CN102260654B

CN102260654B - 一种角质酶的突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN102260654B
Application number: CN 201110139321
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 陈晟; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: CN102260654A

Abstract

本发明提供了一种嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶的突变体及其制备方法，突变体包括一个或两个相应于嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的角质酶活性中心位点附近的氨基酸残基的取代，I218A、Q132A/T101A和W195A/F249A对棉纤维的催化效率均有所提高，其中突变体I218A对角质的催化效率比原角质酶提高50％；Q132A/T101A对合成纤维对苯二甲酸乙二酯(PET)的催化效率比原角质酶提高3倍，这三种突变体在纺织纤维前处理中有广阔的应用前景。

Description

一种角质酶的突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种酶突变体及其制备方法，尤其涉及角质酶的突变体及其制备方法，本发明属于基因工程和酶工程领域，具体地说本发明是利用蛋白质工程的定点突变方法改善耐热角质酶的底物特异性的技术。

背景技术

角质酶是能够水解角质大分子的水解酶。作为一种多功能酶，在纺织工业、食品工业以及化工工业等诸多领域都有着广泛的应用。尤其在纺织工业中，角质酶可用于棉纤维生物精练，以去除棉纤维表面蜡质和角质，并有助于果胶、蛋白质等杂质的进一步去除，从而达到精练目的。近年来研究表明，角质酶还可用于合成纤维聚对苯二甲酸乙二酯(PET)的改性，增加织物吸水性，改善手感，提高织物品质。上述两工艺目前均采用传统碱处理工艺，存在水耗、能耗大，排放废水碱性强、色度深、COD值高以及对纤维损伤大等弊病。酶精练工艺作为一种节能降耗、环境友好的纺织品清洁生产技术，已成为国内外染整行业发展的新趋势。

国外对角质酶进行了大量的研究，主要集中于Fusarium solani等真菌来源角质酶。但真菌角质酶热稳定性差，不适合在纺织工业中的应用。而本实验室开发的嗜热放线菌(Thermobifida fusca)产耐热角质酶可有效水解角质、PET等聚酯，但水解效率较低(陈坚，吴敬，陈晟.一种耐热角质酶及其编码基因和表达.申请号200710026074.2)。因此通过结构模拟确定突变位点，通过定点突变技术提高耐热角质酶对角质和PET的催化效率极为重要，具有较强的工业应用价值。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种角质酶的突变体，包括一个或两个相应于嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的角质酶活性中心位点附近的氨基酸残基的取代，与亲代角质酶相比具有更强的角质或PET水解能力。

所述嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）产角质酶的基因与NCBI数据库中Thermobifida fusca编码的蛋白Tfu_0883极其类似，基因全长906个核苷酸，编码301个氨基酸，和蛋白Tfu_0883的基因有两个核苷酸的差异，编码氨基酸相同(陈坚, 吴敬, 陈晟. 一种耐热角质酶及其编码基因和表达. 申请号200710026074.2)。

所述角质酶突变体是218位氨基酸异亮氨酸Ile突变为丙氨酸Ala，命名为I218A。

所述角质酶突变体是是第132位氨基酸谷氨酰胺Gln和第101位氨基酸苏氨酸Thr同时突变为丙氨酸Ala，命名为Q132A/T101A。

所述角质酶突变体是是第195位氨基酸色氨酸Trp和第249位氨基酸苯丙氨酸Phe同时突变为丙氨酸Ala，命名为W195A/F249A。

本发明的所要解决的另一个技术问题是提供上述突变体的制备方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：在嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）角质酶模拟结构的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带角质酶基因的载体为模板进行定点突变构建突变质粒I218A-pet20b(+)、W195/F249-pet20b(+)、Q132A/T101A-pet20b(+)；将突变质粒转化转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养，25 °C恒温培养至80 h，对上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换柱纯化角质酶突变体I218A、Q132A/T101A和W195A/F249A。

所述携带角质酶的载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任一一种。

本发明的有益效果：本发明提供了一组具有纤维高催化效率的角质酶突变体及其制备方法，I218A、Q132A/T101A和W195A/F249A对棉纤维的催化效率均有所提高，其中突变体I218A对角质的催化效率比原角质酶提高50%；Q132A/T101A对合成纤维对苯二甲酸乙二酯（PET）的催化效率比原角质酶提高3倍。这三种突变体在纺织工业中有重要的应用价值。

附图说明

图1 嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）角质酶突变体纯化SDS-PAGE电泳图。

泳道1：标准分子量蛋白;

泳道2：I218A发酵液;

泳道3：I218A纯化制品;

泳道4：W195A/F249A发酵液;

泳道5：W195A/F249A纯化制品;

泳道6：Q132A/T101A发酵液;

泳道7：Q132A/T101A纯化制品。

图2嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）角质酶突变体角质水解活力分析。

△：未突变嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）角质酶; □：I218A ; ■：W195A/F249A ; ▲：Q132A/T101A

图3 嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）角质酶突变体PET水解活力分析。

具体实施方式

实施例1：嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）角质酶突变体突变位点确定的方法。

角质等聚酯是由大量脂肪酸构成的疏水性大分子物质，角质酶活性中心周围氨基酸的大小对聚酯大分子和活性中心的结合造成影响，此外氨基酸的疏水性影响底物结合位点和底物的结合，因此，以角质酶模拟结构为基础，从以上两方面出发，确定突变位点进而对角质酶基因进行定点突变。通过对嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）角质酶模拟结构的分析，设计三组突变系列：(1)位于丝氨酸活性中心正上方的氨基酸异亮氨酸I218所占空间较大，对活性中心和大分子底物的结合形成较大的位阻，因此将其突变为位阻较小的丙氨酸，以提高底物和活性中心的亲和力；(2)位于丝氨酸活性中心两侧的芳香族氨基酸色氨酸W195和苯丙氨酸F249由于苯环的存在，也占用大量空间，因此也将其突变为丙氨酸减少位阻效应；(3)位于活性中心附近的亲水性氨基酸谷氨酰胺Q132和苏氨酸T101对疏水性底物的结合力较差，将其突变为疏水性氨基酸丙氨酸以增加对疏水性底物的结合力，提高催化效率。

实施例2：嗜热放线菌（Thermobifida fusca ）角质酶突变体的制备方法。

利用快速PCR定点突变方法构建I218A-pet20b(+)、W195/ F249 -pet20b(+)、Q132A/T101A-pet20b(+)突变质粒。

I218A-pet20b(+)、W195 -pet20b(+)、Q132A -pet20b(+)突变质粒的构建以CUT-pet20b(+)质粒为模板(陈坚, 吴敬, 陈晟. 一种耐热角质酶及其编码基因和表达. 申请号200710026074.2)，分别用I218A、W195A和Q132A的突变引物通过一次PCR得到大小为4500 bp左右产物，将PCR产物经Dpn I处理后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑选转化子测序验证。

W195/F249-pet20b(+)、Q132A/T101A-pet20b(+)突变质粒的构建分别以验证正确的W195-pet20b(+)、Q132A-pet20b(+)质粒为模板，用F249A和T101A为突变引物，PCR扩增得到大小为4500bp左右产物，将PCR产物DpnI处理后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑选转化子测序验证。

测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒I218A-pet20b(+)、W195/F249-pet20b(+)、Q132A/T101A-pet20b(+)构建成功。

突变引物如下所示(方框为突变位点)：

1、I218A突变引物对：

P I218A1：5’-GCCGACCTCGACACG

GCGCCGTCGCCACG-3’

P I218A2：5’-CGTGGCGACCGGCGC

CGTGTCGAGGTC-3’

2、W195A突变引物对：

P W195A1：5’-ATCCCGCTCACCCCG

CACCTCAACA AGAA C-3’

P W195A2：

5’-GTTCTTGTTGAGGTG

CGGGGTGAGCGGGATGG-3’

3、F249A突变引物对：

P F249A1：5’-gACGGCGCAACCCAC

GCCCCGAACATCC-3’

P F249A2：5’-GGATGTTCGGGGC

GTGGGTTGCGCCGTC-3’

4、Q132A突变引物对：

P Q132A1：5’-CATCACCACCCTCGAC

CCGGACAGCCGGGC Ag-

3’

P Q132A2：5’-CTGCCCGGCTGTCCGG

GTCGAGGGTGGTGATG-3’

5、T101A突变引物对：

P T101A1：5’-GATCTCCCCCGGCTAC GGCACTGAGGCTTC-3’

P T101A2：5’-GAAGCCTCAGTGCC

GTAGCCGGGGAGATC-3’

上述PCR体系均为：

上述PCR条件均为：

94℃预变性4min，然后进行以下循环：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸4min；30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。

实施例3：嗜热放线菌(Themobifida fusca)角质酶突变体的表达纯化方法。

将突变质粒I218A-pet20b(+)、W195/F249-pet20b(+)、Q132A/T101A-pet20b(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选转化子进行测序验证。将验证后的阳性转化子在TB培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K₂HPO₄12.54g/L，KH₂PO₄2.31g/L)中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养3h后用4mg/L IPTG(异丙基硫代βD半乳糖苷)诱导，降温至25℃恒温培养80h。

发酵液于4℃，10000rpm离心20min除菌体。上清液通过活性炭柱收集。在通过活性炭柱的清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃，10000rpm离心20min，取沉淀物用适量缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH 8)溶解，加入20％硫酸铵，0.22μm膜过滤后制成上样样品。Phenyl HP疏水柱用加入20％硫酸铵的缓冲液A平衡后，将上样样品吸入疏水柱，使之完全吸附后，分别用含20％硫酸铵的缓冲液A、20％-0％硫酸铵梯度的缓冲液A、缓冲液A和去离子水洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，洗脱液分部收集。酶活力部分用缓冲液A平衡的DEAE Sepharose阴离子交换柱进行进一步纯化，洗脱流速1mL/min，收集酶活力组分，用10000道尔顿膜离心浓缩，得纯化角质酶突变体。纯化后角质酶突变体达到电泳纯，表观分子量30KDa。纯化结果如图1所示。

实施例4：嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶突变体对角质或PET水解的效率。

角质酶对角质的水解效果测定使用如下方法：反应体系包括1％(w/v)苹果角质、25mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、1mg酶液，60℃保温，不同时间取样，用0.02M NaOH溶液滴定生成的脂肪酸。

角质酶对PET的水解效果测定使用如下方法：反应体系为10ml，包括0.3g PET、25mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)、0.1mg酶液，150rpm 60℃保温72h以上，保温过程中取样进行RP-HPLC分析。水解活性通过水解产物的总和进行计算。水解产物对苯二甲酸(TPA)、单(对苯二甲酸-2-羟基乙酯)(MHET)、二(对苯二甲酸-2-羟基乙酯)(BHET)、1，2-乙烯基-单对苯二甲酸-单(对苯二甲酸-2-羟基乙酯)(EMT)通过LC-MS进行定量分析。

如图2所示，I218A、W195A/F249A和Q132A/T101A突变体水解角质的能力较未改造嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶有明显的提高。其中W195A/F249A在水解过程的前期水解角质速度较快，并很快达到平衡；I218A和Q132A/T101A角质水解效率比原酶分别提高50％和20％。

如图3所示，Q132A/T101A突变体水解PET的能力较未改造嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶有明显的提高，水解效率达原酶的3倍。

核苷酸序列表

<110>江南大学

<120>一种角质酶的突变体及其制备方法

<140> 201110139321.6

<141> 2009-12-18

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 1

gccgacctcg acacggccgc gccgtcgcca cg 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 2

cgtggcgacc ggcgcggccg tgtcgaggtc 30

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 3

atcccgctca ccccggcgca cctcaacaag aac 33

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 4

gttcttgttg aggtgcgccg gggtgagcgg gatgg 35

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 5

gacggcgcaa cccacgccgc cccgaacatc c 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 6

ggatgttcgg ggcggcgtgg gttgcgccgt c 31

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 7

catcaccacc ctcgacgcgc cggacagccg ggcag 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 8

ctgcccggct gtccggcgcg tcgagggtgg tgatg 35

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 9

gatctccccc ggctacgccg gcactgaggc ttc 33

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据基因序列设计，用于定向突变。

<400> 10

gaagcctcag tgccggcgta gccggggaga tc 32

Claims

1.一种角质酶的突变体，其特征是将嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的角质酶第195位氨基酸色氨酸Trp和第249位氨基酸苯丙氨酸Phe同时突变为丙氨酸Ala，命名为W195A/F249A，所述嗜热放线菌的角质酶的氨基酸序列与NCBI数据库中Tfu_0883基因编码的氨基酸序列相同。