CN101250509A - 一种高温角质酶及其基因序列 - Google Patents
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Abstract
一种高温角质酶及其基因序列，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03－11总DNA获得高温角质酶基因SEQ ID NO：1，角质酶基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，实现高温角质酶基因的高效表达；该角质酶基因全长783个核苷酸，编码261个氨基酸，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达角质酶。重组酶具有角质酶活性。该高温角质酶的最适温度为60℃，最适pH 8，在60℃具有很高的热稳定性，半衰期为45h。此酶非常适合纺织工业应用的需要。
Description
技术领域
一种高温角质酶及其基因序列，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及一种编码嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)高温角质酶的DNA序列及其表达。
背景技术
角质酶是一种多功能酶，能水解角质多聚物分子以及各种合成聚酯的酯键使其降解为单体和小分子寡聚体，同时也能水解各种不溶性甘油三酯和水溶性酯类。角质酶作用底物的广泛性使其在食品、化工、纺织等领域具有良好的应用前景。
纺织工业是我国的传统产业和支柱产业，在国内生产总值和外贸出口总值中占有重要比例。但我国纺织工业总体存在产业集中度不高、工艺技术装备落后和资源利用率低等问题。特别值得注意的是，纺织业是产生污染非常严重的工业，在前处理和后整理过程中，传统工艺消耗大量的水和化学品，不仅耗费资源，同时造成环境污染并破坏生态平衡，这对我国实施可持续发展战略极为不利。
从20世纪80年代开始，国外掀起了生物酶在纺织品染整加工中应用的研究热潮。我国近几年也出台一些新政策推动“绿色纺织品”和生态纺织业的发展，而纺织前处理工艺全酶化已成为实现生态纺织的重要手段。
角质酶作为纺织前处理工艺中一种重要的酶制剂，在棉织物前处理过程中的作用，主要是去除具有疏水性的棉纤维表皮层-角质层，以增加棉纤维的润湿性。近年来，角质酶在合成纤维前处理工艺中的应用成为热门，通过角质酶对PET等合成纤维疏水表面进行改性，可以很大程度地提高染整效果。将角质酶用于纤维表面的处理和改性，可取代传统的碱煮工艺，具有处理条件温和、对纤维损伤小、资源消耗低、对环境污染小等诸多优点的同时，还能显著提高纺织品加工的品质。
国外对角质酶的研究已有三十多年历史。自70年代起，从自然界中筛选到产角质酶菌种(主要为真菌)，进行野生酶分离纯化和生理生化性质研究。90年代，为深入了解角质酶的催化特性、分子机理，奠定其开发应用的理论基础，研究者构建了Fusarium solani cDNA文库，投入大量精力鉴定了该真菌角质酶的编码基因，并进行了克隆表达。随后，以实验室制备的重组酶为研究材料，广泛开展了真菌角质酶的理论和应用基础研究。分子水平的理论研究包括晶体结构解析、分子定性、催化机制等。在应用基础研究方面，研究了酶发酵提纯技术以及采用蛋白质工程技术对酶功能进行修饰，使改造后的酶适应不同的工业用途。近年来，为开发角质酶的大规模工业化生产，研究热点集中在采用不同的基因工程宿主细胞(如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、大肠杆菌Escherichia.coli和曲霉属Aspergillus sp.)进行高效表达，优化生产工艺，降低生产成本等方面的研究。
国内对角质酶的研究较少，只有少数几所高校开展了野生菌的筛选和摇瓶条件的优化，没有工业化生产和应用的实例。
综合国内外的研究发现，国外对角质酶的研究主要还是集中在真菌角质酶上，而对细菌角质酶的报道很少，其主要原因是：国外仍旧侧重于开发生化性质研究已很深入的真菌角质酶，对细菌角质酶的研究没有足够重视；细菌角质酶编码基因还没有被阐明，无法采用基因重组技术获得大量产品作为研究材料。但和真菌角质酶相比，细菌角质酶具有比真菌角质酶催化效率高、对环境适应能力强、以及基因工程表达技术等方面优势，因此，研究细菌角质酶具有极其重要的价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种高温角质酶，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的高温角质酶的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达载体。
本发明的又一个目的是提供包含本发明表达载体的宿主细胞。
本发明的技术方案：一种高温角质酶，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
所述的高温角质酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
所述的高温角质酶基因的表达方法：由嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11总DNA获得高温角质酶基因SEQ ID NO：1，角质酶基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，实现高温角质酶基因的高效表达；
(1)嗜热子囊菌Thermobifida fusca WSH03-11总DNA的提取。
Thermobifida fusca WSH03-11菌株(该菌株已在【化工进展】2006年第25卷第5期公开)，在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μLTris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL 10％SDS(十二烷基硫酸钠)和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入100μL NaCl(5M)和80μL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比24∶1抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL 70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为T.fusca WSH03-11总DNA。
(2)高温角质酶编码基因的克隆：
以Thermobifida fusca WSH03-11总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Nco I和EcoR I，PCR扩增高温角质酶基因。
引物1：5’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’
引物2：5’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到780bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒，命名为CUT-pMD18-T simple。将此质粒进行序列测定。
(3)高温角质酶基因的改造：
以CUT-pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，设计引物：
引物3：5’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’
引物4：5’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定。
(4)高温角质酶基因在表达载体上的构建：
用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒；
(5)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：
将质粒CUT-pET20b(+)热击转化E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再在含氨苄青霉素(100mg/L)和氯霉素(50mg/L)的LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子(重组菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS)在TB培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L，KH2PO42.31g/L)中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养至OD达1.5后用终浓度4μM IPTG(异丙基硫代βD半乳糖苷)诱导，降温至24℃培养，64h时产酶达69U/mL。
(6)重组高温角质酶的纯化和特性。
将上述角质酶发酵液于4℃，10000rpm离心20min除菌体。上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃，10000rpm离心20min，取沉淀物用适量缓冲液A(20mM磷酸钠，0.5M氯化钠。20mM咪唑，pH7.4)溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品。Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A～含480mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液。活力组分用10000道尔顿膜离心浓缩，得纯化角质酶酶制品。纯化后角质酶达到电泳纯，表观分子量30000道尔顿。纯化过程电泳图见图1。
本发明的有益效果：本发明提供了高温角质酶基因的高效表达方法。提取Thermobifida fusca WSH03-11总DNA，设计引物PCR得到编码高温角质酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，全长783个核苷酸，编码261个氨基酸。以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，可实现高温角质酶基因的高效表达，重组酶具有角质酶活性。该高温角质酶的最适温度为60℃，最适pH8，在60℃具有很高的稳定性，半衰期为45h。此酶非常适合纺织工业应用的需要。
附图说明
图1重组角质酶分离纯化SDS-PAGE图谱
1、发酵上清液；2、通过Ni柱纯化后样品；3、标准蛋白分子量。
图2高温角质酶最适温度(对硝基苯丁酸酯pNPB为底物)
图3高温角质酶最适pH(对硝基苯丁酸酯pNPB为底物)
pH6-7，使用磷酸钾缓冲液；pH7-9，使用Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液。
图4高温角质酶60℃稳定性研究(对硝基苯丁酸酯pNPB为底物)
具体实施方式
实施例1
本实施例说明嗜热子囊菌Thermobifida fusca WSH03-11总DNA的提取。
Thermobifida fusca WSH03-11菌株在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL 10％SDS(十二烷基硫酸钠)和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入10μL NaCl(5M)和80μL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比24∶1抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL 70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为Thermobifida fusca WSH03-11总DNA。
实施例2
本实施例说明高温角质酶编码基因的克隆程序。
以Thermobifida fusca WSH03-11总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Nco I和EcoR I，PCR扩增高温角质酶基因。
引物1：5’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’
引物2：5’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。扩增得到780bp的PCR片段，割胶回收。回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，平板上长了大约十几个菌落，挑四个菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒，命名为CUT-pMD18-T simple。将此质粒进行序列测定，结果表明插入片段含有一个长783bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由261个氨基酸编码的蛋白质。
实施例3
本实施例说明高温角质酶基因的改造程序。
由于在目标基因内部存在一个Nco I酶切位点，而基因两端分别为Nco I和EcoR I位点，所以设计引物将Nco I位点突变去除，以方便下步的克隆表达。以连接了角质酶基因的CUT-pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，设计引物：
引物3：5’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’
引物4：5’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞。转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定，结果正确，验证了已经成功突变去除Nco I位点。
实施例4
本实施例说明高温角质酶基因在表达载体上的构建程序。
用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记。将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒。
实施例5
本实施例说明大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。
将质粒CUT-pET20b(+)热击转化E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再在含氨苄青霉素(100mg/L)和氯霉素(50mg/L)的LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子(重组菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS)在TB培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L，KH2PO42.31g/L)中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养至OD达1.5后用终浓度4μM IPTG(异丙基硫代βD半乳糖苷)诱导，降温至24℃培养，64h时产酶达69U/mL。
实施例6
本实施例说明重组高温角质酶的纯化和特性。
将上述角质酶发酵液于4℃，10000rpm离心20min除菌体。上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃，10000rpm离心20min，取沉淀物用适量缓冲液A(20mM磷酸钠，0.5M氯化钠。20mM咪唑，pH7.4)溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品。Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A～含480mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液。活力组分用10000道尔顿膜离心浓缩，得纯化角质酶酶制品。纯化后角质酶达到电泳纯，表观分子量30000道尔顿。纯化过程电泳图见图1。
将重组酶进行底物水解试验，发现重组酶可水解角质、甘油三酯和可溶性酯，结果表明角质酶基因实现高效表达。
以可溶性酯对硝基苯丁酸酯(pNPB)为底物时，高温角质酶的最适温度为60℃(图2)，最适pH8(图3)，在60℃具有很高的稳定性，半衰期为45h(图4)。
序列表
SEQ ID NO：1
gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgctcgaagc ccgcagcggc 60
cccttctccg tgagtgaaga acgggcctcc cgcttcggtg ctgacggttt cggcggcggc 120
accatctact acccgcggga gaacaacacc tacggtgccg tggcgatctc ccccggctac 180
accggcaccc aggcctctgt cgcctggctg ggcgagcgca tcgcctccca cggcttcgtc 240
gtcatcacca tcgacaccaa caccaccctc gaccagccgg acagccgggc ccgccagctc 300
aacgccgcgc tggactacat gatcaacgac gcctcgtccg cggtgcgcag ccggatcgac 360
agcagccgac tggcggtcat gggccactcc atgggcggcg gcggcaccct gcgtctggcc 420
tcccagcgtc ccgacctgaa ggccgccatc ccgctcaccc cgtggcacct caacaagaac 480
tggagcagtg tgcgggttcc caccctcatc atcggtgctg acctggacac catcgctccg 540
gtcctcaccc acgcccggcc cttctacaac agcctcccga cctcgatcag caaggcctac 600
ctggagctgg acggcgcaac ccacttcgcc ccgaacatcc ccaacaagat catcggcaag 660
tacagcgtcg cctggctcaa gcggttcgtc gacaacgaca cccgctacac ccagttcctc 720
tgccccggac cgcgcgacgg actcttcggc gaggtcgaag agtaccgctc cacctgcccc 780
ttctag 786
SEQ ID NO：2
Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Phe Thr Asp Ala Leu Leu
5 10 15
Glu Ala Arg Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Arg Ala Ser
20 25 30
Arg Phe Gly Ala Asp Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Pro
35 40 45
Arg Glu Asn Asn Thy Tyr Gly Ala Vla Ala Ile Ser Pro Gly Tyr
50 55 60
Thr Gly Thr Gln Ala Ser Val Ala Trp Leu Gly Glu Arg Ieu Ala
65 70 75
Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Asn Asp Thr Ile Thr Thr Leu
80 85 90
Asp Gln Pro Asp Ser Arg Ala Arg Gln Leu Asn Ala Ala Leu Asp
95 100 105
Tyr Met Ile Asn Asp Ala Ser Ser Ala Val Arg Ser Arg Ile Asp
110 115 120
Ser Ser Arg Leu Ala Val Met Gly His Ser Met Gly Gly Gly Gly
125 130 135
Thr Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg Pro Asp Leu Lys Ala Ala Ile
140 145 150
Pro Leu Thr Pro Trp His Leu Asn Lys Asn Trp Ser Ser Val Arg
155 160 165
Val Pro Thr Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu Asp Thr Ile Ala Pro
170 175 180
Val Ala Thr His Ala Arg Pro Phe Tyr Asn Ser Leu Pro Thr Ser
185 190 195
Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr His Phe Ala
200 205 210
Pro Asn Ile Pro Asn Lys Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val Ala Trp
215 220 225
Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe Leu
230 235 240
Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr
245 250 255
Arg Ser Thr Cys Pro Phe
260 261
Claims (3)
1. 一种高温角质酶，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2. 一种编码权利要求1所述的高温角质酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3. 一种如权利要求2所述的高温角质酶基因的表达方法，其特征是由嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11总DNA获得高温角质酶基因SEQ IDNO：1，角质酶基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，实现高温角质酶基因的高效表达；
(1)嗜热子囊菌Thermobifida fusca WSH03-11总的提取：
Thermobifida fusca WSH03-11菌株在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL 10％十二烷基硫酸钠和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入100μL 5M的NaCl和80μL十六烷基三甲基溴化铵，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比24∶1抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL 70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为Thermobifida fuscaWSH03-11总DNA；
(2)高温角质酶编码基因的克隆：
以Thermobifida fusca WSH03-11总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Nco I和EcoR I，PCR扩增高温角质酶基因；
引物1：5’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’
引物2：5’CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到780bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒，命名为CUT-pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定；
(3)高温角质酶基因的改造：
以CUT-pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，设计引物：
引物3：5’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’
引物4：5’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定；
(4)高温角质酶基因在表达载体上的构建：
用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒；
(5)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：
将质粒CUT-pET20b(+)热击转化E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再在含100mg/L氨苄青霉素和50mg/L氯霉素的LB平板上经37℃培养过夜，挑选重组菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS转化子在TB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养至OD达1.5后用终浓度4μM异丙基硫代βD半乳糖苷诱导，降温至24℃培养，64h时产酶达69U/mL；
(6)重组高温角质酶的纯化和特性：
将上述角质酶发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A～含480mM咪唑的缓冲液A梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含角质酶酶活的洗脱液；活力组分用10000道尔顿膜离心浓缩，得纯化角质酶酶制品。
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