CN101792729B - 一种高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。该基因工程菌是携带2种重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，所述重组质粒为携带α-溶血素(α-hlyA)途径中特有基因的质粒pSTV28及含有角质酶-hlyAs基因的质粒pET20b(+)。该基因工程菌的构建：包括构建两个关键重组质粒并分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得高效分泌重组角质酶的基因工程菌。用所述的基因工程菌生产角质酶包括液体培养和诱导表达两个步骤。以嗜热单胞菌Thermobifida fusca WSH03-11角质酶Tfu_0883作为报告蛋白，摇瓶发酵表明角质酶胞外产量是306U/mL，为本研究室前期工作采用II型分泌途径产量的1.7倍，实现了角质酶的高效分泌表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
角质酶是一种多功能酶，可水解各种可溶性酯类、乳化的甘油三酯、不溶性脂肪酸酯、不溶性多聚体角质等，广泛用于洗涤剂、食品、农业、化学工业中，尤其在纺织工业中，可用于棉纤维的生物精炼以及合成纤维对苯二甲酸乙二酯(PET)的改性，目前上述两种工艺均采用传统碱处理工艺，存在水耗、能耗大，对纤维损伤大，环境污染等缺陷，因此，酶法处理工艺作为一种节能减耗的环境友好技术，将成为染整行业发展的趋势。目前对角质酶的研究集中在真菌角质酶上，但存在表达量低、热稳定性差等问题。本研究室前期研究中对嗜热放线菌(Thermobifida fusca WSH03-11)角质酶进行了基因鉴定，分泌表达并对其酶学性质进行了深入的研究，表明它较真菌角质酶具有明显优势(陈坚，吴敬，陈晟.一种耐热角质酶及其编码基因和表达.申请号200710026074.2)。
大肠杆菌(Escherichia coli)遗传背景清楚，培养周期短，操作简单，是目前应用最广泛、最成功的外源重组蛋白表达系统。外源重组蛋白在E.coli中合成后可定位在胞内、周质空间、胞外。由于胞外分泌表达有助于蛋白质的正确折叠，减少包涵体的形成，避免胞内蛋白酶的降解，而且大大简化下游纯化过程，因此在大规模工业化生产中具有绝对优势。大肠杆菌中存在5种分泌途径，II型分泌途径在外源重组蛋白分泌表达中应用最普遍，II型分泌途径为“两步过渡式”，先介导蛋白跨内膜于周质，再跨外膜实现胞外基质分泌。大肠杆菌绝大部分自身蛋白跨膜转运使用II型分泌途径中由SecB介导的Sec分泌途径，因此目前绝大部分外源重组蛋白也常采用Sec途径进行分泌表达。
与II型分泌途径相比，I型分泌途径为“一步介导式”，直接介导蛋白从胞内分泌至胞外。I型分泌途径组成简单，只包含3种转运蛋白hlyB、hlyD和TolC，其中hlyB、hlyD为该途径特有的内膜蛋白，TolC为位于外膜的多系统通用组分，三者可形成连接内外膜的跨膜通道，将C端连接α-溶血素信号肽的重组蛋白不经过周质空间而直接分泌至胞外。但I型分泌途径也有两个不可避免的缺点：第一，信号肽在分泌过程中不被切除，重组蛋白在分泌至胞外后仍然连接信号肽，需要切除才能获得天然蛋白；第二，通常需要共表达相关系统元件来提高分泌效率，但这会加重宿主的代谢负担，往往导致表达量低(F.J.M.Murgulhao，D.K.Summers，G.A.Monteiro，Recombinant proten secretion in Escherichiacoli，Biotechnology Advances 23(2005)177-202)。因此，各国科研工作者，很少采用此途径构建高效分泌表达外源蛋白的基因工程菌。
近年来关于发酵法生产角质酶的报道较多，陈晟采用大肠杆菌II型分泌途径中的Sec途径对Thermobifida fusca WSH03-11角质酶进行了分泌表达，胞外产酶为180U/mL(Chen S，Tong X，Woodard RW，Du GC，Wu J，Chen J，Identificationand Characterization of Bacterial Cutinase，The Journal of Biological Chemistry，2008，283(28)25854-25862)。张芙华采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WSHB06-07)发酵生产角质酶，通过一系列发酵过程的优化策略，胞外酶活达170U/mL(张芙华，陈晟，张东旭，华兆哲，陈坚，吴敬，pH两阶段控制策略发酵生产重组角质酶，中国生物工程杂志，2008，28(5)，59-64)。虽然国内外市场对角质酶需求量较大，但市场上未见商品化的角质酶产品，其主要原因在于原有菌种角质酶表达量低，市场上迫切需要一株角质酶高产菌。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题是提供一种高效分泌表达重组角质酶基因工程菌的构建方法。
为解决上述问题，本发明的技术方案是：分别构建2个重组质粒hlyBD/pSTV28和Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，分步转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗生素筛选得到高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌。
具体过程如下：
构建所述重组质粒hlyBD/pSTV28，根据hlyBD的基因设计引物P1、P2。
P1：5’-CggCgAgCTCggATTCTTgTCATAAAATTg-3’
P2：5’-CCACggATCCTTAACgCTCATgTAAAC-3’
以E.coli CFT073总DNA为模板，以P1、P2为引物，PCR扩增hlyBD基因。PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在94℃变性1min后开始循环，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸4min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。扩增得到3579bp的PCR片段，割胶回收，回收片段与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含30mg/L氯霉素的LB平板。经37℃培养过夜，挑选单克隆，接入含30mg/L氯霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养8-10h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因全长3579个核苷酸，和hlyBD基因序列完全相同。将pSTV28质粒和hlyBD基因进行BamH I和Sac I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化产物涂布含30mg/L氯霉素的LB固体平板，经37℃培养过夜，挑选转化子于含30mg/L氯霉素的LB液体培养基进行培养，然后抽提质粒，得到富集的hlyBD/pSTV28质粒。
构建所述重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，根据角质酶、hlyAs的基因设计引物两对引物P3、P4和P5、P6。
P3：5’-gTAATCCATATggCCAACCCCTACgAgCgC-3’
P4：5’-gACTTCCATAggCTAAgAACgggCAggTggAg-3’
P5：5’-CTCCACCTgCCCgTTCTTAgCCTATggAAgTC-3’
P6：5’-CCgCTCgAgTTATgCTgATgCTgTCAAAg-3’
以本实验室前期构建的Tfu_0883/pET20质粒DNA为模板，以P3、P4为引物，PCR扩增角质酶的基因(Thermobifida fusca WSH03-11 )。以E.coliCFT073总DNA为模版，以P5、P6为引物，PCR扩增hlyAs的基因。PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为94℃变性1min后开始循环，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃分别延伸1min和20s，共30个循环后，再于72℃延伸10min。分别扩增得到783bp和180bp的PCR片段，割胶回收。然后再以角质酶和hlyAs基因PCR割胶回收片断为模板，以P3、P6为引物，再进行PCR反应。扩增得到963bp的PCR片段，割胶回收，回收片段与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37℃培养过夜，挑选单克隆，接入含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养8-10h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因全长963个核苷酸，和角质酶及hlyAs基因的序列均完全相同。将pET20b(+)质粒和角质酶-hlyAs基因进行Nde I和Xho I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后抽提质粒，得到富集的Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)质粒。
将所述重组质粒hlyBD/pSTV28电击转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氯霉素(30mg/L)-LB平板上经37℃培养8-10h，挑选转化子(hlyBD-pSTV28/E.coli BL21(DE3))在LB液体培养基中37℃培养8-10h，得到包含hlyBD/pSTV28重组质粒的宿主菌E.coli BL21(DE3)。
将所述重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)电击转化包含hlyBD/pSTV28重组质粒的E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氨苄青霉素(100mg/L)-氯霉素(30mg/L)-LB平板上经37℃培养8-10h，挑选转化子(Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/hlyBD-pSTV28/E.coli BL21(DE3))。
本发明要解决的另一个技术问题是提出一种高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌，该基因工程菌是携带2种重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，所述重组质粒为携带α-溶血素(α-hlyA)途径中特有基因的质粒pSTV28及含有角质酶-hlyAs基因的质粒pET20b(+)，摇瓶发酵表明角质酶胞外产量可达到306U/mL。
发酵过程如下：
第一步：液体培养
将所述的基因工程菌接入LB(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)液体培养基中37℃培养8-10h，以5％接种量接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L，KH2PO4 2.31g/L)发酵液体培养基；
第二步：诱导表达
37℃培养2h时后，加入0.4mM IPTG进行诱导，后降温至25℃培养，48h时后，发酵液离心，上清液为角质酶的粗酶液。
角质酶活性的测定方法：
以对硝基苯丁酸酯(pNPB)为底物，采用分光光度法在20℃下测定。反应体系为1ml，包括960μl缓冲液(20mM Tris-HCl，10mM NaCl，50mM sodiumtaurodeoxycholate，pH 8.0)，20μl酶液，20μlpNPB(1mM，乙腈中保存)，在405nm处，记录对硝基酚的生成速率。酶活定义：20℃下，每分钟催化对硝基苯丁酸酯生成1μM对硝基酚的酶量即为一个酶活力单位。
本发明的优点在于：
(1)采用大肠杆菌α-溶血素途径高效分泌表达外源角质酶基因的方法，构建一株角质酶基因工程菌，摇瓶发酵胞外产量高达306U/mL。该菌株可用于角质酶的工业化生产，此构建方法也为其他重要发酵产品的工业化生产提供一种新思路。
(2)表达产物以活性形式存在于培养基中，无包涵体复性等步骤；从培养基上清中提取比较简单，宿主蛋白污染少，回收率高。
因而本发明提供的基因工程菌及利用该菌生产角质酶，产量高，提取工艺简单，成本低；该菌株的构建方法效果明显，具有分泌表达蛋白含量高等优点。
附图说明
图1重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)的构建
图2重组质粒hlyBD/pSTV28的构建
具体实施方式
实施例1：E.coli CFT073总DNA的提取
将E.coli CFT073菌株在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中培养过夜，取3mL菌液，12000rpm离心2min收集菌体，按上海生工生物工程技术服务有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒方法(EZ SpinColumn Bacterial Genomic DNA Isolation Kit UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒)提取E.coli CFT073总DNA；
实施例2：hlyBD/pSTV28重组质粒的构建
根据hlyBD的基因序列设计引物P1、P2。
P1：5’-CggCgAgCTCggATTCTTgTCATAAAATTg-3’
P2：5’-CCACggATCCTTAACgCTCATgTAAAC-3’
以E.coli CFT073总DNA为模板，以P1、P2为引物，PCR扩增hlyBD的基因。PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在94℃变性1min后开始循环，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸4min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。扩增得到3579bp的PCR片段，割胶回收，回收片段与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含30mg/L氯霉素的LB平板。经37℃培养过夜，挑选单克隆，接入含30mg/L氯霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养8～10h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因全长3579个核苷酸，hlyBD的基因序列完全相同。将pSTV28质粒和hlyBD基因进行BamH I和Sac I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化产物涂布含30mg/L氯霉素的LB固体平板，经37℃培养过夜，挑选转化子于含30mg/L氯霉素的LB液体培养基进行培养，然后提取质粒，得到重组质粒hlyBD/pSTV28。
编码hlyBD的DNA序列如下：
SEQ.ID.NO：1：
gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgctcgaagc cagcagcggc 60
atggattctt gtcataaaat tgattatggg ttatacgccc tggagatttt agcccaatac 60
cataacgtct ctgttaaccc ggaagaaatt aaacatagat ttgacacaga cgggactggt 120
ctgggattaa cgtcatggtt gcttgctgcg aaatctttag aactaaaggt aaaacaggta 180
aaaaaaacaa ttgaccgatt aaactttatt tctttgcccg cattagtctg gagagaggat 240
ggacgtcatt ttattctgac taaagtcagt aaagaagcaa acagatatct tatttttgat 300
ctggagcaac gaaatccccg tgttctcgaa cagtctgagt ttgaggcgtt atatcagggg 360
catattattc ttattgcttc ccgttcttct gttaccggga aactggcaaa atttgacttt 420
acctggttta tccctgccat tataaaatac agaaaaatat ttattgaaac ccttgttgta 480
tctgtttttt tacaattatt tgcattaata accccccttt tttttcaggt ggttatggac 540
aaagtattag tacacagggg gttttcaacc cttaatgtta ttactgtcgc attatctgtt 600
gtggtggtgt ttgagattat actcagcggt ttaagaactt acatttttgc acatagtaca 660
agtcggattg atgttgagtt gggtgccaaa ctcttccggc atttactggc gctaccgatc 720
tcttattttg agagtcgtcg tgttggtgat actgttgcca gggtaagaga attagaccag 780
atccgtaatt ttctgacagg acaggcatta acatctgttc tggacttatt attttcattc 840
atattttttg cggtaatgtg gtattacagc ccaaagctta ctctggtgat cttattttcg 900
ctgccctgtt atgctgcatg gtctgttttt attagcccca ttttgcgacg tcgccttgat 960
gataagtttt cacggaatgc ggataatcaa tctttcctgg tggaatcagt cacggcgatt 1020
aacactataa aagctatggc agtctcacct cagatgacga acatatggga caaacaattg 1080
gcaggatatg ttgctgcagg ctttaaagtg acagtattag ccaccattgg tcaacaagga 1140
atacagttaa tacaaaagac tgttatgatc atcaacctgt ggttgggagc acacctggtt 1200
atttccgggg atttaagtat tggtcagtta attgctttta atatgcttgc tggtcagatt 1260
gttgcaccgg ttattcgcct tgcacaaatc tggcaggatt tccagcaggt tggtatatca 1320
gttacccgcc ttggtgatgt gcttaactct ccaactgaaa gttatcatgg gaaactggca 1380
ttaccggaaa ttaatggtaa tatcactttt cgtaatatcc ggtttcgcta taagcctgac 1440
tctccggtta ttttagataa tatcaatctc agtattaagc agggggaggt tattggtatt 1500
gtcggacgtt ctggttcagg aaaaagcaca ttaactaaat taattcaacg tttttatatt 1560
cctgaaaatg gccaggtctt aattgatgga catgatcttg cgttggccga tcctaactgg 1620
ttacgtcgtc aggtgggggt tgtgttgcag gacaatgtgc tgcttaatcg cagtattatt 1680
gataatatct cactggctaa tcctggtatg tccgtcgaaa aagttattta tgcagcgaaa 1740
ttagcaggcg ctcatgattt tatttctgaa ttgcgtgagg ggtataacac cattgtcggg 1800
gaacaggggg caggattatc cggaggtcaa cgtcaacgca tcgcaattgc aagggcgctg 1860
gtgaacaacc ctaaaatact tatttttgat gaagcaacca gtgctctgga ttatgagtcg 1920
gagcatatca tcatgcgcaa tatgcacaaa atatgtaagg gcagaacggt tataatcatt 1980
gctcatcgtc tgtctacagt aaaaaatgca gaccgcatta ttgtcatgga aaaagggaaa 2040
attgttgaac agggtaaaca taaggaactg ctttctgaac cggaaagttt atacagttac 2100
ttatatcagt tacagtcaga ctaacagaaa gaacagaaga atatgaaaac atggttaatg 2160
gggttcagcg agttcctgtt gcgctataaa cttgtctgga gtgaaacatg gaaaatccgg 2220
aagcaattag atactccggt acgtgaaaag gacgaaaatg aattcttacc cgctcatctg 2280
gaattaattg aaacgccggt atccagacgg ccgcgtctgg ttgcttattt tattatgggg 2340
tttctggtta ttgctgtcat tttatctgtt ttaggtcagg tggaaattgt tgccactgca 2400
aatgggaaat taacactaag tgggcgcagc aaagaaatta aacctattga aaactcaata 2460
gttaaagaaa ttatcgtaaa agaaggagag tcagtccgga aaggggatgt gttattaaag 2520
cttacagcac tgggagctga agctgatacg ttaaaaacac agtcatcact gttacagacc 2580
aggctggaac aaactcggta tcaaattctg agcaggtcaa ttgaattaaa taaactacct 2640
gaactgaagc ttcctgatga gccttatttt cagaatgtat ctgaagagga agtactgcgt 2700
ttaacttctt tgataaaaga acagttttcc acatggcaaa atcagaagta tcaaaaagaa 2760
ctgaatctgg ataagaaaag agcagagcga ttaacaatac ttgcccgtat aaaccgttat 2820
gaaaatttat cgagagttga aaaaagccgt ctggatgatt tcaggagttt attgcataaa 2880
caggcaattg caaaacatgc tgtacttgag caggagaata aatatgtcga ggcagcaaat 2940
gaattacggg tttataaatcgc aactggag caaattgaga gtgagatatt gtctgcaaaa 3000
gaagaatatc agcttgtcac gcagcttttt aaaaatgaaa ttttagacaa gctaagacaa 3060
acaacagaca acattgagtt attaactctg gagttagaga aaaatgaaga gcgtcaacag 3120
gcttcagtaa tcagggcccc tgtttcggga aaagttcagc aactgaaggt tcatactgaa 3180
ggtggggttg ttacaacagc ggaaacactg atggtcatcg ttccggaaga tgacacgctg 3240
gaggttactg ctctggtaca aaataaagat attggtttta ttaacgtcgg gcagaatgcc 3300
atcattaaag tggaggcctt tccttacacc cgatatggtt atctggtggg taaggtgaaa 3360
aatataaatt tagatgcaat agaagaccag aaactgggac tcgtttttaa tgtcattgtt 3420
tctgttgaag agaatgattt gtcaaccggg aataagcaca ttccattaag ctcgggtatg 3480
gctgtcactg cagaaataaa gactggaatg cgaagcgtaa tcagctatct tcttagtcct 3540
ctggaagagt ctgtaacaga aagtttacat gagcgttaa 3579
实施例3：Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)重组质粒的构建
根据角质酶、hlyAs的序列设计引物两对引物P3、P4和P5、P6。
P3：5’-gTAATCCATATggCCAACCCCTACgAgCgC-3’
P4：5’-gACTTCCATAggCTAAgAACgggCAggTggAg-3’
P5：5’-CTCCACCTgCCCgTTCTTAgCCTATggAAgTC-3’
P6：5’-CCgCTCgAgTTATgCTgATgCTgTCAAAg-3’
以本实验室前期构建的Tfu_0883-pET20b(+)质粒DNA为模板，以P3、P4为引物，PCR扩增角质酶基因。以E.coli CFT073总DNA为模版，以P5、P6为引物，PCR扩增hlyAs基因。PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为94℃变性1min后开始循环，然后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃分别延伸1min和20s，共30个循环后，再于72℃延伸10min。分别扩增得到783bp和180bp的PCR片段，割胶回收。然后再以角质酶和hlyAs基因PCR割胶回收片断为模板，以P3、P6为引物，再进行PCR反应。扩增得到963bp的PCR片段，割胶回收，回收片段与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37℃培养过夜，挑选单克隆，接入含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养8～10h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因全长963个核苷酸，角质酶基因和hlyAs的核苷酸序列完全相同。将pET20b(+)质粒和角质酶-hlyAs基因进行Nde I和Xho I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后抽提质粒，得到富集的Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)质粒。
编码角质酶-hlyAs的DNA序列如下：
SEQ.ID.NO：2：
gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgctcgaagc cagcagcggc 60
cccttctccg tcagcgagga gaacgtctcc cggttgagcg ccagcggctt cggcggcggc 120
accatctact acccgcggga gaacaacacc tacggtgcgg tggcgatctc ccccggctac 180
accggcactg aggcttccat cgcctggctg ggcgagcgca tcgcctccca cggcttcgtc 240
gtcatcacca tcgacaccat caccaccctc gaccagccgg acagccgggc agagcagctc 300
aacgccgcgc tgaaccacat gatcaaccgg gcgtcctcca cggtgcgcag ccggatcgac 360
agcagccgac tggcggtcat gggccactca atgggcggcg gcggcaccct gcgtctggcc 420
tcccagcgtc ccgacctgaa ggccgccatc ccgctcaccc cgtggcacct caacaagaac 480
tggagcagcg tcaccgtgcc gacgctgatc atcggggccg acctcgacac gatcgcgccg 540
gtcgccacgc acgcgaaacc gttctacaac agcctgccga gctccatcag caaggcctac 600
ctggagctgg acggcgcaac ccacttcgcc ccgaacatcc ccaacaagat catcggcaag 660
tacagtgtcg cctggctcaa gcggttcgtc gacaacgaca cccgctacac ccagttcctc 720
tgccccggac cgcgcgacgg actcttcggc gaggtcgaag agtaccgctc cacctgcccg 780
ttcttagcct atggaagtca ggataatctt aatccattaa ttaatgaaat cagcaaaatc 840
atttcagctg caggtaattt tgatgttaaa gaggaaagag ctgcagcttc tttattgcag 900
ttgtccggta atgccagtga tttttcatat ggacggaact caa taacttt gacagcatca 960
gca 963
实施例4：重组质粒转化
将hlyBD/pSTV28电击转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氯霉素(30mg/L)-LB平板上经37℃培养8-10h，挑选转化子(hlyB、hlyD-pSTV28/E.coli BL21(DE3))在LB液体培养基中37℃培养8-10h，得到可高效分泌外源重组蛋白的宿主菌E.coli BL21(DE3)。
将质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)电击转化上述E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氨苄青霉素(100mg/L)-氯霉素(30mg/L)-LB平板上经37℃培养8-10h，挑选转化子(Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/hlyBD-pSTV28/E.coli BL21(DE3))。
实施例5：发酵产酶
1)发酵培养
将上述基因工程菌(Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/hlyBD-pSTV28/E.coliBL21(DE3))接种于LB液体培养基中37℃培养8-10h，后以5％接种量接入TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L，KH2PO4 2.31g/L)发酵液体培养基，37℃培养2h时后，加入0.4mM IPTG进行诱导，后降温至25℃培养，48h时后，结束发酵。
2)酶活测定
以pNPB为底物，采用分光光度法在20℃下测定。反应体系为1ml，包括960μl缓冲液(20mM Tris-HCl，10mM NaCl，pH 8.0)，20μl酶液，20μlpNPB(1mM，乙腈中保存)，在405nm处，记录对硝基酚的生成速率，测定结果显示胞外角质酶活性达306U/mL。
核苷酸序列表
<110>江南大学
<120>一种高效分泌重组角质酶的基因工程菌及其构建方法
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>3639
<212>DNA
<213>大肠杆菌CFT073(Escherichia coli CFT073)
<400>1
gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgctcgaagc cagcagcggc 60
atggattctt gtcataaaat tgattatggg ttatacgccc tggagatttt agcccaatac 120
cataacgtct ctgttaaccc ggaagaaatt aaacatagat ttgacacaga cgggactggt 180
ctgggattaa cgtcatggtt gcttgctgcg aaatctttag aactaaaggt aaaacaggta 240
aaaaaaacaa ttgaccgatt aaactttatt tctttgcccg cattagtctg gagagaggat 300
ggacgtcatt ttattctgac taaagtcagt aaagaagcaa acagatatct tatttttgat 360
ctggagcaac gaaatccccg tgttctcgaa cagtctgagt ttgaggcgtt atatcagggg 420
catattattc ttattgcttc ccgttcttct gttaccggga aactggcaaa atttgacttt 480
acctggttta tccctgccat tataaaatac agaaaaatat ttattgaaac ccttgttgta 540
tctgtttttt tacaattatt tgcattaata accccccttt tttttcaggt ggttatggac 600
aaagtattag tacacagggg gttttcaacc cttaatgtta ttactgtcgc attatctgtt 660
gtggtggtgt ttgagattat actcagcggt ttaagaactt acatttttgc acatagtaca 720
agtcggattg atgttgagtt gggtgccaaa ctcttccggc atttactggc gctaccgatc 780
tcttattttg agagtcgtcg tgttggtgat actgttgcca gggtaagaga attagaccag 840
atccgtaatt ttctgacagg acaggcatta acatctgttc tggacttatt attttcattc 900
atattttttg cggtaatgtg gtattacagc ccaaagctta ctctggtgat cttattttcg 960
ctgccctgtt atgctgcatg gtctgttttt attagcccca ttttgcgacg tcgccttgat 1020
gataagtttt cacggaatgc ggataatcaa tctttcctgg tggaatcagt cacggcgatt 1080
aacactataa aagctatggc agtctcacct cagatgacga acatatggga caaacaattg 1140
gcaggatatg ttgctgcagg ctttaaagtg acagtattag ccaccattgg tcaacaagga 1200
atacagttaa tacaaaagac tgttatgatc atcaacctgt ggttgggagc acacctggtt 1260
atttccgggg atttaagtat tggtcagtta attgctttta atatgcttgc tggtcagatt 1320
gttgcaccgg ttattcgcct tgcacaaatc tggcaggatt tccagcaggt tggtatatca 1380
gttacccgcc ttggtgatgt gcttaactct ccaactgaaa gttatcatgg gaaactggca 1440
ttaccggaaa ttaatggtaa tatcactttt cgtaatatcc ggtttcgcta taagcctgac 1500
tctccggtta ttttagataa tatcaatctc agtattaagc agggggaggt tattggtatt 1560
gtcggacgtt ctggttcagg aaaaagcaca ttaactaaat taattcaacg tttttatatt 1620
cctgaaaatg gccaggtctt aattgatgga catgatcttg cgttggccga tcctaactgg 1680
ttacgtcgtc aggtgggggt tgtgttgcag gacaatgtgc tgcttaatcg cagtattatt 1740
gataatatct cactggctaa tcctggtatg tccgtcgaaa aagttattta tgcagcgaaa 1800
ttagcaggcg ctcatgattt tatttctgaa ttgcgtgagg ggtataacac cattgtcggg 1860
gaacaggggg caggattatc cggaggtcaa cgtcaacgca tcgcaattgc aagggcgctg 1920
gtgaacaacc ctaaaatact tatttttgat gaagcaacca gtgctctgga ttatgagtcg 1980
gagcatatca tcatgcgcaa tatgcacaaa atatgtaagg gcagaacggt tataatcatt 2040
gctcatcgtc tgtctacagt aaaaaatgca gaccgcatta ttgtcatgga aaaagggaaa 2100
attgttgaac agggtaaaca taaggaactg ctttctgaac cggaaagttt atacagttac 2160
ttatatcagt tacagtcaga ctaacagaaa gaacagaaga atatgaaaac atggttaatg 2220
gggttcagcg agttcctgtt gcgctataaa cttgtctgga gtgaaacatg gaaaatccgg 2280
aagcaattag atactccggt acgtgaaaag gacgaaaatg aattcttacc cgctcatctg 2340
gaattaattg aaacgccggt atccagacgg ccgcgtctgg ttgcttattt tattatgggg 2400
tttctggtta ttgctgtcat tttatctgtt ttaggtcagg tggaaattgt tgccactgca 2460
aatgggaaat taacactaag tgggcgcagc aaagaaatta aacctattga aaactcaata 2520
gttaaagaaa ttatcgtaaa agaaggagag tcagtccgga aaggggatgt gttattaaag 2580
cttacagcac tgggagctga agctgatacg ttaaaaacac agtcatcact gttacagacc 2640
aggctggaac aaactcggta tcaaattctg agcaggtcaa ttgaattaaa taaactacct 2700
gaactgaagc ttcctgatga gccttatttt cagaatgtat ctgaagagga agtactgcgt 2760
ttaacttctt tgataaaaga acagttttcc acatggcaaa atcagaagta tcaaaaagaa 2820
ctgaatctgg ataagaaaag agcagagcga ttaacaatac ttgcccgtat aaaccgttat 2880
gaaaatttat cgagagttga aaaaagccgt ctggatgatt tcaggagttt attgcataaa 2940
caggcaattg caaaacatgc tgtacttgag caggagaata aatatgtcga ggcagcaaat 3000
gaattacggg tttataaatc gcaactggag caaattgaga gtgagatatt gtctgcaaaa 3060
gaagaatatc agcttgtcac gcagcttttt aaaaatgaaa ttttagacaa gctaagacaa 3120
acaacagaca acattgagtt attaactctg gagttagaga aaaatgaaga gcgtcaacag 3180
gcttcagtaa tcagggcccc tgtttcggga aaagttcagc aactgaaggt tcatactgaa 3240
ggtggggttg ttacaacagc ggaaacactg atggtcatcg ttccggaaga tgacacgctg 3300
gaggttactg ctctggtaca aaataaagat attggtttta ttaacgtcgg gcagaatgcc 3360
atcattaaag tggaggcctt tccttacacc cgatatggtt atctggtggg taaggtgaaa 3420
aatataaatt tagatgcaat agaagaccag aaactgggac tcgtttttaa tgtcattgtt 3480
tctgttgaag agaatgattt gtcaaccggg aataagcaca ttccattaag ctcgggtatg 3540
gctgtcactg cagaaataaa gactggaatg cgaagcgtaa tcagctatct tcttagtcct 3600
ctggaagagt ctgtaacaga aagtttacat gagcgttaa 3639
<210>2
<211>963
<212>DNA
<213>嗜热放线菌(Thermobifida fusca)
<400>2
gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgctcgaagc cagcagcggc 60
cccttctccg tcagcgagga gaacgtctcc cggttgagcg ccagcggctt cggcggcggc 120
accatctact acccgcggga gaacaacacc tacggtgcgg tggcgatctc ccccggctac 180
accggcactg aggcttccat cgcctggctg ggcgagcgca tcgcctccca cggcttcgtc 240
gtcatcacca tcgacaccat caccaccctc gaccagccgg acagccgggc agagcagctc 300
aacgccgcgc tgaaccacat gatcaaccgg gcgtcctcca cggtgcgcag ccggatcgac 360
agcagccgac tggcggtcat gggccactca atgggcggcg gcggcaccct gcgtctggcc 420
tcccagcgtc ccgacctgaa ggccgccatc ccgctcaccc cgtggcacct caacaagaac 480
tggagcagcg tcaccgtgcc gacgctgatc atcggggccg acctcgacac gatcgcgccg 540
gtcgccacgc acgcgaaacc gttctacaac agcctgccga gctccatcag caaggcctac 600
ctggagctgg acggcgcaac ccacttcgcc ccgaacatcc ccaacaagat catcggcaag 660
tacagtgtcg cctggctcaa gcggttcgtc gacaacgaca cccgctacac ccagttcctc 720
tgccccggac cgcgcgacgg actcttcggc gaggtcgaag agtaccgctc cacctgcccg 780
ttcttagcct atggaagtca ggataatctt aatccattaa ttaatgaaat cagcaaaatc 840
atttcagctg caggtaattt tgatgttaaa gaggaaagag ctgcagcttc tttattgcag 900
ttgtccggta atgccagtga tttttcatat ggacggaact caataacttt gacagcatca 960
gca 963
Claims (4)
1.一种高效分泌表达重组角质酶的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌是携带2种重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，所述重组质粒为携带α-溶血素(α-hlyA)途径中hlyBD基因的质粒pSTV28及含有角质酶-hlyAs基因的质粒pET20b(+)。
2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：构建重组质粒
将大肠杆菌α-溶血素(α-hlyA)途径中的hlyBD基因克隆到pSTV28，构建重组质粒hlyBD/pSTV28；通过重叠PCR得到编码角质酶-hlyAs的基因序列，将其克隆到pET20b(+)，构建重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)；
第二步：构建高效表达重组角质酶的基因工程菌
将构建的重组质粒分步转化入大肠杆菌BL21(DE3)，得到高效表达重组角质酶的基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，构建重组质粒hlyBD/pSTV28用到如下引物：
引物P1：5’-CggCgAgCTCggATTCTTgTCATAAAATTg-3’
引物P2：5’-CCACggATCCTTAACgCTCATgTAAAC-3’。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，构建重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)用到如下引物：
引物P3：5’-gTAATCCATATggCCAACCCCTACgAgCgC-3’
引物P4：5’-gACTTCCATAggCTAAgAACgggCAggTggAg-3’
引物P5：5’-CTCCACCTgCCCgTTCTTAgCCTATggAAgTC-3’
引物P6：5’-CCgCTCgAgTTATgCTgATgCTgTCAAAg-3’ 。
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