中仅次于纤维素的第二大类可再生的生物质能。甘露聚糖是自然界中半纤维素的第二大组分，由吡喃甘露糖以β-1,4糖苷键连接而成，广泛存在于植物中。
水产养殖原料中甘露聚糖可最高占非淀粉多糖的34％。非淀粉多糖是存在于饲料中的主要抗营养因子，不被消化道所降解，遇水形成胶态溶液，使食糜粘度增大，阻碍营养物质的消化吸收，降低动物的生产性能。
甘露聚糖酶(β-mannanase；endo-β-1,4-D-mannanase；EC 3.2.1.78)是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖及甘露聚糖的内切糖苷水解酶，降解产物为甘露糖和/或甘露寡糖。根据氨基酸序列同源性，甘露聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第5和26家族，其可来源于细菌、放线菌及真菌等。
甘露聚糖酶已在饲料、造纸、食品、制药、纺织印染及石油开采等领域得到了广泛的应用。在饲料中，外源甘露聚糖酶的添加可降解饲料中的甘露聚糖，从而起到积极的作用，如降低食糜粘性并提高饲料转化率、破坏植物细胞壁结构以改善饲料营养价值、提高动物机体的免疫功能从而减少抗生素等化学药物的使用、水解产物甘露寡糖可作为营养物质促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌的增殖。
具有低温活性的甘露聚糖酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程，如水产饲料中应用的甘露聚糖酶需要在低温(10–20℃)环境下具有催化活性。目前，已报导2个具有低温活性的甘露聚糖酶(专利号：ZL201110326253.4及专利申请号：201310539350.0)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25及其基因、重组载体和重组菌。
本发明的技术方案如下：
一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种编码所述的甘露聚糖酶ManAGN25的甘露聚糖酶基因manAGN25，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的甘露聚糖酶基因manAGN25的重组载体是包含有甘露聚糖酶基因manAGN25的重组载体。
所述的甘露聚糖酶基因manAGN25的重组菌是包含有甘露聚糖酶基因manAGN25的重组菌。
所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种。
所述甘露聚糖酶ManAGN25总共含371个氨基酸，理论分子量为42.2kDa。ManAGN25的N端28个氨基酸为预测的信号肽序列“MRKTKIKRYLGQLILCGTFALAAFSLRA”，成熟的甘露聚糖酶ManAGN25含343个氨基酸。经BLAST比对，甘露聚糖酶ManAGN25与GenBank中Sphingobacterium sp.IITKGP-BTPF85来源的假定蛋白(hypothetical protein)(序列号：EQB79541)具有最高的一致性，为70.9％，该假定蛋白功能还未研究，只是通过序列相似性归类于糖苷水解酶第26家族蛋白；ManAGN25与已验证功能的Sphingomonas sp.JB13来源甘露聚糖酶(AFE82293)的一致性为38.0％。以上BLAST比对结果说明该甘露聚糖酶ManAGN25是一种新的甘露聚糖酶。
本发明通过PCR的方法分离克隆了甘露聚糖酶ManAGN25的编码基因manAGN25，其全长1116bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。
本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因manAGN25，其编码的甘露聚糖酶ManAGN25的最适pH为6.5–7.0；最适温度为35–40℃，在10℃和20℃下分别具有约15％和约45％的酶活；经0.1MpH5.0–8.0缓冲液在37℃下处理60min，仍能保持60％以上的活性；37℃时半衰期约为60min。本发明的甘露聚糖酶ManAGN25为低温甘露聚糖酶，可应用于水产饲料及食品行业中。
附图说明
图1为在大肠杆菌中表达的重组甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析；其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组甘露聚糖酶。
图2为纯化的重组甘露聚糖酶的pH活性。
图3为纯化的重组甘露聚糖酶的pH稳定性。
图4为纯化的重组甘露聚糖酶的热活性。
图5为纯化的重组甘露聚糖酶的热稳定性。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
试验材料和试剂
1、菌株及载体
鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)同文献报道菌种性质，如中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株Sphingobacterium siyangensis CGMCC 1.6855；大肠杆菌表达载体pET-28a(+)及菌株Escherichia coli BL21(DE3)购于Novagen公司。
2、酶类及其它生化试剂
限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；角豆胶和甘露糖购自Sigma公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 甘露聚糖酶基因manAGN25的克隆
提取鞘氨醇杆菌基因组DNA：将液体培养2d(LB培养基)的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液4mL(裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，NaCl500mM，2％SDS(w/v)，pH8.0)，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入0.1mLTE溶解，置于-20℃备用。
根据糖苷水解酶第26家族的保守氨基酸序列([N/T/E]-G-[E/G]-W-[F/Y]-W-W-G和Y-P-[G/V]-[D/A]-[E/NS]-Y-V-D)合成了简并引物GH26F和GH26R(如表1)。
表1 甘露聚糖酶基因manAGN25的克隆与表达引物
以鞘氨醇杆菌基因组为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为：dNTP(2.5μM)5.0μL，10×PCR缓冲液5.0μL，GH26F和GH26R引物(10μM)各1.0μL，Taq酶(2.5U/μL)0.5μL，基因组DNA(10ng/μL)2.5μL，ddH2O35μL，总体积50μL。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，44℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR扩增获得188bp片段，将该片段回收后与pMD18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。
根据测序得到的核甘酸序列，设计热不对称交错PCR(简称TAIL-PCR)上游特异性引物2条，并将它们分别命名为usp1和usp2；另设计下游特异性引物2条，并将它们分别命名为dsp1和dsp2(如表1)。特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，usp2的位置设计在usp1的内侧，dsp2的位置设计在dsp1的内侧。以鞘氨醇杆菌基因组为模板，通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，TAIL-PCR扩增体系和反应参数参照文献设置(Zhou JP etal.,Appl Biochem Biotech 2010,160:1277–1292)，特异性引物退火温度为57℃。扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到甘露聚糖酶基因manAGN25，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2 重组甘露聚糖酶ManAGN25的制备
以manAGN25EXF和manAGN25EXR为引物对(如表1)，鞘氨醇杆菌基因组为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系为：dNTP(2.5μM)5.0μL，10×PCR缓冲液5.0μL，manAGN25EXF和manAGN25EXR引物(10μM)各1.0μL，Taq酶(2.5U/μL)0.5μL，基因组DNA(10ng/μL)2.5μL，ddH2O35μL，总体积50μL。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到甘露聚糖酶基因manAGN25，并在该基因5’和3’端分别引入了EcoRI和XhoI酶切位点。将甘露聚糖酶基因manAGN25进行双酶切(EcoRI和XhoI)，同时将表达载体pET-28a(+)进行双酶切(EcoRI和XhoI)，将上述酶切的甘露聚糖酶基因manAGN25与表达载体pET-28a(+)相连接，获得含有甘露聚糖酶基因manAGN25的重组质粒pET-manAGN25并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/manAGN25。
取含有重组质粒pET-manAGN25的E.coli BL21(DE3)菌株，以0.1％的接种量接种于LB(含50μg/mL Kan)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含50μg/mL Kan)培养液中，快速振荡培养约2–3h(OD600达到0.6–1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0Tris-Hcl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(如图1)表明，重组甘露聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
实施例3 纯化的重组甘露聚糖酶ManAGN25的性质测定
1、纯化的重组甘露聚糖酶ManAGN25的活性分析
实施例2纯化的重组甘露聚糖酶ManAGN25的活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸(DNS)法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含100μL酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量。
2、纯化的重组甘露聚糖酶ManAGN25的pH活性和pH稳定性测定
酶的pH活性测定：将甘露聚糖酶ManAGN25在37℃下和0.1M pH5.0–8.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于0.1M pH4.0–8.0的缓冲液中，在37℃下处理60min，然后在pH7.0及37℃下进行酶促反应，以加去离子水代替缓冲液的酶液作为对照。缓冲液为0.1M McIlvaine buffer。以角豆胶为底物，反应10min，测定纯化的ManAGN25的酶学性质。结果表明：ManAGN25的最适pH6.5–7.0(图2)；经0.1M pH5.0–8.0缓冲液在37℃下处理60min，仍能保持60％以上的活性(图3)。
3、纯化的重组甘露聚糖酶ManAGN25的热活性及热稳定性测定：
酶的热活性测定：在pH7.0的缓冲液中，于0–60℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中(37℃或50℃)处理1–60min后，在pH7.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以角豆胶为底物，反应10min，测定纯化的ManAGN25的酶学性质。结果表明：ManAGN25的最适温度35–40℃，在10℃和20℃下分别具有约15％和约45％的酶活(图4)；37℃时半衰期约为60min，50℃下很快失活(图5)。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种具有低温活性的甘露聚糖酶ManAGN25，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的甘露聚糖酶ManAGN25的甘露聚糖酶基因manAGN25，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，在表达载体中插入了权利要求2所述的甘露聚糖酶基因manAGN25。
4.一种重组菌，其特征在于，在宿主细胞中插入权利要求2所述的甘露聚糖酶基因manAGN25。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种。
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