CN111662934B - 一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法及应用，通过筛选合适的纤维素酶，首次实现了对羧甲基纤维素（CMC）的高效转化生产乙醇，其产量达到5.1 g/L。此外，将毕赤酵母工程菌冷冻干燥后可作为复合纤维素酶直接使用，其生物安全性高，并显著降低了现有商品化复合纤维素酶的生产成本。

Description

一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法及应用
技术领域
本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种毕赤酵母表面展示纤维小体工程菌的构建方法，以及在发酵纤维素生产生物乙醇领域的应用。
背景技术
随着传统不可再生的化石燃料日渐枯竭，人们迫切需要开发新型可再生清洁能源，如生物乙醇。然而，受全球粮食危机的影响，各国科研人员亟需研发出利用非粮食为原料生产的第二代生物乙醇。目前，使用低成本、环境友好的纤维素生产生物乙醇已经成为生物能源领域的研究热点。首先，纤维素底物需要经过水解糖化才能被微生物利用，进行乙醇发酵。传统工艺使用商品化纤维素酶降解纤维素，因其酶活性偏低、消耗量大而导致生产过程耗时长、生产成本高、产品缺乏市场竞争力。为了解决上述瓶颈问题，近年来人们致力于开发联合生物加工(CBP)的方法—即通过微生物细胞工厂将纤维素水解和乙醇发酵过程统一起来。
Colicin E7(CE7)是DNase型E群大肠杆菌素之一，其能与大肠杆菌素免疫蛋白相互作用，例如CE7与其免疫蛋白IM7之间的解离常数Kd达到10-14～10-17M，并且通过与大肠杆菌素免疫蛋白的结合大肠杆菌素会失去其生物毒性。异源表达CE7蛋白会因其携带的DNase活性使得表达宿主致死，难以利用CE7蛋白、IM7蛋白之间的强相互作用。2017年MarinaN.Vassylyevaa等人基于分子建模设计对CE7蛋白进行了改造，将其命名为CL7蛋白。CL7蛋白完美的保留了与IM7蛋白的超强结合活性，并同时失去了DNA酶活性。
目前常见的酵母表面展示系统主要有两种，根据直接展示所用的甘露糖蛋白的不同可分为凝集素表面展示系统以及絮凝素表面展示系统，其中根据凝集素的不同又可分为a-凝集素展示系统与α-凝集素展示系统。酿酒酵母表面直接展示纤维素酶主要是α-凝集素展示系统，其由两个亚单位的糖蛋白组成，725个氨基酸残基的Aga1亚单位通过β葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁上，69个氨基酸残基的Aga2亚单位通过二硫键与Aga1亚单位连接。纤维素酶融合在Aga2蛋亚基后得以展示。纤维素酶在酿酒酵母上的间接表面展示是指在酵母细胞表面模拟天然纤维小体的结构，首先模拟出不具有催化活性的支架蛋白，该支架蛋白上拥有多个来源于厌氧纤维素水解菌的粘连蛋白以及纤维素结合结构域，然后使用与该粘连蛋白特异性亲附的对接蛋白与纤维素酶融合组成催化域。其中粘连蛋白对(cohesin-dockerin)一般来源于含有天然纤维小体的嗜热细菌或古菌。通过粘连蛋白与对接蛋白的相互作用将纤维素酶嵌合至支架蛋白上，组成一种含有多种纤维素酶空间立体的复合物，这个复合物与AGA2亚基连接，利用二硫键与AGA1亚基连接，实现复合体于酿酒酵母细胞表面的锚定，从而形成人造纤维小体。
酿酒酵母因其高乙醇生产率和强乙醇耐受性，被认为是一种理想的CBP产乙醇微生物。含有纤维小体的酿酒酵母能够转化Avicel和磷PASC生成乙醇，但是产量较低(约2g/L)。并实现了利用微晶纤维素(Avicel)或磷酸膨胀纤维素(PASC)底物产乙醇。
但是，目前仍未见酵母成功转化羧甲基纤维素(CMC)产乙醇的案例，其原因可能是CMC的超高粘度会削弱水解产物的扩散，进而影响酿酒酵母发酵过程中对还原糖的有效利用。为了实现酵母菌高效转化纤维素生产乙醇在工业领域的应用，还有很长的路要走。
发明内容
本发明提供了一种毕赤酵母表面展示纤维小体工程菌的构建方法，以及在发酵纤维素生产生物乙醇领域的应用。该方法构建的表面展示有纤维小体的毕赤酵母工程菌，酶活性高，耐热性好，可有效催化多种纤维素底物产乙醇，并首次实现了高效转化羧甲基纤维素(CMC)生产乙醇，产量达到5.1g/L。将毕赤酵母工程菌冷冻干燥后可作为复合纤维素酶直接使用，其生物安全性高，生产成本低，有很好的应用前景。
为实现本发明的目的，提供了如下技术方案：
一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法，包括下述步骤：
(1)将n个IM7基因串联后整合到毕赤酵母基因组中，构建重组酵母Y-IMn；所述的n为1-5中的任意自然数，所述的IM7基因序列为SEQ ID NO.6所示；
(2)将重组酵母Y-IMn与CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBM混合，孵育；
所述的CL7-CBHI的序列为SEQ ID NO.7所示、CL7-CEL9D的序列为SEQ ID NO.8所示、CL7-BGL的序列为SEQ ID NO.9所示、CL7-CBM的序列为SEQ ID NO.10所示；
(3)纤维素加入到步骤(2)的混合物中，进行厌氧发酵，即得乙醇；
所述的纤维素为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和羧甲基纤维素。
以上所述的方法中，优选的，所述的n为2或3；
以上所述的方法中，优选的，所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115；
以上所述的方法中，优选的，CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBM的摩尔比为1:1:1:1或2:4:2:7；
以上所述的方法中，优选的，所述的纤维素为羧甲基纤维素。
一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法的应用，包括利用上述方法，通过将纤维素进行厌氧发酵制备乙醇。
与现有技术相比，本发明能产生的有益效果包括：
本发明通过在毕赤酵母表面高效组装纤维小体，通过筛选合适的纤维素酶，首次实现了对羧甲基纤维素(CMC)的高效转化生产乙醇。获得的毕赤酵母工程菌可冷冻干燥后制备成复合纤维素酶，其生物安全性高，生产成本低，在畜牧养殖业等纤维素酶需求量巨大的行业具有广泛的应用前景。
附图说明
图1CL7融合蛋白的纯化结果。
图2前30分钟内纤维素底物水解活性测定。
图3纤维素厌氧发酵产乙醇及最高产量比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术路线及优点更加清楚明白，下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。
实施例1：
带有CL7标签蛋白的融合蛋白的筛选和构建：
通过生物信息学平台，对不同种属来源的纤维二糖水解酶(CBHI)、内切葡聚糖酶(CEL9D)、β-葡萄糖苷酶(BGL)，以及纤维素结合结构域(CBM)基因进行挖掘和序列分析，最终确定了四种基因：来源于Yarrowia lipolytica的纤维二糖水解酶(CBHI，SEQ ID NO.1所示)、Thermoanaerobacterium的内切葡聚糖酶(CEL9D，SEQ ID NO.2所示)，以及Thermobifida fuscaAvicel的β-葡萄糖苷酶(BGL，SEQ ID NO.3所示)和纤维素结合结构域(CBM，SEQ ID NO.4所示)。
此外，申请人还挑选了Xunthomonas multophilia、Aeromonus hydrophila、Seudomonas、Fluvobucterium等微生物中的相关纤维素酶，按照下述实验进行了组合酶活的测定，但效果只有本发明选取的组合酶活的30％-40％。
将上述蛋白酶分别在N端融合CL7标签蛋白(SEQ ID NO.5所示)，得到四种融合蛋白：CL7-CBHI(SEQ ID NO.7所示)、CL7-CEL9D(SEQ ID NO.8所示)、CL7-BGL(SEQ ID NO.9所示)、CL7-CBM(SEQ ID NO.10所示)；
本发明获得以上融合蛋白的具体方法是将N端融合CL7标签蛋白的纤维二糖水解酶(CBHI)、内切葡聚糖酶(CEL9D)、β-葡萄糖苷酶(BGL)，以及纤维素结合结构域(CBM)的融合基因，构建于pET-23a表达载体。通过大肠杆菌BL31(DE3)表达上述蛋白，并利用镍柱亲和纯化，获得纯度大于80％的蛋白(图1)。本领域技术人员还可采用其他现有的技术获得该融合蛋白，例如人工合成的方式或其他的蛋白表达方式。采用如下方法对酶活进行测定：
将四种融合蛋白稀释到统一摩尔浓度5μM，设计实验如表1所示，A、B两组反应温度为50℃，C组反应温度为30℃，每组组合酶投入到三种不同纤维素中进行水解糖化反应。A、B、C各组设有三组平行。
表1组合酶酶活的测定
Figure BDA0002536983200000041
实验组A底物为微晶纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.123；底物为磷酸膨胀纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.37；底物为羧甲基纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.39。
实验组B底物为微晶纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.22；底物为磷酸膨胀纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.53；底物为羧甲基纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.72。
实验组C底物为微晶纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.15；底物为磷酸膨胀纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.14；底物为羧甲基纤维素时，三个平行组反应后将反应液稀释十倍，测得的540nm处的吸光度的平均值为0.33。
计算得出酶活：实验组A底物分别为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和羧甲基纤维素时，生成葡萄糖为2.24mg、2.38mg、0.74mg；实验组B底物分别为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和羧甲基纤维素时，生成葡萄糖为5.26mg、7.2mg、2.15mg；实验组C底物分别为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和羧甲基纤维素时，生成葡萄糖为1.46mg、3.3mg、1.5mg。
对比实验组A与实验组B实验结果得出，无论是哪种纤维素作为底物当加入CL7-CBM蛋白时纤维素酶体系的总酶活相较于不加入CL7-CBM蛋白都大大提高，也就是说本实验纯化的CL7-CBM蛋白具有碳水化合物结合活性；对比实验组B与实验组C实验结果得出无论是哪种纤维素作为底物，当水解温度由50℃下降为30℃时，组合酶酶活性均下降。
实施例2：
展示纤维小体的毕赤酵母工程菌的构建：
IM7基因序列为SEQ ID NO.6所示。多拷贝IM7蛋白之间采用GGGSG柔性多肽进行串联连接。根据支架蛋白的表面展示效率、纤维小体的组装效率对多拷贝IM7支架蛋白的拷贝数进行了筛选，最终选择效果最好的两拷贝和三拷贝的IM7进行毕赤酵母工程菌的制备。
具体为：分别将两拷贝IM7和三拷贝IM7菌株的质粒构建到载体质粒pPICZαA的XhoI和Xba I之间转入大肠杆菌克隆菌株DH5α，扩大培养后抽提质粒并测得浓度，将质粒使用Pme1限制性核酸内切酶线性化后通过电击穿孔将目的基因整合到毕赤酵母GS115基因组中，构建重组酵母Y-IM2(含有两拷贝IM7)、Y-IM3(含有三拷贝IM7)，通过PCR鉴定整合成功，并通过流式细胞仪和免疫荧光对其进行鉴定。将成功构建的重组毕赤酵母保存并进行摇瓶培养以获得后续实验材料。其中两拷贝的表面展示效率达到85％、三拷贝的表面展示效率达到93％。
按照上述步骤，也制备了含有一拷贝IM7毕赤酵母，IM7的表面展示效率的检测，为78％。
因此，本发明采用含有二拷贝和三拷贝的IM7的重组毕赤酵母，用于以下实施例。
实施例3：
纤维小体组分自组装比例优化：
称取0.1g于28℃培养箱中培养48h后的重组毕赤酵母(湿菌)于1.5mL容量EP管中，置于冰水混合物上备用；然后根据表2中(表2中的蛋白比例指得是摩尔比，依次是CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBD的摩尔比例)所述方法计算出各组实验中CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL、CL7-CBD蛋白应投入体积，均匀混合蛋白，加入装有0.1g重组酵母的容量EP管中；最后加入具有10mM CaCl2(pH 8.0)的100mM Tris-HCl缓冲液定容自组装体系至1mL(四个蛋白的总量在体系中的浓度是5μM)，将酵母细胞轻轻吹打悬起混匀后，把1.5mL容量EP管置于静音混合器上孵育2h，孵育温度为4℃。
表2高效自组装实验组与对照组
Figure BDA0002536983200000061
测酶活时使用的纤维素底物包括：微晶纤维素(Avicel)、磷酸膨胀纤维素(PASC)、羧甲基纤维素(CMC)三种。每个实验组与对照组包含三组平行实验。实验结果如图2所示，实验结果显示按照1:1：1：1和2:4:2:7比例混合后的初始酶活没有影响并有部分提升，可用于后续发酵生产乙醇实验。
实施例4：
一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法，包括下述步骤：
本实施例涉及到的Y-IM0酵母细胞即为野生型毕赤酵母GS115。
(1)将诱导后的重组酵母Y-IM2、Y-IM3与野生型毕赤酵母Y-IM0菌液分装于灭菌后的50mL容量的离心管中，使用封口膜将离心管口周围封住后，放入冷冻高速离心机6000rpm5min，除去上清后洗涤酵母细胞2次，置于4℃备用。
(2)按融合目的蛋白CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBD摩尔比1：1：1：1以及2：4：2：7将组合酶分别与重组毕赤酵母(Y-IM2和Y-IM3)混合(四个蛋白的总量在体系中的浓度是2.5μM)，混合后液体酵母浓度为OD600＝100，于4℃环境混合孵育2h，完成融合纤维素酶(蛋白)与重组酵母Y-IM2、Y-IM3的自组装。同时将Y-IM0酵母细胞与融合目的蛋白CL7-BGL、CL7-CBHI、CL7-CEL9D和CL7-CBD按摩尔比1：1：1：1混合孵育，作为对照组。
(3)吸取配制好的2×YPA液体培养基、2×YPC液体培养基、2×YPP液体培养基25mL分别置于灭菌烘干后的厌氧瓶中，加入制备的已组装好的重组酵母菌液25mL至厌氧瓶中与培养基混合均匀。厌氧发酵总体积为50mL，OD600＝50。详细厌氧发酵实验中的实验组与对照组如表3所示。
配制好发酵液后，将厌氧瓶瓶塞扣紧，使用铝盖钳口密封。然后使用真空泵将厌氧瓶中气体抽尽后，利用充气设备将厌氧瓶中充满氮气，这一过程重复三次后进行厌氧发酵。
厌氧发酵在28℃220rpm条件下进行，每12小时使用5mL一次性注射器取样1mL置于1.5mL容量EP管中，12000rpm 5min超速离心后将上清转移至新的1.5mL容量EP管中(注意：转移时不要吸取到沉淀菌体)。最后使用封口膜将EP管管口封好，保存于-80℃冰箱等待72h样品收集完成后同时测得乙醇浓度。
(4)从-80℃冰箱中取出厌氧发酵0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取样的发酵液样品，置于室温条件下缓慢溶解，溶解过程中不要打开样品EP管，当样品温度到达室温后使用0.22μm孔径滤膜进行过滤。从4℃冰箱中取出配置好的乙醇(0.5％)定标液升温至室温后使用。将样品稀释到乙醇含量0～1.0g/L，并控制pH值为中性。
使用谢尔曼科技有限公司出产的生物传感器M-100进行乙醇浓度的测定，首先放置定标液于定标样品槽中进行定标，定标通过后重复定标三次，然后进行发酵液样品中所含乙醇浓度的测定，每个样品重复测量三次，最后将三次数据求平均值，作为该发酵液中乙醇浓度最终值。实验结果如图3所示。
表3厌氧发酵生产乙醇实验的实验组与对照组
Figure BDA0002536983200000071
打钩处表示加入相应的组分
含有人造纤维小体酵母菌Y-IM2利用微晶纤维素厌氧发酵时，当CL7-CEL9D：CL7-CBHI：CL7-BGL：CL7-CBD为1:1:1:1时乙醇产量最高可达2.5g/L；Y-IM2利用磷酸膨胀纤维素厌氧发酵时，CL7-CEL9D：CL7-CBHI：CL7-BGL：CL7-CBD为2:4:2:7时，乙醇产量最高为1.2g/L；Y-IM3利用羧甲基纤维素厌氧发酵时，CL7-CEL9D：CL7-CBHI：CL7-BGL：CL7-CBD为1:1:1:1时，乙醇产量最高可达5.1g/L。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 湖北大学
武汉博沃生物科技有限公司
<120> 一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcagcaag ccggtaccgc caccgctgaa aatcatccgc ctttgacctg gcaggaatgt 60
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tgggttcatg atgtcaatgg ttataccaat tgttataccg gcaatacctg ggatccgacc 180
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<211> 1830
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gattatatca atggccaaca taccaagaaa gatagcacca aaggctggca tgatgctggt 480
gattataata aatatgttgt caatgccggc attaccgttg gttctatgtt tttggcttgg 540
gaacatttta aagatcagtt ggaaccggtc gccttggaaa tccctgaaaa gaataatagc 600
atcccggatt ttcttgatga attgaaatat gaaatcgatt ggattttgac catgcaatat 660
cctgatggct ctggtcgtgt tgcccataaa gtcagcaccc gcaattttgg tggctttatt 720
atgccggaaa atgaacatga tgaacgtttc tttgttcctt ggtctagcgc cgctaccgcc 780
gattttgtcg ctatgacagc catggccgct cgtatttttc gcccgtatga tcctcagtat 840
gctgaaaaat gtattaatgc cgctaaagtt agctatgaat ttttgaaaaa taatcctgct 900
aatgtctttg ccaatcaatc tggctttagc accggtgaat atgctaccgt ttctgatgcc 960
gatgatcgct tgtgggccgc tgccgaaatg tgggaaacct tgggtgatga agaatatttg 1020
cgtgatttcg aaaatcgcgc tgcccagttc tctaagaaaa ttgaagctga tttcgattgg 1080
gataatgttg ccaatttggg catgtttacc tatttgttgt ctgaacgtcc gggtaaaaat 1140
cctgccttgg ttcagagcat taaagattct ttgttgagca ccgctgattc tattgtccgt 1200
accagccaaa atcatggcta tggtcgcacc ttgggcacca cctattattg gggctgcaat 1260
ggtaccgttg tccgccagac catgattttg caagttgcca ataaaatcag cccgaataat 1320
gattatgtta atgctgcctt ggatgctatc tctcatgtct tcggtcgtaa ttattataat 1380
cgcagctatg tcaccggctt gggtattaat ccgcctatga atcctcatga tcgtcgctct 1440
ggcgccgatg gtatttggga accgtggcct ggctatttgg ttggtggcgg ttggccgggt 1500
cctaaagatt gggtcgatat tcaggatagc tatcaaacca atgaaattgc cattaattgg 1560
aatgctgcct tgatttatgc tttggccggc ttcgttaatt ataattctgc tcaaaatgaa 1620
gttttgtatg gcgatgtcaa tgatgatggt aaagtcaatt ctaccgattt gaccttgttg 1680
aaacgctatg ttttgaaagc cgtcagcacc ttgccgtcta gcaaagctga aaagaatgct 1740
gatgttaatc gtgatggtcg cgttaattct agcgatgtca ccattttgtc tcgttatttg 1800
attcgcgtca ttgaaaaatt gcctatttaa 1830
<210> 3
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctgatt tcaataaaga ttttcttttc ggtgttgcta ccgccagcta tcaggtcgaa 60
ggcgcctata atgaagatgg tcgttctatg agcatttggg ataccttttg tcgccaagat 120
ggtaaagttt ataaaggtca taatggcgat gtcgcttgcg atcattatca tttgtataaa 180
gatgatgtta aaatgatgaa agatttgggc attgaagctt atcgtttttc tattgcctgg 240
ccgcgcattt ttcctgaaaa aggccattat aatccgaaag gtatcgattt ctataaacgt 300
ttgaccgatg aattgttgaa aaatgatatc aaaccgtttg ttaccattta tcattgggat 360
ttgcctcagt gggccgatga tttgggtggc tggttgaatc gtgaagttgt cgattggttc 420
ggtgaatatg tcagcaaatt gtttaatgaa ttgggtggct atatccgcaa ttggattacc 480
ttgaatgaac cgtggtgttc tagctttttg tcttatttca tcggtgaaca tgctcctggc 540
cataaagatt tgggtgaagc cgttttggtc agccataatt tgttgttggc tcatggtaaa 600
gccgttgaaa tcttccgcga tatcaattct agcgattcta aaatcggcat caccttgaat 660
ttgaatgaag tctttccggc taccgatagc cctgaagata aagccgctgc ccgtattgcc 720
gatggctttc aaaatcgctg gtttttggat ccgatcttca aaggcgaata tcctaaagat 780
atgttggaat tgtttggtaa atatgctaaa accgatttca tcaccgatgg cgatttgaaa 840
cgtatctctc agaaattgga ttttcttggt gttaattatt atacccgcgc tgttgttaag 900
aaaggtaatg atggcatttt gaatgccgaa caaatcgatg ttgataatga aaaaaccgaa 960
atgggctggg aagtctatcc ggaatctttg tataatatct tgatgcgttt gaaaaatgaa 1020
tataccttcg atttgccttt gtatatcacc gaaaatggtg ctgcctataa agatgttgtc 1080
agcgatgatg gccatgttca tgatgaaaaa cgcgtcgaat ttttgaaaaa acatttcaaa 1140
caggctaaac gttttattga tgatggtggc aatttgcgcg gctatttcgt ctggtctttg 1200
atggataatt tcgaatgggc ccatggctat agcaaacgtt tcggtatcgt ttatgtcgat 1260
tatgaaaccg aaaaacgcat tttgaaagat tctgctttgt ggtataaaaa tttgatcagc 1320
acccgtacca tttaa 1335
<210> 4
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgggtgacg ctccggctct ggcttgcgaa atcgaatact ctaccccgaa cacctggtac 60
ggtggtttca ccgctcaggt tcgtatctac aacggttctc acgaatctat cgacggttgg 120
gaactgacct gggacttcac caacggtgaa accatcaacc aggcttggaa cgctaccgct 180
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cacggttctg ttgaattcgg tttcaacgct aactctaccc gtgaaccggg tgttccggaa 300
aacttcaaac tgaacggttc tctgtgctct gttgcttaa 339
<210> 5
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgagcaaaa gcaatgaacc gggtaaagca accggtgaag gtaaaccggt taataacaaa 60
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aatcatcaga aaccgattga acagaatggt ggcgtttatg atatggataa cattagcgtt 360
gttaccccga aacgcaacat tgatattgaa ggc 393
<210> 6
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggaactga aaaacagcat cagcgattat accgaagcag aatttgttca gctgctgaaa 60
gaaatcgaga aagaaaatgt tgcagcaacc gatgatgttc tggatgtgct gctggaacac 120
tttgtgaaaa ttaccgaaca tcctgatggc accgatctga tctattatcc gagcgataat 180
cgtgatgata gtccggaagg tatcgttaaa gaaatcaaag aatggcgtgc agcaaatggt 240
aaaccgggtt ttaaacaagg t 261
<210> 7
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ser Lys Ser Asn Glu Pro Gly Lys Ala Thr Gly Glu Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Glu Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Glu Thr Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Arg Thr
85 90 95
Ser Phe Glu Leu Asn His Gln Lys Pro Ile Glu Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Asn Ile Asp
115 120 125
Ile Glu Gly Met Gln Gln Ala Gly Thr Ala Thr Ala Glu Asn His Pro
130 135 140
Pro Leu Thr Trp Gln Glu Cys Thr Ala Pro Gly Ser Cys Thr Thr Gln
145 150 155 160
Asn Gly Ala Val Val Leu Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Asp Val
165 170 175
Asn Gly Tyr Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Pro Thr Tyr
180 185 190
Cys Pro Asp Asp Glu Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Gly Thr Tyr Gly Val Thr Ser Ser Gly Ser Ser Leu Lys
210 215 220
Leu Asn Phe Val Thr Gly Ser Asn Val Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Gln Asp Asp Ser Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Asn Arg Glu Phe
245 250 255
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
260 265 270
Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
275 280 285
Asn Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln
290 295 300
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asp Gly Glu Ala Asn Val Glu Gly
305 310 315 320
Trp Gln Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly Ile Gly Asp His Gly
325 330 335
Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Asn
340 345 350
Ala Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys Ser
355 360 365
Gly Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asn Asp Arg Tyr Ala Gly Thr
370 375 380
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Thr
385 390 395 400
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Lys Ile Ile Asp Thr Thr Lys Pro Phe Thr
405 410 415
Val Val Thr Gln Phe Leu Thr Asp Asp Gly Thr Asp Thr Gly Thr Leu
420 425 430
Ser Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Ile Gln Asn Ser Asn Val Ile Pro Gln
435 440 445
Pro Asn Ser Asp Ile Ser Gly Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu
450 455 460
Phe Cys Thr Ala Gln Lys Gln Ala Phe Gly Asp Thr Asp Asp Phe Ser
465 470 475 480
Gln His Gly Gly Leu Ala Lys Met Gly Ala Ala Met Gln Gln Gly Met
485 490 495
Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp Tyr Ala Ala Gln Met Leu Trp
500 505 510
Leu Asp Ser Asp Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Thr Thr Pro Gly Ile
515 520 525
Ala Arg Gly Thr Cys Pro Thr Asp Ser Gly Val Pro Ser Asp Val Glu
530 535 540
Ser Gln Ser Pro Asn Ser Tyr Val Thr Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Gly
545 550 555 560
Pro Ile Asn Ser Thr Phe Thr Ala Ser Asn Pro Pro Gly Gly Asn Arg
565 570 575
Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro
580 585 590
Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser
595 600 605
Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro
610 615 620
Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
625 630
<210> 8
<211> 740
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ser Lys Ser Asn Glu Pro Gly Lys Ala Thr Gly Glu Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Glu Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Glu Thr Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Arg Thr
85 90 95
Ser Phe Glu Leu Asn His Gln Lys Pro Ile Glu Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Asn Ile Asp
115 120 125
Ile Glu Gly Met Ala Lys Ile Thr Glu Asn Tyr Gln Phe Asp Ser Arg
130 135 140
Ile Arg Leu Asn Ser Ile Gly Phe Ile Pro Asn His Ser Lys Lys Ala
145 150 155 160
Thr Ile Ala Ala Asn Cys Ser Thr Phe Tyr Val Val Lys Glu Asp Gly
165 170 175
Thr Ile Val Tyr Thr Gly Thr Ala Thr Ser Met Phe Asp Asn Asp Thr
180 185 190
Lys Glu Thr Val Tyr Ile Ala Asp Phe Ser Ser Val Asn Glu Glu Gly
195 200 205
Thr Tyr Tyr Leu Ala Val Pro Gly Val Gly Lys Ser Val Asn Phe Lys
210 215 220
Ile Ala Met Asn Val Tyr Glu Asp Ala Phe Lys Thr Ala Met Leu Gly
225 230 235 240
Met Tyr Leu Leu Arg Cys Gly Thr Ser Val Ser Ala Thr Tyr Asn Gly
245 250 255
Ile His Tyr Ser His Gly Pro Cys His Thr Asn Asp Ala Tyr Leu Asp
260 265 270
Tyr Ile Asn Gly Gln His Thr Lys Lys Asp Ser Thr Lys Gly Trp His
275 280 285
Asp Ala Gly Asp Tyr Asn Lys Tyr Val Val Asn Ala Gly Ile Thr Val
290 295 300
Gly Ser Met Phe Leu Ala Trp Glu His Phe Lys Asp Gln Leu Glu Pro
305 310 315 320
Val Ala Leu Glu Ile Pro Glu Lys Asn Asn Ser Ile Pro Asp Phe Leu
325 330 335
Asp Glu Leu Lys Tyr Glu Ile Asp Trp Ile Leu Thr Met Gln Tyr Pro
340 345 350
Asp Gly Ser Gly Arg Val Ala His Lys Val Ser Thr Arg Asn Phe Gly
355 360 365
Gly Phe Ile Met Pro Glu Asn Glu His Asp Glu Arg Phe Phe Val Pro
370 375 380
Trp Ser Ser Ala Ala Thr Ala Asp Phe Val Ala Met Thr Ala Met Ala
385 390 395 400
Ala Arg Ile Phe Arg Pro Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Glu Lys Cys Ile
405 410 415
Asn Ala Ala Lys Val Ser Tyr Glu Phe Leu Lys Asn Asn Pro Ala Asn
420 425 430
Val Phe Ala Asn Gln Ser Gly Phe Ser Thr Gly Glu Tyr Ala Thr Val
435 440 445
Ser Asp Ala Asp Asp Arg Leu Trp Ala Ala Ala Glu Met Trp Glu Thr
450 455 460
Leu Gly Asp Glu Glu Tyr Leu Arg Asp Phe Glu Asn Arg Ala Ala Gln
465 470 475 480
Phe Ser Lys Lys Ile Glu Ala Asp Phe Asp Trp Asp Asn Val Ala Asn
485 490 495
Leu Gly Met Phe Thr Tyr Leu Leu Ser Glu Arg Pro Gly Lys Asn Pro
500 505 510
Ala Leu Val Gln Ser Ile Lys Asp Ser Leu Leu Ser Thr Ala Asp Ser
515 520 525
Ile Val Arg Thr Ser Gln Asn His Gly Tyr Gly Arg Thr Leu Gly Thr
530 535 540
Thr Tyr Tyr Trp Gly Cys Asn Gly Thr Val Val Arg Gln Thr Met Ile
545 550 555 560
Leu Gln Val Ala Asn Lys Ile Ser Pro Asn Asn Asp Tyr Val Asn Ala
565 570 575
Ala Leu Asp Ala Ile Ser His Val Phe Gly Arg Asn Tyr Tyr Asn Arg
580 585 590
Ser Tyr Val Thr Gly Leu Gly Ile Asn Pro Pro Met Asn Pro His Asp
595 600 605
Arg Arg Ser Gly Ala Asp Gly Ile Trp Glu Pro Trp Pro Gly Tyr Leu
610 615 620
Val Gly Gly Gly Trp Pro Gly Pro Lys Asp Trp Val Asp Ile Gln Asp
625 630 635 640
Ser Tyr Gln Thr Asn Glu Ile Ala Ile Asn Trp Asn Ala Ala Leu Ile
645 650 655
Tyr Ala Leu Ala Gly Phe Val Asn Tyr Asn Ser Ala Gln Asn Glu Val
660 665 670
Leu Tyr Gly Asp Val Asn Asp Asp Gly Lys Val Asn Ser Thr Asp Leu
675 680 685
Thr Leu Leu Lys Arg Tyr Val Leu Lys Ala Val Ser Thr Leu Pro Ser
690 695 700
Ser Lys Ala Glu Lys Asn Ala Asp Val Asn Arg Asp Gly Arg Val Asn
705 710 715 720
Ser Ser Asp Val Thr Ile Leu Ser Arg Tyr Leu Ile Arg Val Ile Glu
725 730 735
Lys Leu Pro Ile
740
<210> 9
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ser Lys Ser Asn Glu Pro Gly Lys Ala Thr Gly Glu Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Glu Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Glu Thr Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Arg Thr
85 90 95
Ser Phe Glu Leu Asn His Gln Lys Pro Ile Glu Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Asn Ile Asp
115 120 125
Ile Glu Gly Met Ser Asp Phe Asn Lys Asp Phe Leu Phe Gly Val Ala
130 135 140
Thr Ala Ser Tyr Gln Val Glu Gly Ala Tyr Asn Glu Asp Gly Arg Ser
145 150 155 160
Met Ser Ile Trp Asp Thr Phe Cys Arg Gln Asp Gly Lys Val Tyr Lys
165 170 175
Gly His Asn Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr His Leu Tyr Lys Asp
180 185 190
Asp Val Lys Met Met Lys Asp Leu Gly Ile Glu Ala Tyr Arg Phe Ser
195 200 205
Ile Ala Trp Pro Arg Ile Phe Pro Glu Lys Gly His Tyr Asn Pro Lys
210 215 220
Gly Ile Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Thr Asp Glu Leu Leu Lys Asn Asp
225 230 235 240
Ile Lys Pro Phe Val Thr Ile Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Trp Ala
245 250 255
Asp Asp Leu Gly Gly Trp Leu Asn Arg Glu Val Val Asp Trp Phe Gly
260 265 270
Glu Tyr Val Ser Lys Leu Phe Asn Glu Leu Gly Gly Tyr Ile Arg Asn
275 280 285
Trp Ile Thr Leu Asn Glu Pro Trp Cys Ser Ser Phe Leu Ser Tyr Phe
290 295 300
Ile Gly Glu His Ala Pro Gly His Lys Asp Leu Gly Glu Ala Val Leu
305 310 315 320
Val Ser His Asn Leu Leu Leu Ala His Gly Lys Ala Val Glu Ile Phe
325 330 335
Arg Asp Ile Asn Ser Ser Asp Ser Lys Ile Gly Ile Thr Leu Asn Leu
340 345 350
Asn Glu Val Phe Pro Ala Thr Asp Ser Pro Glu Asp Lys Ala Ala Ala
355 360 365
Arg Ile Ala Asp Gly Phe Gln Asn Arg Trp Phe Leu Asp Pro Ile Phe
370 375 380
Lys Gly Glu Tyr Pro Lys Asp Met Leu Glu Leu Phe Gly Lys Tyr Ala
385 390 395 400
Lys Thr Asp Phe Ile Thr Asp Gly Asp Leu Lys Arg Ile Ser Gln Lys
405 410 415
Leu Asp Phe Leu Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Ala Val Val Lys Lys
420 425 430
Gly Asn Asp Gly Ile Leu Asn Ala Glu Gln Ile Asp Val Asp Asn Glu
435 440 445
Lys Thr Glu Met Gly Trp Glu Val Tyr Pro Glu Ser Leu Tyr Asn Ile
450 455 460
Leu Met Arg Leu Lys Asn Glu Tyr Thr Phe Asp Leu Pro Leu Tyr Ile
465 470 475 480
Thr Glu Asn Gly Ala Ala Tyr Lys Asp Val Val Ser Asp Asp Gly His
485 490 495
Val His Asp Glu Lys Arg Val Glu Phe Leu Lys Lys His Phe Lys Gln
500 505 510
Ala Lys Arg Phe Ile Asp Asp Gly Gly Asn Leu Arg Gly Tyr Phe Val
515 520 525
Trp Ser Leu Met Asp Asn Phe Glu Trp Ala His Gly Tyr Ser Lys Arg
530 535 540
Phe Gly Ile Val Tyr Val Asp Tyr Glu Thr Glu Lys Arg Ile Leu Lys
545 550 555 560
Asp Ser Ala Leu Trp Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Thr Arg Thr Ile
565 570 575
<210> 10
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ser Lys Ser Asn Glu Pro Gly Lys Ala Thr Gly Glu Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Trp Leu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro
20 25 30
Val Pro Asp Arg Ile Ala Asn Lys Leu Arg Asp Lys Glu Phe Glu Ser
35 40 45
Phe Asp Asp Phe Arg Glu Thr Phe Trp Glu Glu Val Ser Lys Asp Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Gln Phe Ser Arg Asn Asn Asn Asp Arg Met Lys Val
65 70 75 80
Gly Lys Ala Pro Lys Thr Arg Thr Gln Asp Val Ser Gly Lys Arg Thr
85 90 95
Ser Phe Glu Leu Asn His Gln Lys Pro Ile Glu Gln Asn Gly Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Met Asp Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Lys Arg Asn Ile Asp
115 120 125
Ile Glu Gly Met Gly Asp Ala Pro Ala Leu Ala Cys Glu Ile Glu Tyr
130 135 140
Ser Thr Pro Asn Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Thr Ala Gln Val Arg Ile
145 150 155 160
Tyr Asn Gly Ser His Glu Ser Ile Asp Gly Trp Glu Leu Thr Trp Asp
165 170 175
Phe Thr Asn Gly Glu Thr Ile Asn Gln Ala Trp Asn Ala Thr Ala Gln
180 185 190
Gln Ser Gly Thr Thr Val Thr Val Thr Asn Val Ser Trp Asn Ser Thr
195 200 205
Ile Pro His His Gly Ser Val Glu Phe Gly Phe Asn Ala Asn Ser Thr
210 215 220
Arg Glu Pro Gly Val Pro Glu Asn Phe Lys Leu Asn Gly Ser Leu Cys
225 230 235 240
Ser Val Ala

Claims (4)

1.一种利用毕赤酵母发酵纤维素生产乙醇的方法，包括下述步骤：
（1）将n个IM7基因串联整合到毕赤酵母基因组中，构建重组酵母Y-IMn；所述的n为2或3，所述的IM7基因序列为SEQ ID NO.6所示；
（2）将重组酵母Y-IMn与CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBM混合，孵育；
所述的CL7-CBHI的序列为SEQ ID NO.7所示、CL7-CEL9D的序列为SEQ ID NO.8所示、CL7-BGL的序列为SEQ ID NO.9所示、CL7-CBM的序列为SEQ ID NO.10所示；
（3）纤维素加入到步骤（2）的混合物中，进行厌氧发酵，即得乙醇；
所述的纤维素为微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素或羧甲基纤维素。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的CL7-CEL9D、CL7-CBHI、CL7-BGL和CL7-CBM的摩尔比为1:1:1:1或2:4:2:7。
4.利用权利要求1所述的方法在厌氧发酵羧甲基纤维素制备乙醇中的应用。
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