CN102154361A - 一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达木聚糖酶的表达载体，以及该表达载体的构建方法，所述表达载体包括大肠杆菌复制子ColE1、枯草芽孢杆菌复制子B.sub.rep、筛选标记以及启动子，在所述启动子下游设有一信号肽序列和一木聚糖酶XynA基因序列，其以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌为穿梭载体，通过筛选出针对木聚糖酶具有强表达的信号肽，可实现木聚糖酶的高效表达。

Description

一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体及构建方法

技术领域

本发明涉及一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体，及其构建方法。

背景技术

据世界粮农组织统计，截至2010年世界饥饿人口已超过10亿，随着人口增长和畜牧业的发展，人畜争粮矛盾也日渐突出，同时畜牧业的高速发展也给世界带来了严重的环境问题。在这种情况下，寻找开发新的饲料资源，提高现有饲料资源的利用效率就显的尤为重要。纤维素和半纤维素是一种可再生自然资源，在自然界中含量极为丰富。因此充分开发纤维素和半纤维素，可有效拓展我国饲料资源开发范围，同时减缓人畜争粮的矛盾。

木聚糖(Xylan)是植物半纤维素的主要成分，谷物饲料中存在的木聚糖是阻碍营养物质消化的抗营养因子，它使饲料消化利用率大大降低，影响畜禽的生长发育。木聚糖是一种多聚五碳糖，主要成分是D-木糖，它与纤维素、果胶等结合在一起形成复杂的超分子结构，仅靠自然条件的单一酶类很难降解利用它。目前人们通过化学法和生物酶法来对木聚糖进行降解，虽然化学方法的降解效率比起自然降解的效率有所提高，但是这种方法操作复杂，降解成本高，污染环境的同时也会危害到操作者自身的健康。因此现阶段人们经常用采用生物酶法来降解木聚糖，利用的主要生物酶是木聚糖的专属水解酶-木聚糖酶。

木聚糖酶是一类将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的复合水解酶系，其中β-1，4-D-木聚糖酶负责水解木聚糖主链骨架，是酶系中的关键酶。这种酶在提高饲料转化率、发酵成产乙醇、纸浆漂白等众多领域有着十分重要的应用价值。利用基因工程的方法改造木聚糖酶基因、优化分泌表达系统从而获得优良的酶工程菌具有重要的工业生产意义。

在木聚糖酶基因克隆表达中常使用大肠杆菌作为分泌和表达宿主，具有遗传背景清楚、表达周期短、转化效率高、操作简单等优点，因此也是目前掌握最为成熟的表达系统。但是大肠杆菌也有其自身的不足之处：它的表达蛋白易形成包涵体，不利于下游的纯化加工，同时木聚糖酶的表达蛋白无法分泌至胞外，也为酶活测定和直接利用带来麻烦。枯草芽孢杆菌则是继大肠杆菌后又一广泛使用的表达系统，它与大肠杆菌一样遗传背景清楚，培养简单，易操作，但同时它没有致病性，并且可以经由信号肽引导将表达蛋白分泌至培养基中，表达产物多数具有天然构象和生物活性，弥补了大肠杆菌表达系统的不足。

枯草芽孢杆菌具有很强的向胞外分泌蛋白(中性蛋白酶A和B、碱性蛋白酶、枯草多肽酶F、α-淀粉酶)的能力，蛋白分泌主要通过Sec途径，其次是Tat途径。其中大多数细菌分泌蛋白都通过Sec转运系统分泌。

Sec途径又叫普通分泌途径，目前大部分文献报道中外源表达蛋白均通过Sec途径分泌，枯草芽孢杆菌的分泌蛋白约有300种(Manting EH etal.2000)，几乎所有分泌蛋白都是经由Sec途径转移分泌至胞外。Sec转运系统包括信号肽、信号肽酶、SecYEG通道以及各种细胞因子，其中SecA、SecD、SecE、SecF、SecY、ffh、ftsY编码蛋白参与整个转运过程。SecA是ATP酶，通过水解ATP提供分泌蛋白前体穿膜的驱动力，SecE、SecY和SecG组成蛋白转移极性通道-SecYEG，SecD和SecF则是蛋白转移酶的辅助成分。

在Sec途径中，核糖体首先合成分泌蛋白前体，该分泌蛋白前体带有分泌蛋白的标记-信号肽，蛋白处于未折叠状态。随后Sec蛋白(SecA)的ATP酶活性水解ATP和质子原动力，分泌蛋白前体在信号肽的引导下，通过细胞膜上的极性通道转移至细胞膜外，通道蛋白由一组膜蛋白组成，负责定位和转移分泌蛋白的细胞质(周冰和张惟材2004)，在整个转移过程中分泌蛋白体以肽链形式存在。穿过细胞膜之后，信号肽酶切除信号肽，蛋白质正确折叠并穿过细胞壁被释放至培养基中。由此过程可以看出信号肽是引导外源蛋白跨膜分泌的关键元件。

信号肽是引导蛋白质穿过细胞膜的一段连续的氨基酸序列。一般由10-40个左右的氨基酸残基构成，它包括三个区域：氨基端区、疏水端区和羧基端区。氨基端区的N端由带正电荷的氨基酸组成，又称为碱性氨基末端或N端，常见的氨基酸有赖氨酸和精氨酸。疏水端区由20个或20个以上的中性氨基酸组成，在与膜脂接触时形成α螺旋结构，常见氨基酸有亮氨酸、异亮氨酸等，又称为H端；羧基端区的C端含有小分子氨基酸，主要有甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等，含有信号肽酶的切割位点，亦称加工区或C端。其中疏水区的长度和疏水性在分泌中起着重要的作用。

但特定的高效分泌表达蛋白调控元件对其他基因不一定具有普遍适用性，UlfBrockmeier等(2006)将两种脂肪酶cutinase和esterase分别作为异源目的蛋白对枯草芽孢杆菌sec途径中的148个信号肽进行了筛选。结果表明，这两种目的蛋白的高效表达信号肽之间并没有对应关系，即使是同一种蛋白，在不同信号肽的引导作用下，虽然大部分都能将其引导表达，但是分泌效率也相差甚远。

综上所述，我们可以看出，首先，信号肽的一些指标，如N端正电荷数目、疏水性等并不能决定信号肽的引导分泌效率。对于每种异源蛋白的分泌必须筛选出相对应的信号肽。

其次，信号肽数量多。就目前发现而言Sec途径有148个信号肽，Tat途径有27个信号肽，数量众多的信号肽对木聚糖酶有不同的引导分泌效率，在进行木聚糖酶的引导表达过程中，很难筛选出高效引导木聚糖酶表达的信号肽，为构建木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体消耗大量人力物力。

(参见期刊Ball A S，Mc Carthy A J.1989.Production and properties of xylanasefrom acti-nomycetes.J.Appl Bacteriol，66：439～444.

Berks B C.1996.A common export pathway for proteins binding complex redoxcofactors？.Mol Microbiol，22：393～404.

M D Gibbs，R A Reeves and P L Bergquist.1995.Cloning，sequencing andexpression of xylanase gene from the extreme thermophile Dictyoglomus thermophilumRt46B.1 and activity of the enzyme on fiber-bound subtracte.Appl EnvironMicrobiol，61(12)：4403～4408.

Nielsen H，Engelbrecht J，Brunak S.1997.Identification of prokaryotic andeukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.Protein Eng，10：1～6.

Ulf Brockmeier，Michael Caspers，Roland Freudl.2006.Systematic Screening of AllSignal Peptides from Bacillus subtilis：A Powerful Strategy in Optimizing HeterologousProtein Secretion in Gram-positive Bacteria.J.Mol.Biol，362：393～402.)

发明内容

本发明的目的在于提供一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达的载体。

本发明所述的木聚糖酶表达载体，包括大肠杆菌复制子ColE1、枯草芽孢杆菌复制子B.sub.rep、筛选标记以及启动子，在所述启动子下游设有一信号肽序列和一木聚糖酶XynA基因序列。

本发明中，信号肽序列，为Sec途径信号肽序列，是根据Ulf Brockmeier(2006)报道，选择的30个Sec途径信号肽将测序正确并酶切成功的信号肽片段连接至信号肽筛选载体上，如可以是PhoB、Bpr、Vpr、YnfF、LipA或YjdB等，可用的信号肽序列详见附图2表中所列，本发明中，优选的Sec途径信号序列为PhoB，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明中，编码该PhoB信号肽序列的核苷酸序列可以由本领域技术人员，根据所需要编码的氨基酸序列而设计出多种，这些，是本领域技术人员根据现有技术所能知晓并获得的，编码PhoB信号肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，也可以使是与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少70％同一性，优选80％同一性、更优选90％、95％、97％、99％同一性的核苷酸序列。

本发明中，木聚糖酶基因XynA是事先去掉自身信号肽后的成熟肽编码基因，编码木聚糖酶成熟氨基酸序列的基因为具有与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列至少70％同一性的核苷酸序列，优选为具有至少80％同一性的核苷酸序列，更优选为具有85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、100％同一性的核苷酸序列，其编码木聚糖酶的成熟肽(或称为成熟氨基酸序列)。当然，本发明根据需要，也可将木聚糖酶基因换成其它形式的基因，以构建具有表达不同多肽、酶或蛋白的载体。

本发明中，所述启动子可以是本领域常用的启动子，如可以是Lac乳糖启动子、tac启动子、trc启动子、T7启动子、麦芽糖启动子Pglv等，所选用的启动子，是本领域技术人员根据现有技术所能熟知的，本发明中，优选的启动子是麦芽糖启动子Pglv。

本发明中，所用的筛选标记可以是各种抗性，如氨苄抗性、新霉素抗性、链霉素抗性、潮霉素抗性、壮观霉素抗性等。

本发明中，构建所述木聚糖酶表达载体的起始载体是大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148。

具体地，本发明所述木聚糖酶表达载体(简写成“PSX”)具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，其结构示意图详见附图4。

本发明的再一目的在于提供一种含有本发明所述木聚糖酶表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞可以是大肠杆菌、枯草杆菌或酵母菌。

本发明的还一目的在于提供一种构建本发明所述木聚糖酶表达载体的方法，具体包括如下步骤：

筛选载体的构建

首先构建大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ148(参见文献：白晓婷，张爱玲，

曹要玲.大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及应用[J].畜牧与兽医，2006，38(9)：8-10)

在该文献中构建的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103，利用本试验室保存的质粒pBluskm-PglvM(把M去掉)和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ103来构建pGJ148。用ApaI和EcoRI双酶切pBluskm-Pglv，得到启动子片段Pglv。用DNA回收试剂盒分别回收约250bp的Pglv和消化处理后的pGJ103。用DNA连接酶将回收得到的三个片段连接后电转化入大肠杆菌DH5α。将重组菌接入含氯霉素抗性的液体LB中过夜培养后提取质粒进行酶切鉴定。

为了在WB700中筛选重组子，要更换pGJ148抗性基因。以pGJ148为模板，扩增获得去氯霉素骨架载体并在两端引入BglII酶切位点，再以shuttle为模板扩增壮观霉素抗性基因(Sper+)在两端引入BamHI酶切位点，然后分别用BglII和BamHI进行酶切，胶回收后连接这两个片段获得到中间载体pPS。

以短小芽孢杆菌BYG5-20基因组为模板扩增木聚糖酶基因XynA去掉自身信号肽后的编码区，用BamHI和SacI消化后连接至pPS相应位点内，构建pPSX。

BYG5-20是实验室先前所筛出的能分泌耐碱性木聚糖酶的短小芽孢杆菌。(参见文献：曹要玲，白晓婷.1株产碱性木聚糖酶高产菌株的筛选、产酶条件优化及其木聚糖酶基因的克隆[J].畜牧与兽医，2006，38(9)：11-14)

由于信号肽克隆位点上两个酶切位点较近，而且信号肽片段较短，因此很难估计载体双酶切效率以及筛选连接有信号肽阳性克隆，因此我们在信号肽克隆位点EcoRI至BamHI之间插入了绿色荧光蛋白基因GFP，方便信号肽的更换，将筛选载体命名为pGPSX。

分泌表达载体的构建：

根据UlfBrockmeier(2006)报道，选择30个Sec途径信号肽将测序正确并酶切成功的信号肽片段连接至信号肽筛选载体pGPSX上GFP所在位置，从而构建了具有不同信号肽的木聚糖酶分泌表达载体。然后将这些载体转化枯草芽孢杆菌WB700中，在Spec(壮观霉素抗性)和Cm(氯霉素抗性)抗性培养基上筛选阳性克隆，扩大培养后保存菌液。

筛选出一种能够引导木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达的信号肽

用DNS法测定酶活，检测不同信号肽对重组枯草芽孢杆菌分泌木聚糖酶的影响，从而筛选出一种能够引导木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达的信号肽。

(4)木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体构建

将筛选出的能够引导木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达的信号肽连接至信号肽筛选载体pGPSX上GFP所在位置，从而构建了一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体PSX。

本发明的还一目的在于提供一种利用本发明所述木聚糖酶表达载体生产木聚糖酶的方法，它是将本发明所构建的木聚糖酶表达载体导入合适的宿主细胞中，在适当培养基的条件下，发酵表达得到外源蛋白，合适的宿主细胞可以是大厂杆菌、枯草杆菌，优选为枯草芽孢杆菌，更优选为枯草芽孢杆菌WB700。

本发明有如下优势：

本发明筛选出针对木聚糖酶具有强表达的信号肽，为木聚糖酶的高效表达奠定基础。

本发明构建木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体为以后构建木聚糖酶的高效表达系统节省人力物力。

附图说明

图1是扩增片段引物序列图。

图2是不同信号肽对木聚糖酶活性率的影响。

图3是本发明高效表达载体的酶切鉴定图，其中泳道M是DNA marker，泳道1、3是载体PSX用BamHI-HindIII酶消化后的图，泳道2、4是载体PSX用EcoRI-HindIII酶消化后的图。由于信号肽片段只有100bp左右，直接酶切检测较为困难，而在XynA基因靠近3’段有HindIII酶切位点，因此对获得的分泌表达载体分别用EcoRI-HindIII和BamHI-HindIII进行两组双酶切，两组酶切得到的较小片段分别为640bp左右和540bp则证明信号肽连接成功图。

图4是木聚糖酶表达载体PSX物理图谱。

具体实施方式

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

材料与试剂：主要限制性内切酶、pGME-T Vector购自Promega公司，T4连接酶购自Fermentas公司，Ex Taq酶，碱性磷酸酶，DNA make购自TAKALA公司，细菌基因组提取、质粒提取、胶回收试剂盒购自OMEGA公司，抗生素、桦木木聚糖购自Sigma公司，琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxiod，Tris(pH值8.0)、饱和的苯酚、氯仿等试剂均为国产分析纯，测序服务由南京金斯瑞公司提供。

LB培养基培养基按文献配制，各种抗生素培养基中浓度为：氨苄青霉素(Amp)100mg/L，壮观霉素(Spec)50mg/L，氯霉素(Cm)7.5mg/L。大肠杆菌质粒提取、DNA的酶切、电泳、DNA片断连接、转化均参照萨姆布鲁克(2002)进行。枯草杆菌感受态制备、转化参考祝发明(2006)博士论文。

1、大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ148构建

(参见文献：白晓婷，张爱玲，曹要玲.大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及应用[J].畜牧与兽医，2006，38(9)：8-10)

在该文献中构建的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103，利用本试验室保存的质粒pBluskm-PglvM(也可从市场直接购买得到，为商业化载体)和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ103来构建pGJ148。

用ApaI和EcoRI双酶切pBluskm-Pglv，得到启动子片段Pglv。用DNA回收试剂盒分别回收约250bp的Pglv和消化处理后的pGJ103。

酶切反应体系：

DNA                       10μL

内切酶                    各1μL

10×buffer                2μL

BSA                       0.2μL

ddH2O                     补足20ul

连接反应体系：

10×buffer                1μL

载体片段                3μL

插入片段                5μL

T4DNA连接酶             1μL

用DNA连接酶将回收得到的三个片段连接后电转化入大肠杆菌DH5α。将重组菌接入含氯霉素抗性的液体LB中过夜培养后提取质粒进行酶切鉴定，构建得到载体pGJ148。

2、筛选载体各部件扩增

以图1所示序列P1/P2为引物对，以质粒pGJ148为模板扩增获得2.7kb的pGJ148去氯霉素骨架并在两端引入BglII酶切位点，上面含有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌复制子，以及麦芽糖诱导性启动子Pglv。PCR反应条件为：94℃变性30sec；52℃退火30sec；72℃延伸180sec；35个循环，最后电泳回收PCR产物。

引物：P1    5’GCGAGATCTTAGTTTTTAGATTTTGGAAGTG 3，

P2    5’CCAGATCTTTACTCCAAAATCTAAATTCACG 3’

PCR反应体系：

上游引物(0.3pmol/L)                1ul

下游引物(0.3pmol/L)                1ul

模板                               1ul

dNTP                               4ul

ExTaq                              0.25ul

10×Buffer                         5ul

ddH2O                              补足至50ul

以图1所示序列P3/P4为引物对，以质粒Shuttle做为模板获得了1.0kb的壮观霉素抗性基因，在两端引入BamHI酶切位点。PCR反应条件为：94℃变性30sec；54℃退火30sec；72℃延伸60sec；35个循环，最后电泳回收PCR产物。

引物：P3    5’TAGGATCCGAATGGCGATTTTC 3’

P4    5’CCCGGATCCTTATAATTTTTTTAATCTG 3’

PCR反应体系同上。

以图1所示序列P5/P6引物对，以短小芽孢杆菌BYG5-20基因组为模板扩增木聚糖酶基因XynA去掉自身信号肽后的编码区。PCR反应条件为：PCR反应条件为：94℃变性40sec；57℃退火40sec；72℃延伸45sec；34个循环，最后电泳回收PCR产物。

引物：P5    5’CAGGATCCAGAACCATTACGAATAATG 3’

P6    5’TTGAGCTCTTAGTTGCCAATAAACAGC 3’

PCR反应体系同上。

以图1所示序列P7/P8引物对，以pLRES2-ZSGreen1质粒为模板扩增获得了700bp绿色荧光蛋白基因，在两端引入EcoR I和BamH I酶切位点。PCR反应条件为：94℃变性30sec；52℃退火30sec；72℃延伸90sec；35个循环，最后电泳回收PCR产物。

引物：P7    5’TATGAATTCTCAGGGCAAGGCGGA 3’

P8    5’ATAGGATCCATGGCCCAGTCCAAGC 3’

PCR反应体系同上。

将以上获得的片段连接至pGEM-T Vector载体上，获得4个中间载体p148Cm-TV、pSpec-TV、pXynA-TV、pGFP-TV。

连接反应体系：

2×buffer                5μL

pGEM-T Vector                1μL

PCR产物                      3μL

T4DNA连接酶                  1μL

3、筛选载体的构建

用Bgl II和BamH I分别消化p148Cm-TV和pSpec-TV，将两个片段连接，得到载体pPS。

酶切反应体系：

DNA                          10μL

内切酶                       各1μL

10×buffer                   2μL

BSA                          0.2μL

ddH2O                        补足至20ul

连接反应体系：

10×buffer                   1μL

载体片段                     3μL

插入片段                     5μL

T4DNA连接酶                  1μL

BamH I和Sac I消化pXynA-TV，获得木聚糖酶基因编码区去掉自身信号肽片段，将其连接至pPS上，获得载体pPSX。

酶切反应体系和连接反应体系同上。

用EcoR I和BamH I酶切pGFP-TV获得GFP基因编码区，连接至pPSX相应位点获得最终筛选载体pGPSX。

酶切反应体系和连接反应体系同上。

4、分泌表达载体的构建

将测序正确并酶切成功的信号肽片段连接至木聚糖酶筛选载体pGPSX上GFP所在位置，从而构建了具有不同信号肽的木聚糖酶分泌表达载体。

5.筛选出一种能够引导木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达的信号肽

将上述分泌表达载体转化枯草芽孢杆菌WB700中，在Spec(壮观霉素抗性)和Cm(氯霉素抗性)抗性培养基上筛选阳性克隆，扩大培养后保存菌液。取50ul上述菌液接种至含5ml Spec抗性LB培养基的试管中扩大培养12h，吸取扩大后的菌液600ul接种到30mlLB中37℃培养24小时，然后在4℃8000r/min离心10min收集上清。取1.8ml的0.5％木聚糖酶溶液于10ml加塞玻璃管中，加入稀释后的上清液0.2ml，50℃水浴10min，取出后立即加入DNS试剂2ml，沸水浴5min，流水冷却后，用蒸馏水定容至10ml，混匀后在波长540nm下测吸光值(OD)。见图2及表1。

表1  不同位点对应的信号肽

1	Pel	16	YndA
				2	Bpr	17	YnfF
3	Csn	18	AprE
				4	AmyE	19	PenP
5	LipB	20	BglC
				6	PhoB	21	YbdN
7	YbbE	22	DacB
				8	YurI	23	PhrC
9	YjfA	24	PhrK
				10	Vpr	25	LipA
11	SacC	26	YfhK
				12	YddT	27	LytB
13	Epr	28	YhfM
				14	YobB	29	YckD
15	BglS	30	YjdB

比较具有不同信号肽的木聚糖酶酶活高低，从图3和表1中可以看出，6号点位对应的信号肽表达载体表达所得的木聚糖酶活性明显要强于其它信号肽表达载体表达所得木聚糖酶的活性，最终确定我们所需要的信号肽PhoB-能够引导木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达。

6.木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体构建

将筛选出的能够引导木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达的信号肽PhoB连接至信号肽筛选载体pGPSX上GFP所在位置，从而构建了一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体PSX。

根据木聚糖酶酶活的高低验证表达载体PSX的表达效果，根据附图2可以看出，含有信号肽PhoB表达载体即PSX在WB700中表达的木聚糖酶酶活比含有其他信号肽的表达载体表达的木聚糖酶酶活高，目前测出的酶活可高达98U/ml。证明了表达载体PSX对木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达具有一定的优越性。

Claims (10)

1.一种木聚糖酶表达载体，包括大肠杆菌复制子ColE1、枯草芽孢杆菌复制子B.sub.rep、筛选标记以及启动子，在所述启动子下游设有一信号肽序列和一木聚糖酶XynA基因序列。

2.权利要求1所述的木聚糖酶表达载体，其特征在于所述的信号肽序列为PhoB，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的表达载体，其中表达所述信号肽PhoB的编码基因为具有与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列至少70％同一性的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的木聚糖酶表达载体，其特征是所述的木聚糖酶XynA基因的碱基序列具有与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列至少70％同一性的核苷酸序列。

5.权利要求1所述的木聚糖酶表达载体，其特征是所述的启动子为麦芽糖启动子Pglv。

6.权利要求1所述的木聚糖酶表达载体，其特征是所述的筛选标记为壮观霉素抗性Spec。

7.含有权利要求1-6中任意一权利要求所述木聚糖酶表达载体的宿主细胞。

8.构建权利要求1-6中任意一权利要求所述木聚糖酶表达载体的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)构建载体pGJ148；

(2)以pGJ148为模板扩增获得去氯霉素骨架载体并在两端引入BglII酶切位点，再以shuttle为模板扩增壮观霉素抗性基因(Sper+)在两端引入BamH1酶切位点，然后分别用Bgl II和BamH I进行酶切，胶回收后连接这两个片段获得到中间载体pPS；

(3)以短小芽孢杆菌BYG5-20基因组为模板扩增木聚糖酶基因XynA去掉自身信号肽后的编码区，用BamH I和Sac I消化后连接至pPS相应位点内，构建pPSX；

(4)在pPSX载体的EcoR I至BamH I之间插入了绿色荧光蛋白基因GFP，将筛选载体命名为pGPSX；

(5)将筛选出的能够引导木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达的信号肽PhoB的编码基因连接至信号肽筛选载体pGPSX上GFP所在位置，构建得到木聚糖酶表达载体PSX。

9.利用权利要求1至6中任一项权利要求所述的表达载体生产木聚糖酶的方法，是将所述表达载体导入宿主细胞，发酵表达得到外缘蛋白。

10.权利要求9所述的方法，其特征是所述的宿主细胞为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

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