CN110004166A - 高效表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌菌株及其获得方法 - Google Patents

高效表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌菌株及其获得方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种高效表达分泌β‑甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌菌株及其获得方法。具体是首先将经过密码子优化的β‑甘露聚糖酶基因克隆中pMA5载体中不同的信号肽序列下游，使其分泌到胞外；其次在宿主菌基因组上过表达分泌过程中涉及的限制因子；最后更换其表达载体上启动子，通过增强转录和翻译过程从而在蛋白质合成水平增加β‑甘露聚糖酶的生成。本发明中高效表达分泌β‑甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌利用2×SR培养基在37℃，220rpm条件下发酵生产甘露聚糖酶，72h发酵液中β‑甘露聚糖酶的酶活力最高可达2207U/mL，为具有良好应用前景的菌株。

Description

高效表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌菌株及其获 得方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种或多种高效表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌菌株及其获得方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于革兰氏阳性菌，是一种非致病性的重要工业微生物。其全基因组测序工作已经完成，遗传背景和生理特性清晰。利用枯草芽孢杆菌表达外源蛋白具有诸多优点：(1)安全性高，可用于食品、药物等工业生产；(2)能直接将分泌蛋白释放到培养基中，利于分离纯化；(3)具有高效的分泌目的蛋白的能力，存在多种分泌途径，且途径中相关的分泌组分已经得到解析；其分泌的重组蛋白多数情况下依然能够保持天然构象和生物活性；(4)生长迅速，培养条件简单，遗传背景了解清晰，具有较好的工业生产基础。
β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.1.78)是一类能够水解β-1,4-D-甘露糖苷键连接的甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖等的半纤维素酶类，目前已广泛应用于生产生活的各个方面。应用于饲料行业，提高饲料利用率；应用于食品行业用于生产甘露低聚糖，以促进人体肠道蠕动、降低胆固醇、增强免疫力等；另外甘露聚糖酶还作为优良生物破胶剂用于油井石油压裂液；甘露聚糖酶应用于造纸行业，有利于改善纸张质量；另外甘露聚糖酶在纺织印染和洗涤剂生产中也有重要作用。
利用枯草芽孢杆菌表达系统生产β-甘露聚糖酶的一大优势是能够将其分泌到细胞外，从而简化下游的分离纯化过程和降低生产成本。但是，β-甘露聚糖酶的分泌需要合适的信号肽序列引导其顺利通过细胞膜从而分泌到培养基中。目前尚不具备可以根据下游蛋白质序列预测最有效信号肽序列的软件，因此，需通过实验的方法确定最高效的信号肽序列。另外，由于β-甘露聚糖酶在蛋白转运与分泌过程中可能存在瓶颈因素，当细胞中涉及蛋白转运的调控元件不能满足需求时，或涉及蛋白分泌的限制性因子缺乏时，影响β-甘露聚糖酶的正确折叠，会造成β-甘露聚糖酶在胞壁间被蛋白酶所降解。因此通过在枯草芽孢杆菌中增加涉及蛋白表达分泌的各种限制性调控因子，将有利于β-甘露聚糖酶表达分泌量的提升。在克服了分泌的瓶颈因素后，可以通过使用强启动子增强转录翻译水平，进一步提高蛋白质的合成量，从而增加最终表达分泌到培养基中的β-甘露聚糖酶总量。
发明内容
本发明目的之一是提供经密码子优化的β-甘露聚糖酶基因，其特征在于(I)或(II)：
(I)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
(II)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过1-20个，优选1-10个，更优选1-5个，最优选1个核苷酸的取代、缺失或添加而获得的核苷酸序列，且获得的核苷酸序列编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的活性。
本发明目的之二是提供一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的β-甘露聚糖酶基因。
在优选的实施方式中，所述的表达载体，其特征在于，还包括编码信号肽的核酸片段；
优选的，所述的信号肽为amyL，或lipA，或nprB，或nprE，或phoD，或ywbN，更优选的，所述的信号肽为lipA；
优选的，所述的编码信号肽的核酸片段的3’端与β-甘露聚糖酶基因的5’端相连。
在优选的实施方式中，本发明目的之一上述任一的表达载体，其特征在于，还包括启动子；
优选的，所述的启动子为hpaII，或P43，或aprE，或xyl，或grac，或mglv，更优选的，所述的启动子为mglv；
优选的，所述启动子的3’端与编码信号肽的核酸片段的5’端相连。
本发明目的之三是提供一种表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌包括本发明目的之二所述任一的表达载体。
在优选的实施方式中，所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，还包括选自SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecDF、SecA、Ffh、Scr、Hbs、SRP、SipS、SipT、SipU、SipV、SipW、dnaK/J、GroESL、FtsY和PrsA中的一种或多种核酸片段，优选的为GroESL核酸片段。
在更优选的实施方式中，所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的蛋白分泌限制因子核酸片段插入重组枯草芽孢杆菌的基因组中，优选的，所述蛋白分泌限制因子核酸片段插入重组枯草芽孢杆菌的基因组的amyE位点。
在进一步优选的实施方式中，本发明目的之三上述任一的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 1A751。
本发明目的之四是提供一种β-甘露聚糖酶的生产方法，其步骤在于：
(a)构建权利要求5-8所述任一的重组枯草芽孢杆菌；
(b)培养步骤(a)得到的重组枯草芽孢杆菌；
(c)收集β-甘露聚糖酶；
优选的，所述培养的培养基为2×SR培养基；
优选的，所述培养的培养温度为30-40摄氏度，更优选的培养温度为37摄氏度；
优选的，所述培养的培养时间为12-80h，优选的培养时间为72h。
本发明目的之五是本发明目的之一的β-甘露聚糖酶基因，或本发明目的之二所述任一的表达载体，或本发明目的之三所述任一的重组枯草芽孢杆菌，或本发明目的之四所述生产方法生产的β-甘露聚糖酶在食品、饲料和造纸中的应用。
本发明的目的在于实现异源蛋白β-甘露聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的高水平表达分泌，并通过分子生物学技术提高其产量。
本发明在枯草芽孢杆菌表达载体pMA5质粒基础上，构建了在β-甘露聚糖酶基因序列上游分别克隆了不同的信号肽序列(amyL,lipA,nprB,nprE,phoD,ywbN)的不同的β-甘露聚糖酶表达载体，用以优化β-甘露聚糖酶的分泌表达水平。
本发明中β-甘露聚糖酶表达载体的宿主菌基因组中，过表达了分泌途径中可能影响目的蛋白分泌的多个基因，包括SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecDF、SecA、Ffh、Scr、SipS、SipT、SipU、SipV、SipW、Hbs、SRP、DnaK/J、GroESL、FtsY、PrsA等潜在的瓶颈因子的编码基因。
本发明在β-甘露聚糖酶表达质粒基础上构建了具有不同启动子序列(hpaII，P43，aprE，xyl，grac，mglv)的β-甘露聚糖酶表达载体，用以优化β-甘露聚糖酶的表达强度。
本发明构建的β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌基因工程改造菌株，在72h摇瓶发酵后酶活力最高可达2207U/mL。
本发明的优势在于从蛋白质的合成和分泌两方面，通过系统的优化整合，构建高效表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌生产菌株，使其更具有工业应用价值。
附图说明
图1：实施例1中72h发酵液上清的SDS-PAGE电泳图：其中M:PageRulerTMPrestainedProtein Ladder；Ct.1A751发酵液上清；amyL：信号肽为amyL时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；lipA：信号肽为lipA时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；nprB：信号肽为nprB时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；nprE：信号肽为nprE时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；phoD：信号肽为phoD时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；ywbN：信号肽为ywbN时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量。
图2：实施例2中72h发酵液上清的SDS-PAGE电泳图：其中M:PageRulerTMPrestained Protein Ladder；empty.：1A751发酵液上清；Ct：未过表达基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；secY：过表达secY基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；secE：过表达secE基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；secG：过表达secG基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；secDF：过表达secDF基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；secA：过表达secA基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；ffh：过表达ffh基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；secYEG：过表达secYEG基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；scr：过表达scr基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；hbs：过表达hbs基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；sipS：过表达sipS基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；sipT：过表达sipT基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；sipU：过表达sipU基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；sipV：过表达sipV基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；sipW：过表达sipW基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；hbs：过表达hbs基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；SRP：过表达SRP基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；partial dnaK：过表达dnaK/J基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；groES operon：过表达groESL基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；ftsY：过表达ftsY基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；prsA：过表达prsA基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量。
图3：实施例2中72h发酵液上清中β-甘露聚糖酶活相对值：其中control：未过表达基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活设为100％。secY：过表达secY基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；secE：过表达secE基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；secG：过表达secG基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；secDF：过表达secDF基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；secA：过表达secA基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；ffh：过表达ffh基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；secYEG：过表达secYEG基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；scr：过表达scr基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；sipS：过表达sipS基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；sipT：过表达sipT基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；sipU：过表达sipU基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；sipV：过表达sipV基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；sipW：过表达sipW基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；hbs：过表达hbs基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；SRP：过表达SRP基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；partial dnaK：过表达dnaK/J基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；groES operon：过表达groESL基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；ftsY：过表达ftsY基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值；prsA：过表达prsA基因时发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活相对值。
图4：实施例3中72h发酵液上清的SDS-PAGE电泳图：其中M:PageRulerTMPrestained Protein Ladder；A：不同浓度木糖诱导物作用下，含xyl启动子的菌株发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；B：不同浓度IPTG诱导物作用下，含grac启动子的菌株发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；C：不同浓度麦芽糖诱导物作用下，含mglv启动子的菌株发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量。
图5：实施例3中72h发酵液上清的SDS-PAGE电泳图：其中M:PageRulerTMPrestained Protein Ladder；hpaII：启动子为hpaII时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；P43：启动子为P43时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；aprE：启动子为aprE时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；xyl：启动子为xyl时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；grac：启动子为grac时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量；mglv：启动子为mglv时发酵液上清中β-甘露聚糖酶表达量。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
本实例所用的表达载体pMA5中的β-甘露聚糖酶基因来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis DSM13)且不包含原有信号肽DNA序列，后经密码子优化，其核苷酸序列为序列SEQ ID NO：1。所用的信号肽DNA片段来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)Sec分泌途径的amyL(KEGG BSU03040),lipA(KEGG BSU32330),nprB(KEGGBSU11100),nprE(KEGG BSU14700)和Tat分泌途径的phoD(KEGG BSU02620),ywbN(KEGGBSU38260)。
1.构建包含不同信号肽序列的表达载体。
首先利用重叠延伸PCR(POE-PCR)的方法，将经密码子优化的β-甘露聚糖酶基因序列(SEQ ID NO：1)克隆至pMA5载体(来源于BGSC)上，在此基础上利用重叠延伸PCR(POE-PCR)的方法，分别将含有经密码子优化的β-甘露聚糖酶基因序列的载体pMA5和不同的信号肽DNA片段通过PCR的方法线性化，其中信号肽DNA片段所用的扩增引物含有与线性化载体片段两端的序列相同的部分，用以进行后续的重叠延伸PCR反应。
线性化载体扩增以pMA5为模板，利用下列引物进行PCR，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应体系为：
扩增条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃3min，30个循环；最后一个循环为72℃8min，得到pMA5线性化载体片段。
不同信号肽序列扩增以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组为模板，利用下列引物进行PCR，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应体系为：
扩增条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃10s，30个循环；最后一个循环为72℃1min。
以上述pMA5线性化载体片段和扩增得到的信号肽片段为模板按照大约摩尔比1:1的量混合进行重叠延伸PCR。按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应体系为：
扩增条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃4min，30个循环；最后一个循环为72℃8min。
本实施例中所用的引物序列见表1
表1实施例1中所用引物序列
PCR产物直接转化大肠杆菌DH5α，获得不同质粒，命名为pMA5-1Man，pMA5-2Man，pMA5-3Man，pMA5-4Man，pMA5-5Man，pMA5-6Man，所包含的信号肽序列分别为amyL,lipA,nprB,nprE,phoD,ywbN。
将上述构建的质粒分别转化到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751宿主菌中，得到不同的重组菌株。如表2所示为本实施例1中构建的质粒和菌株及其特征。
表2实施例1中构建的质粒和菌株及其特性
2.包含不同β-甘露聚糖酶表达载体的枯草芽孢杆菌菌株发酵生产β-甘露聚糖酶
将上述β-甘露聚糖酶的不同枯草芽孢杆菌菌株进行发酵培养。从-80℃冰箱中取出的各菌株划线后在LB固体培养基中过夜培养，次日转接到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h作为种子液。发酵培养基为2×SR培养基，其组分为1.5％(w/v)蛋白胨,2.5％(w/v)酵母提取物和0.3％(w/v)K2HPO4,pH 7.2。发酵培养所用的250mL三角摇瓶中培养基的装液量为30mL，接种量为1:100(v/v)。37℃，220rpm发酵72h得到发酵液样品。将发酵液4℃，12000rpm离心10min，取上清液检测β-甘露聚糖酶酶活力，每个发酵样品设置两个平行。3.β-甘露聚糖酶酶活力测定
利用DNS法通过检测次槐豆胶中释放的还原糖的量来确定β-甘露聚糖酶酶活力。以D-甘露糖为底物制作标准曲线。待测酶液活力测定时，底物为0.5％(w/v)的刺槐豆胶(Sigma 0753)溶解于pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液中。将40μL稀释到合适倍数的β-甘露聚糖酶粗酶液(即离心得到的分泌到培养基中的β-甘露聚糖酶上清液)和40μL底物均匀混合后于37℃水浴恒温孵育30min进行反应。然后在反应混合物中加入100μL DNS并煮沸10min。于冰上冷却至室温后加入320μL ddH2O，在540nm处测定吸光值。在37℃和pH 5.5的条件下，每分钟内从浓度为2.5mg/ml的甘露聚糖溶液中分解释放1μmol的还原糖所需要的酶量为一个酶活单位U。
4.β-甘露聚糖酶表达量的SDS-PAGE电泳检测
将待检测发酵液在13000rpm，离心10min，将上清液和菌体沉淀分开，上清液不作处理即为粗酶液原液。取80μL上清液，加入20μL已经加入β-巯基乙醇至终浓度为5％(v/v)的5×Loading Buffer，在沸水中煮15min，冷却至室温后，13000rpm，离心10min后的上清液即为制备好的蛋白质样品。样品制备好后进行SDS-PAGE，蛋白样品上样量为10μL。
酶活测定和SDS-PAGE结果(图1)表明当信号肽为lipA时，β-甘露聚糖酶的表达分泌量最大，该菌株为Bacillus subtilis 1A7512。以此菌株进行下述实验。
实施例2
本实施例中的β-甘露聚糖酶的表达载体和所包含的信号肽序列分别为pMA5-2Man和lipA。本实施例中所用的不同的枯草芽孢杆菌宿主菌分别在基因组上以单拷贝形式过表达了Sec分泌途径中的相关元件，以及可能影响该途径分泌效率的信号肽酶和分子伴侣等基因。所述用于表达β-甘露聚糖酶基因的枯草芽孢杆菌宿主菌及其相对应的过表达的基因分别为：B.subtilis 1A751S1(secY),1A751S2(secE),1A751S3(secG),1A751S4(secYEG),1A751S5(secDF),1A751S6(secA),1A751S7(ffh),1A751S8(scr),1A751S9(hbs),1A751S10(SRP),1A751S11(ftsY)，1A751P1(sipS),1A751P 2(sipT),1A751P3(sipU),1A751P4(sipV),1A751P5(sipW),1A751P6(dnaK/J),1A751P7(groESL)和1A751P8(prsA)。上述基因的过表达是通过整合型质粒载体pDL(来源于BGSC)将其以单拷贝形式整合到枯草芽孢杆菌基因组amyE位点上。
dnaK/J(ID BSU25470和BSU25460)、GroESL(ID BSU06020和BSU06030)、SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecDF、SecA、Ffh、Scr、Hbs、SRP、SipS、SipT、SipU、SipV、SipW、FtsY和PrsA均为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis 168)的核酸片段。本实施例中构建的不同的β-甘露聚糖酶表达菌株及其特征如表3所示。
表3实施例2中所构建的质粒和菌株及其特性
1.过表达相关基因的枯草芽孢杆菌宿主菌发酵生产β-甘露聚糖酶
发酵条件同实施例1中所述，进行72h摇瓶发酵，取样测定发酵样品上清液中β-甘露聚糖酶酶活，并进行SDS-PAGE电泳。从测定结果图2和图3中可知，当过表达分子伴侣groESL(1A751P7)后，发酵上清液中β-甘露聚糖酶的酶活力提高到原来的125％，其他基因的过表达对于上清液中β-甘露聚糖酶的总酶活力也有不同程度的影响。后续实验以过表达操纵子groESL的枯草芽孢杆菌菌株为基础进行。
实施例3
本实施例中所用的β-甘露聚糖酶的表达载体为pMA5-2Man，其包含的启动子为组成型表达的hpaII，信号肽为lipA，利用实施例1中所述方法，将启动子hpaII替换为来源于枯草芽孢杆菌168菌株的组成型启动子片段aprE和P43。另外所使用的三个诱导型启动子分别为木糖诱导型启动子xyl(来源于基因BSU17600)，IPTG诱导型启动子grac(来源于基因BSU06020)和麦芽糖启动子mglv(来源于基因BSU08180)。
本实施例中所用的引物序列见表4。
表4实施例3中所用引物序列
本实施例中构建的质粒和菌株及其特性见表5。
表5实施例3中所构建的质粒和菌株及其特性
1.不同诱导型启动子诱导物浓度的确定
木糖诱导型启动子所用的诱导物木糖的浓度分别为0％，1％，2％，和4％(w/v)；IPTG诱导型启动子grac所用的诱导物IPTG的浓度分别为0mM，0.001mM，0.01mM和0.1mM；麦芽糖诱导型启动子mglv所用的诱导物麦芽糖的浓度分别为0％，0.5％，1％和2％(w/v)。其他发酵条件同实施例1中所述，进行72h摇瓶发酵，取样测定发酵样品上清液中β-甘露聚糖酶酶活，并进行SDS-PAGE电泳。图4可知，木糖诱导型启动子在不同浓度的木糖诱导下均不能使β-甘露聚糖酶表达；IPTG浓度为0.1mM时，启动子grac使β-甘露聚糖酶的表达量最大；麦芽糖浓度为2％时，启动子mglv使β-甘露聚糖酶的表达量最大，酶活最高。
2.含有诱导型启动子或组成型启动子的β-甘露聚糖酶表达载体菌株的发酵
含有诱导型启动子的菌株使用最佳浓度的诱导物进行诱导，其他发酵条件同实施例1中所述，进行72h摇瓶发酵，取样测定发酵样品上清液中β-甘露聚糖酶酶活，并进行SDS-PAGE电泳。从测定结果图5中可知麦芽糖启动子mglv(Bacillus subtilis 1A751SPP5)使β-甘露聚糖酶表达分泌量最高，发酵72h后，酶活力可达2207U/mL。P43启动子次之，但表达量高于pMA5载体上原有启动子hpaII和grac，启动子aprE较低。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<130> 2016
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1011
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
cacactgtca gccctgtaaa ccctaacgca caaccgacta ctaaggcagt gatgaactgg 60
ctggcacatc tgccaaaccg tactgagagc cgtgtaatgt ccggtgcatt cggtggttac 120
agcctggata ctttcagcac tgctgaggca gaccgtatca agcaggcaac tggtcagctg 180
ccggctatct acggttgtga ttacgctcgt ggttggctgg aaccagagaa aatcgctgat 240
accatcgatt actcctgcaa ccgtgacctg attgcttact ggaaaagcgg tggtatcccg 300
cagattagca tgcacctggc taacccagcg ttcacctctg gtcattacaa aacgcagatt 360
tccaactccc agtacgaacg tatcctggac tcctccaccc cggagggcaa acgtctggaa 420
gcgatgctgt ctaaaatcgc ggatggtctg caggaactgg agaacgaagg tgttccggtt 480
ctgttccgcc cgctgcacga aatgaatggc gaatggttct ggtggggtct gacccaatat 540
aatcagaaag actctgaacg catctctctg tacaaacagc tgtacgtgaa aatctacgac 600
tacatgacca aaacccgtgg cctggaccac ctgctgtggg tgtacgcgcc ggatgccaac 660
cgcgacttta aaacggactt ctatccgggc gcgtcttacg tggatatcgt aggcctggat 720
gcttacttcg acgacccgta tgccattgat ggctatgaag aactgacctc tctgaacaag 780
ccgttcgcgt ttaccgaagt cggcccgcag accaccaatg gcggtctgga ttatgcgcgc 840
ttcattcacg ccatcaaaga aaaatatccg aaaacgacct attttctggc gtggaacgac 900
gaatggtctc cggccgttaa caagggcgcg gataccctgt atctgcaccc gtggacgctg 960
aacaaaggcg aaatttggga cggcgactct ctgaccccgg ttgttgaata a 1011

Claims (10)

1.经密码子优化的β-甘露聚糖酶基因，其特征在于(I)或(II)：
(I)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
(II)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过1-20个，优选1-10个，更优选1-5个，最优选1个核苷酸的取代、缺失或添加而获得的核苷酸序列，且获得的核苷酸序列编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的活性。
2.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的β-甘露聚糖酶基因。
3.权利要求2所述的表达载体，其特征在于，还包括编码信号肽的核酸片段；
优选的，所述的信号肽为amyL，或lipA，或nprB，或nprE，或phoD，或ywbN，更优选的，所述的信号肽为lipA；
优选的，所述的编码信号肽的核酸片段的3’端与β-甘露聚糖酶基因的5’端相连。
4.权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于，还包括启动子；
优选的，所述的启动子为hpaII，或P43，或aprE，或xyl，或grac，或mglv，更优选的，所述的启动子为mglv；
优选的，所述启动子的3’端与编码信号肽的核酸片段的5’端相连。
5.一种表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌包括权利要求2-4所述任一的表达载体。
6.权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，还包括选自SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecDF、SecA、Ffh、Scr、Hbs、SRP、SipS、SipT、SipU、SipV、SipW、dnaK/J、GroESL、FtsY和PrsA中的一种或多种核酸片段，优选的为GroESL核酸片段。
7.权利要求6所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的蛋白分泌限制因子核酸片段插入重组枯草芽孢杆菌的基因组中，优选的，所述蛋白分泌限制因子核酸片段插入重组枯草芽孢杆菌的基因组的amyE位点。
8.权利要求5-7所述任一的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 1A751。
9.一种β-甘露聚糖酶的生产方法，其步骤在于：
(a)构建权利要求5-8所述任一的重组枯草芽孢杆菌；
(b)培养步骤(a)得到的重组枯草芽孢杆菌；
(c)收集β-甘露聚糖酶；
优选的，所述培养的培养基为2×SR培养基；
优选的，所述培养的培养温度为30-40摄氏度，更优选的培养温度为37摄氏度；
优选的，所述培养的培养时间为12-80h，优选的培养时间为72h。
10.权利要求1的β-甘露聚糖酶基因，或权利要求2-4所述任一的表达载体，或权利要求5-8所述任一的重组枯草芽孢杆菌，或权利要求9所述生产方法生产的β-甘露聚糖酶在食品、饲料和造纸中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111549050A (zh) * 2020-05-18 2020-08-18 湖北大学 适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用
CN112553134A (zh) * 2020-12-30 2021-03-26 江南大学 一种在枯草芽孢杆菌中表达α-淀粉酶的方法
CN112708624A (zh) * 2021-01-15 2021-04-27 山东大学 一种具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产β-甘露聚糖酶中的应用
CN114958897A (zh) * 2022-06-14 2022-08-30 中农华威生物制药(湖北)有限公司 可高效表达饲用低温角蛋白酶的枯草芽孢杆菌构建方法

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1699577A (zh) * 2005-06-27 2005-11-23 江南大学 一种β－甘露聚糖酶基因和高效制备
CN101016531A (zh) * 2007-01-30 2007-08-15 武汉东方天琪生物工程有限公司 一种中性β－魔芋甘露聚糖酶制剂的生产方法
CN101041830A (zh) * 2006-03-21 2007-09-26 北京中天诺亚体育科技有限公司 一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体
CN101089185A (zh) * 2006-06-16 2007-12-19 罗科 一种新的β-甘露聚糖酶基因及其重组酶的生产方法
CN101781657A (zh) * 2009-01-19 2010-07-21 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 重组枯草芽孢杆菌分泌型表达载体
CN102154361A (zh) * 2011-01-17 2011-08-17 西北农林科技大学 一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体及构建方法
CN102367448A (zh) * 2011-09-28 2012-03-07 江南大学 一种高效表达且易于纯化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的构建方法
CN102373168A (zh) * 2011-10-10 2012-03-14 武汉东方天琪生物工程有限公司 一种高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其酶产品和生产方法
CN102888419A (zh) * 2012-11-01 2013-01-23 中国农业科学院饲料研究所 优化的甘露聚糖酶基因及其重组植物表达载体和应用
CN103540580A (zh) * 2013-10-19 2014-01-29 沅江浣溪沙酶技术有限公司 一种甘露聚糖酶及生产方法
CN103695394A (zh) * 2013-12-18 2014-04-02 青岛根源生物技术集团有限公司 一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用
CN104053780A (zh) * 2011-12-09 2014-09-17 丹尼斯科美国公司 用于在微生物中生产蛋白质的来自枯草芽孢杆菌的核糖体启动子
CN105505977A (zh) * 2015-11-23 2016-04-20 江南大学 一种信号肽及其在利用魔芋粉产l-谷氨酸重组菌中的应用
CN105602925A (zh) * 2016-01-26 2016-05-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用
CN105755033A (zh) * 2014-12-16 2016-07-13 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种提高α-淀粉酶表达量的通用型枯草芽胞杆菌整合表达载体
CN107236755A (zh) * 2017-05-31 2017-10-10 东北农业大学 利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素ad的方法及其制备方法

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1699577A (zh) * 2005-06-27 2005-11-23 江南大学 一种β－甘露聚糖酶基因和高效制备
CN101041830A (zh) * 2006-03-21 2007-09-26 北京中天诺亚体育科技有限公司 一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体
CN101089185A (zh) * 2006-06-16 2007-12-19 罗科 一种新的β-甘露聚糖酶基因及其重组酶的生产方法
CN101016531A (zh) * 2007-01-30 2007-08-15 武汉东方天琪生物工程有限公司 一种中性β－魔芋甘露聚糖酶制剂的生产方法
CN101781657A (zh) * 2009-01-19 2010-07-21 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 重组枯草芽孢杆菌分泌型表达载体
CN102154361A (zh) * 2011-01-17 2011-08-17 西北农林科技大学 一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体及构建方法
CN102367448A (zh) * 2011-09-28 2012-03-07 江南大学 一种高效表达且易于纯化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的构建方法
CN102373168A (zh) * 2011-10-10 2012-03-14 武汉东方天琪生物工程有限公司 一种高效表达β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其酶产品和生产方法
CN104053780A (zh) * 2011-12-09 2014-09-17 丹尼斯科美国公司 用于在微生物中生产蛋白质的来自枯草芽孢杆菌的核糖体启动子
CN102888419A (zh) * 2012-11-01 2013-01-23 中国农业科学院饲料研究所 优化的甘露聚糖酶基因及其重组植物表达载体和应用
CN103540580A (zh) * 2013-10-19 2014-01-29 沅江浣溪沙酶技术有限公司 一种甘露聚糖酶及生产方法
CN103695394A (zh) * 2013-12-18 2014-04-02 青岛根源生物技术集团有限公司 一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用
CN105755033A (zh) * 2014-12-16 2016-07-13 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种提高α-淀粉酶表达量的通用型枯草芽胞杆菌整合表达载体
CN105505977A (zh) * 2015-11-23 2016-04-20 江南大学 一种信号肽及其在利用魔芋粉产l-谷氨酸重组菌中的应用
CN105602925A (zh) * 2016-01-26 2016-05-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用
CN107236755A (zh) * 2017-05-31 2017-10-10 东北农业大学 利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素ad的方法及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SU GUO等: "Construction of a Shuttle Vector for Protein Secretory Expression in Bacillus subtilis and the Application of the Mannanase Functional Heterologous Expression", 《J. MICROBIOL. BIOTECHNOL》 *
VEITH,B.等: "登录号：AAU39670.1", 《GENBANK》 *
YAFENG SONG等: "High-efficiency secretion of #-mannanase in Bacillus subtilis through protein synthesis and secretion optimization", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
YUJI HATADA等: "Sequence of the gene for a high-alkaline mannanase from an alkaliphilic Bacillus sp. strain JAMB-750, its expression in Bacillus subtilis and characterization of the recombinant enzyme", 《EXTREMOPHILES》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111549050A (zh) * 2020-05-18 2020-08-18 湖北大学 适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用
CN111549050B (zh) * 2020-05-18 2021-09-17 湖北大学 适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用
CN112553134A (zh) * 2020-12-30 2021-03-26 江南大学 一种在枯草芽孢杆菌中表达α-淀粉酶的方法
CN112553134B (zh) * 2020-12-30 2022-09-06 江南大学 一种在枯草芽孢杆菌中表达α-淀粉酶的方法
CN112708624A (zh) * 2021-01-15 2021-04-27 山东大学 一种具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产β-甘露聚糖酶中的应用
CN112708624B (zh) * 2021-01-15 2022-05-03 山东大学 一种具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产β-甘露聚糖酶中的应用
CN114958897A (zh) * 2022-06-14 2022-08-30 中农华威生物制药(湖北)有限公司 可高效表达饲用低温角蛋白酶的枯草芽孢杆菌构建方法
CN114958897B (zh) * 2022-06-14 2023-12-22 中农华威生物制药(湖北)有限公司 可高效表达饲用低温角蛋白酶的枯草芽孢杆菌构建方法

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