CN102321599B - 一种低温α-半乳糖苷酶AgaAGN14及其基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种α-半乳糖苷酶AgaAGN14及其基因。本发明提供了一种来源于节杆菌（Arthrobactersp.）的α-半乳糖苷酶AgaAGN14，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本发明提供了上述α-半乳糖苷酶的编码基因agaAGN14，α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重组载体和α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重组菌株。本发明的α-半乳糖苷酶具有以下性质：最适pH6.5；最适温度45℃，在10℃和20℃下分别具有28%和30%以上的酶活；经0.1MpH5.0–10.0缓冲液在25℃下处理1h，仍能保持~85%的活性；较好的水解各种自然底物的能力；可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

Description

一种低温α - 半乳糖苷酶 AgaAGN14 及其基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种低温α-半乳糖苷酶AgaAGN14及其基因。

背景技术

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，EC 3.2.1.22）又叫密二糖酶（Melibiase），是一种外切糖苷酶类，能特异性水解密二糖、棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖底物及半乳甘露聚糖等多聚糖底物中的α-半乳糖苷键。这些低聚糖和多聚糖广泛存在于食品和饲料原料中，尤以豆科类植物种子含量最高（Karr-Lilienthal et al., Livest Prod Sci, 2005, 97: 1–12.）。

α-半乳糖苷酶可应用于饲料、食品和医疗等行业中。在饲料行业中，α-半乳糖苷酶制剂作为一种促生长类酶制剂，可以去除或减少α-半乳糖苷寡糖类抗营养因子（棉籽糖等低聚糖）对营养物质消化的副作用，促进动物对营养物质的消化，提高饲料利用率；在食品行业中，α-半乳糖苷酶制剂可以减少棉籽糖等在豆奶中的含量，增加人类对豆类营养的吸收；在医疗行业中，α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞及治疗Fabry疾病(Yoshimitsu et al., Mol Biol Rep, 2011, 38: 3145–3152.)等。

具有低温活性的酶制剂可应用于低温生境和低温加工过程。水产动物终生或大部分时间生活于水中，体温随水温或气温变化而变化，一般在10–20℃（Zhou et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 85: 323–333.）。因此，水产饲料中的应用酶需要在此低温（10–20℃）环境下具有催化活性。另一方面，大多水产动物消化道环境呈中性（如鲤科鱼类）或偏碱性，水产饲料中添加的外源酶还需在中性或偏碱性等条件下具有催化活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温α-半乳糖苷酶。

本发明的再一目的是提供编码上述α-半乳糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述α-半乳糖苷酶AgaAGN14可得自节杆菌（Arthrobacter sp.）。AgaAGN14的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

本发明的α-半乳糖苷酶AgaAGN14总共含702个氨基酸，理论分子量为77.5kDa。该酶的最适pH值为6.5，在pH6.0–9.0的范围内维持50%以上的酶活性；经pH5.0–10.0的缓冲液处理1h，该酶酶活剩余达80%以上；该酶最适温度为45℃，在10℃和20℃分别具有28%和30%以上的酶活；在pH 6.5及37℃下，该酶对0.5%（w/v）棉籽糖的比活为0.69±0.01 U mg⁻¹，对1%的密二糖、菜粕和棉籽粕的比活分别为34.45±2.15，2.94±0.27和2.65±0.22 U mg⁻¹。

本发明提供了编码上述α-半乳糖苷酶的基因agaAGN14，该基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了α-半乳糖苷酶AgaAGN14的编码基因agaAGN14，其全长2109bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经BLAST比对，该α-半乳糖苷酶基因agaAGN14编码的氨基酸序列与GenBank中Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3来源的潜在α-半乳糖苷酶（ADX74417）具有最高的一致性，为53.7%；与确证活性的Streptomyces sp. S27来源α-半乳糖苷酶（ADK91095）的一致性为50.0%。说明α-半乳糖苷酶AgaAGN14是一种新的α-半乳糖苷酶。

本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重组载体，优选为pET-agaAGN14。将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到质粒pET-28a（+）上的HindIII和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-agaAGN14。

本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/agaAGN14。

本发明制备α-半乳糖苷酶AgaAGN14的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶表达；

3）回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶AgaAGN14。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21（DE3），得到重组菌株BL21(DE3)/agaAGN14。

本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶最适pH6.5；在10℃和20℃下分别具有28%和30%以上的酶活；经0.1M pH5.0–10.0缓冲液在25℃下处理1h，仍能保持~85%的活性；较好的水解各种自然底物的能力；可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14。

图2：重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的最适pH。

图3：重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的pH稳定性。

图4：重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的最适温度。

图5：重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：节杆菌（Arthrobacter sp.）来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC 1.1525；大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）和表达载体pET-28a（+）购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；pNPG（p-nitrophenyl-α-d-galactopyranoside）和密二糖购自Sigma公司；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的克隆

提取节杆菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

表1. α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的克隆与表达引物

引物名称	引物序列（ 5'---3' ）	引物长度（ bp ）
			GH36F	TGTTCRTCCTNGAYGAYKGNTGG	23
GH36R	GGGYTTAYSATYTCNGGYTCCC	22
			usp1	AGGCCGAATTCCATGCCCA	19
usp2	ACGTGGCTGATCAGCGGATCAA	22
			dsp1	GGGGCTTGATCCGCTGATCA	20
dsp2	GGGCATGGAATTCGGCCTTTG	21
			dsp3	AATTGGTGGGCCAGCACATCG	21
dsp4	GCTCTTTGGGCACTTCGGGATG	22
			agaAGN14F	CCCAAGCTTGCATGAGCAGCGTAATACTCGAAAG	34
agaAGN14R	CCGCTCGAGTGCACCCTCCGTTCGGCGGGCA	31

根据糖苷水解酶第36家族的保守序列（[F/L/V]-[L/V]-[L/M/V]-D-D-G-W-F和E-P-E-M-[V/I]-[N/S]-[P/E]）设计合成了简并引物GH36F和GH36R（表1）。以节杆菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，43℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到一约172bp片段，将该片段回收后与pMD 18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计热不对称交错PCR（简称TAIL-PCR）上游特异性引物2条，并将它们分别命名为usp1和usp2；另设计下游特异性引物4条，并将它们分别命名为dsp1、dsp2、dsp3、dsp4（表1）。特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp4的位置设计在sp3的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度为19–22nt，引物退火温度在60–70℃。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到α-半乳糖苷酶基因agaAGN14，该基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。

实施例2：重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的制备

以agaAGN14F和agaAGN14R为引物对（表1），节杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min 30sec，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到α-半乳糖苷酶的基因agaAGN14，并在该基因5’和3’端分别引入了HindШ和XhoI酶切位点。将编码α-半乳糖苷酶的基因agaAGN14进行双酶切（HindШ和XhoI），同时将表达载体pET-28a（+）进行双酶切（HindШ和XhoI）。将上述酶切的α-半乳糖苷酶agaAGN14与表达载体pET-28a（+）相连接，获得含有α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重组质粒pET-agaAGN14并转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/agaAGN14。

取含有重组质粒pET-agaAGN14的E. coli BL21（DE3）菌株和只含有pET-28a（+）空质粒的E. coli BL21（DE3）菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50µg/mL Kan）培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50µg/mL Kan）培养液中，快速振荡培养约2–3h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组α-半乳糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的性质测定

1、重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的活性分析

实施例2纯化的重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的活性测定方法采用pNPG法：将pNPG溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含100μL适量酶液，900μL的2mM底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液再反应10min，然后加1.5mL 1M Na₂CO₃终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP；1个酶活单位（U）定义为每分钟分解pNPG产生1μmolpNP所需的酶量。对底物棉籽糖、棉籽粕和菜粕的活性测定方法采用DNS法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5%或1.0%（w/v）；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应120min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值；1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol半乳糖所需的酶量。对底物密二糖的活性测定方法采用葡萄糖氧化酶法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5%（w/v）；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后根据葡萄糖氧化酶试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司CAT361590）说明书测定酶活性；1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol葡萄糖所需的酶量。

2、重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的最适pH和pH稳定性测定：

酶的最适pH测定：将α-半乳糖苷酶AgaAGN14在37℃下和0.1M pH5.0–11.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于0.1M pH4.0–11.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH6.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M McIlvaine buffer（pH4.0–8.0）和0.1M glycine-NaOH（pH9.0–11.0）。以pNPG为底物，反应10min，测定纯化的AgaAGN14的酶学性质。结果表明：AgaAGN14的最适pH为6.5，在pH6.0–9.0的范围内维持50%以上的酶活性（图2）；经pH5.0–10.0的缓冲液处理1h，仍能保持~85%的活性（图3）。

3、重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的最适温度及热稳定性测定：

酶的最适温度测定：在pH6.5的缓冲液中，于0–60℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于37℃和50℃中，处理0–60min后，在pH6.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPG为底物，反应10min，测定纯化的AgaAGN14的酶学性质。结果表明：AgaAGN14的最适温度为45℃，在10℃和20℃分别具有28%和30%以上的酶活（图4）；在37℃下酶AgaAGN14很稳定（图5）。

4、重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14的动力学参数测定：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH6.5及45℃下，以0.5mM pNPG为底物，依次在酶促反应的1–30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.1–4.0mM pNPG为底物，在pH6.5、45℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定K _m、V _max和k _cat。经测定，在45℃ pH6.5条件下，AgaAGN14对pNPG的K _m、V _max和k _cat分别为0.41 mM⁻¹、18.28µmol min⁻¹ mg⁻¹和25.36 s⁻¹。

5、不同金属离子及化学试剂对重组AgaAGN14活力的影响：

在酶促反应体系中加入10mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃、pH6.5条件下，以pNPG为底物测定酶活性。结果（表2）表明，10mM的Ag⁺、Hg²⁺及SDS可完全或几乎完全抑制AgaAGN14；K⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺、Cu²⁺和β-mercaptoethanol对AgaAGN14具一定的抑制作用，剩余酶活~60%；其余金属离子和化学试剂对AgaAGN14的影响较小。

表2. 金属离子及化学试剂对重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14活力的影响

试剂	相对酶活(%)
		CK	100.0±3.9
Co2+	94.7±2.8
		Pb2+	87.2±8.7
Zn2+	76.5±1.7
		Mg2+	74.3±0.9
Na+	68.1±3.4
		K+	58.7±0.8
Ca2+	57.7±1.5
		Mn2+	57.5±5.9
Fe3+	56.8±4.1
		Ni2+	55.0±2.2
Cu2+	52.2±4.2
		Ag+	0
Hg2+	0
		EDTA	83.0±4.1
β-mercaptoethanol	58.7±1.6
		SDS	0.4±0.2

6、重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14对底物的降解：

在pH 6.5及37℃下，重组α-半乳糖苷酶AgaAGN14对0.5%（w/v）棉籽糖的比活为0.69±0.01 U mg⁻¹，对1%的密二糖、菜粕和棉籽粕的比活分别为34.45±2.15，2.94±0.27和2.65±0.22 U mg⁻¹。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南师范大学

<120> 一种低温α-半乳糖苷酶AgaAGN14及其基因

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 702

<212> PRT

<213> 节杆菌（Arthrobacter sp.）

<400> 1

Met Ser Ser Val Ile Leu Glu Arg Asp Gly Thr Ala Val Ile Leu Asp

1 5 10 15

Val Ser Gly Leu Pro Gln Val Leu His Trp Gly Ala Val Leu Pro Gly

20 25 30

Gln Ile Pro Thr Ala Ser Asp Leu Ala Ala Pro Val Val His Ser Arg

35 40 45

Tyr Asp Phe Pro Val Val Ala Asn Pro Leu Trp Pro Ala Ala Ala Glu

50 55 60

Gly Trp Arg Gly Thr Pro Leu Val Ser Gly Ser Arg Asn Arg Ala Asp

65 70 75 80

Ala Ser Pro Arg Phe Arg Asn Pro Asp Val Gln Lys Ser Gly Phe Val

85 90 95

Leu Thr Leu Thr Ala Glu Asp Ala Asp Thr Ala Leu Gln Leu Lys Thr

100 105 110

Glu Leu Glu Leu Leu Glu Gly Gly Leu Leu Arg Ile Arg Asn Thr Leu

115 120 125

Ala Asn Thr Gly Ser Gly Pro Tyr Gln Leu Leu His Leu Ser Val Cys

130 135 140

Leu Pro Val Ala Pro Glu Ala Gly Glu Leu Leu Asp Thr Thr Gly Arg

145 150 155 160

Trp Thr Arg Glu Arg Ser Pro Gln Arg Leu Pro Phe Gly Gln Gly Thr

165 170 175

Trp Leu Arg Glu Gly Arg His Gly Arg Thr Gly His Asp Ala Pro Val

180 185 190

Leu Leu Ala Ala Gly Thr Pro Gly Phe Gly Asn Arg His Gly Lys Val

195 200 205

Gln Ala Val His Phe Ala Trp Ser Gly Asn Trp Arg Val Arg Ala Glu

210 215 220

Arg Thr Pro Asp Pro Ser Arg Met Leu Ala Ala Glu Glu Leu Phe Gly

225 230 235 240

Pro Gly Glu Ala Glu Leu Ala Pro Gly Glu Ser Tyr Thr Thr Pro Trp

245 250 255

Leu Tyr Ala Ala His Ser Asn Ala Gly Leu Asp Gly Ile Thr Ala Ala

260 265 270

Phe His Thr Trp Leu Arg Thr Arg Pro Asn His Pro Arg Arg Pro Arg

275 280 285

Pro Val Val Leu Asn Thr Trp Glu Ala Val Tyr Phe Asp His Asn Leu

290 295 300

Gln Thr Leu Arg Glu Leu Ala Asp Thr Ala Ala Ala Leu Gly Thr Glu

305 310 315 320

Arg Phe Val Leu Asp Asp Gly Trp Phe Gly Gly Arg Arg Asp Asp His

325 330 335

Arg Gly Leu Gly Asp Trp Thr Val Ser Pro Glu Ala Trp Pro Glu Gly

340 345 350

Leu Asp Pro Leu Ile Ser His Val Arg Gly Leu Gly Met Glu Phe Gly

355 360 365

Leu Trp Val Glu Pro Glu Met Ile Ser Leu Asp Ser Asp Thr Ala Arg

370 375 380

Ser His Pro Glu Trp Ile Cys Arg Ala Arg Thr Glu Glu Leu Pro Pro

385 390 395 400

Gln Trp Arg His Gln Gln Val Leu Asp Leu Thr Arg Gly Glu Ala Phe

405 410 415

Lys His Val Leu Arg Gln Leu Asp Asp Leu Leu Ala Asn His Gln Ile

420 425 430

Ser Phe Leu Lys Trp Asp Gln Asn Arg Asp Leu Thr Asp Met Ala Ser

435 440 445

Gln Gly Arg Pro Ser Ala Arg Asn Gln Thr Leu Ala Ala Tyr Arg Leu

450 455 460

Met Ser Glu Leu Lys Ala Arg His Pro His Val Glu Ile Glu Ala Cys

465 470 475 480

Ser Ser Gly Gly Ala Arg Val Asp Leu Gly Val Leu Glu Phe Ala Asp

485 490 495

Arg Val Trp Ala Ser Asp Ser Asn Asp Ala Leu Glu Arg Gln Arg Ile

500 505 510

Gln Gln Trp Thr Gln Arg Leu Leu Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln His

515 520 525

Ile Gly Pro Pro Gln Ala His Thr Ser Gly Arg Thr His Gly Leu Val

530 535 540

Phe Arg Gly Leu Thr Ala Leu Phe Gly His Phe Gly Met Glu Trp Asp

545 550 555 560

Ile Arg Glu Ala Lys Gly Arg Asp Arg Glu Leu Leu Ala Gly Leu Ile

565 570 575

Ala Leu Tyr Lys Gln His Arg Thr Leu Ile His Asn Gly Thr Ala Val

580 585 590

Arg Ala Asp Leu Ala Asp Pro Gly Leu Gln Leu Tyr Gly Ala Val Ala

595 600 605

Pro Asp Arg Ser Glu Ala Leu Tyr Val Tyr Ala Thr Leu Asp Ser Thr

610 615 620

Leu Asp Glu Thr Pro Gly Arg Ala Ala Leu Pro Gly Leu Asp Pro Glu

625 630 635 640

Gln Gly Tyr Arg Leu Asp Pro Val Ile Leu Asp Glu Pro Gly Thr Phe

645 650 655

Leu Gln Arg Thr Pro Pro Ala Trp Leu Ala Thr Gly Leu His Ala Gly

660 665 670

Gly Ala Trp Leu Gly Thr Ala Gly Val Pro Leu Pro Val Leu Asn Pro

675 680 685

Glu Arg Ala Met Leu Leu His Ala Arg Arg Thr Glu Gly Ala

690 695 700

<210> 2

<211> 2109

<212> DNA

<213> 节杆菌（Arthrobacter sp.）

<400> 2

atgagcagcg taatactcga aagggacggc accgccgtca tcctggacgt gtccggcctt 60

ccacaggtcc tgcactgggg agcggtgctg ccgggacaga tccccacagc ttcggacctt 120

gccgcccccg tggtccactc ccggtacgat ttcccagtgg ttgccaaccc gttgtggccg 180

gcggcagctg aagggtggcg gggaactcct ctggtctcgg gttcccggaa ccgtgccgat 240

gcgtctcccc gattccggaa tcccgacgtg cagaagtcag gcttcgtcct caccctgacc 300

gctgaggacg ccgatacagc cctgcagctc aagacagagc tggagcttct tgaagggggc 360

ctgttgagga tacggaacac ccttgcgaac actggaagcg gcccctacca gctgctgcat 420

ctctcggtgt gcctgcctgt ggccccagag gccggggaac tgctggatac tactggccgc 480

tggacccggg aacgttcacc ccagcggctt cccttcggcc agggaacctg gctgcgggag 540

gggcgtcacg ggcgcacagg ccacgatgcc cccgtgctgc tggctgccgg gactccgggg 600

ttcggaaacc ggcacggcaa ggtccaggcg gtgcatttcg cctggagcgg gaactggcgc 660

gtgcgcgccg aacggacacc cgatccctcc aggatgctcg cagccgagga actcttcggt 720

ccgggcgaag ccgaactcgc accgggcgag tcgtacacca cgccgtggct ctacgctgcc 780

cattcgaacg ccgggctgga cggcatcacc gccgccttcc acacctggct gcgtacccgg 840

ccaaaccatc cgcgccggcc gcggccggtg gtgctcaaca cctgggaagc ggtctatttc 900

gaccacaacc tccaaacact ccgggaactg gccgacacag ccgctgccct tggcacggag 960

cggtttgtgc tggacgacgg gtggttcggc gggcgccggg acgaccacag gggcctgggg 1020

gactggacgg tctcgcccga ggcgtggccg gaggggcttg atccgctgat cagccacgtc 1080

cgcggcctgg gcatggaatt cggcctttgg gtggagccgg agatgatcag cctggactcg 1140

gacaccgcac gctcacatcc ggagtggatc tgccgcgcgc gcaccgagga gcttcctcct 1200

caatggcggc atcagcaggt gctggacctg acccgcggag aagccttcaa gcatgtactc 1260

cgccagctgg atgacctgct ggcgaaccat cagatttcct tcctgaaatg ggaccagaac 1320

agggacctga ccgacatggc atcgcagggc aggccatctg cgcggaacca gaccctggct 1380

gcctaccggc tcatgagcga gctcaaggcc cgtcacccgc acgttgaaat cgaagcctgt 1440

tcctccggcg gcgcacgcgt ggacctgggc gtgcttgaat tcgcggaccg ggtatgggca 1500

tcggactcca acgacgcact ggagcggcag cggatccagc aatggaccca gcgcctgctg 1560

cccccggaat tggtgggcca gcacatcggt ccgccgcagg cgcatacctc cggcaggaca 1620

cacggcctgg ttttccgggg cctgacggcg ctctttgggc acttcgggat ggaatgggac 1680

attcgggaag ccaagggccg ggaccgggaa ctgctggccg gactcattgc cctctacaag 1740

cagcaccgca ccctgatcca caacggaaca gccgttcggg ctgacctggc ggaccccggg 1800

ctgcagctct acggcgccgt cgctccggac cgcagtgaag cgctgtacgt ttacgcgaca 1860

ctggacagca ccctggacga aactcccggg agggccgccc tgccggggct ggatccggaa 1920

cagggctata ggctggatcc agtgatactt gatgaaccgg gaactttcct gcagcgcacc 1980

ccgccggcct ggcttgccac aggcctgcac gccggcggcg cctggctggg cacggcgggc 2040

gttccccttc ccgtcctgaa cccggagcgt gccatgctgc tgcatgcccg ccgaacggag 2100

ggtgcatga 2109

Claims (4)

1.一种α-半乳糖苷酶AgaAGN14，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种编码权利要求1所述的α-半乳糖苷酶AgaAGN14的α-半乳糖苷酶基因agaAGN14，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.一种包含权利要求2所述α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重组菌株。

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