CN111961690A - 一种蒸汽爆破狼尾草批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法 - Google Patents

一种蒸汽爆破狼尾草批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蒸汽爆破狼尾草批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法。本发明提供的批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法包括以下步骤：(1)构建能共代谢木糖和葡萄糖、并且锚定有一级支架蛋白ScafI的重组酵母细胞；(2)在酵母细胞表面组装来源于纤维素酶和半纤维素酶的纤维小体，得到相应的重组酵母细胞；(3)将步骤(1)和步骤(2)中所述的重组酵母细胞进行共培养，通过重组酵母细胞的自组装，形成包含复合功能纤维小体的重组酵母细胞；(4)将步骤(3)中所述重组酵母细胞接种到发酵培养基中，以蒸汽爆破狼尾草为唯一碳源，按照批式补料的方法进行发酵、生产乙醇。利用本发明的方法，发酵96h后获得的乙醇浓度可达2.65g/L。

Description

一种蒸汽爆破狼尾草批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体涉及一种蒸汽爆破狼尾草批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法。
背景技术
生物燃料乙醇主要是指以生物质为原料生产的体积浓度超过99％、辛烷值高达115的一种绿色燃料，其通常与汽油按一定比例混合使用，可以作为汽油良好的增氧剂和调和剂，从而改善汽油的燃烧性能，同时减少汽车尾气中颗粒沉淀物和二氧化碳等的排放[1]。
全球当前生物燃料乙醇的生产主要是以糖质和淀粉质为原料，而随着清洁能源需求的增加，以木质纤维素为原料的第二代生物燃料乙醇可解决以粮食为原料的生物燃料乙醇可能存在“与人争粮、与粮争地”的问题，并将木质纤维素废弃物变废为宝，实现资源化循环利用。
狼尾草为暖季型多年生禾本科牧草，属于C4植物，为一种优质牧草，其产量高、生长周期长、适应性广，目前在我国广泛种植。因此，研究狼尾草属牧草开展能源利用具有广阔的发展前景。
用木质纤维素为原料生产乙醇的过程主要包括：利用木质纤维素原料预处理释放半纤维素和纤维素、底物酶解糖化、发酵产乙醇和浓缩提纯四个步骤。由于木质纤维素中含有木质素和半纤维素组成的“抗降解屏障”，以及木质纤维素的结晶结构，因此木质纤维素的底物酶解糖化是限制以木质纤维素为原料进行乙醇生产的主要技术瓶颈。
基于此研究者们将具有高效水解木质纤维素的厌氧细菌纤维小体组装在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞表面。目前，国内外已有多个实验室在酿酒酵母细胞表面展示并组装了结构简单的嵌合纤维小体，并将纤维素酶或者半纤维素酶组装在嵌合纤维小体结构中，用于水解纤维素或者半纤维素并产生乙醇[2,3,4,5,6]。这些结构简单的嵌合纤维小体通常由酵母细胞表面展示的含有三个粘连模块杂合一级支架蛋白与纤维素酶组成。
2012年，Wilfred Chen[7]课题组在酿酒酵母细胞表面展示了一条含有两个不同粘连模块的一级支架蛋白，并在一级支架蛋白上结合了两个二级支架蛋白，二级支架蛋白中则含有两个不同的粘连模块用于与催化模块结合组装。实验证明，当纤维素酶用量相同时，同时结合两个二级支架蛋白的嵌合纤维小体结构，其磷酸膨胀纤维素((Phosphoric acidswollen cellulose，PASC) 水解效率和乙醇产率是仅结合一个二级支架蛋白结构的2倍，更是在一级支架蛋白上结合纤维素酶结构的4倍。该研究结果说明嵌合纤维小体的支架蛋白数量与结构复杂程度对于提高催化模块的协同效应及纤维小体的水解效率具有明显的促进作用。
同年，范立海等[8]在酿酒酵母细胞表面组装了一个含有若干个二级支架蛋白的嵌合纤维小体。实验结果表明，随着一级支架蛋白上结合的二级支架蛋白数量逐步增加，纤维小体水解纤维素底物的酶活性随之提高，当二级支架蛋白数量增加到2个的时候，水解活性增加且乙醇产率达到最高的1.412 g/L，之后嵌合纤维小体水解效率和乙醇产率随支架蛋白数量的增加而下降。该研究结果进一步说明二级支架蛋白的数量增加能够提高嵌合纤维小体的总活性，这应该主要是归因于二级支架蛋白上催化模块间的空间临近效应和协同效应增加。
上述关于嵌合纤维小体水解发酵纤维素产乙醇的研究存在以下问题：1. 纤维小体水解发酵的底物主要是纤维素或半纤维素，并将所述底物水解成葡萄糖或者木糖，然后被酿酒酵母发酵生产乙醇，尚未见以木质纤维素为底物的研究。2.纤维小体结构中组装的酶的种类较为单一，常见的酶为纤维素酶，或者半纤维素酶，不具备直接降解木质纤维素底物的性能。3.纤维小体结构较为简单，既不能用于提高酶的载量，也无法增强酶分子间的协同效应。4. 纤维小体组装方法主要是将大肠杆菌表达的纤维小体蛋白与酿酒酵母细胞表面展示菌株共孵育组装，该过程操作繁杂，组装效率较低，不利于进行工业化生产。
现有技术中不同嵌合纤维小体水解发酵产乙醇的性能比较如图4所示。
目前有关利用纤维小体在降解木质纤维素发酵产乙醇的研究报道还较少。
参考文献：
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发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术中存在的问题，本发明采用酿酒酵母多细胞组装体系自组装具有共水解纤维素和半纤维素功能的人工纤维小体，实现蒸汽爆破狼尾草高效水解并发酵生产乙醇。
用于解决问题的方案
本发明提供了一种蒸汽爆破狼尾草批式补料同步糖化发酵产乙醇的方法，该方法以蒸汽爆破狼尾草为水解发酵木质纤维素产乙醇的底物，在纤维小体中组装真菌来源的纤维素酶和半纤维素酶，并且采用可以共代谢木糖和葡萄糖、锚定有一级支架蛋白ScafI的酿酒酵母细胞，实现蒸汽爆破狼尾草中半纤维素和纤维素成份充分利用。
所述方法基于酿酒酵母的凝集素展示系统，首先将一级支架蛋白ScafI锚定在酿酒酵母Y5细胞(实验室专利菌种，参见专利 ZL200810222897.7，保藏编号：CGMCC NO.260)表面；然后用酿酒酵母Y6细胞(本发明人构建，见文献“Design and construction ofsynthetic cellulosome with three adaptor scaffoldins for cellulosic ethanolproduction from steam-exploded corn stover”，S Tian,JL Du, ZS Bai,H Jiang,XSYang,et al.，《Cellulose》，2019，26(15)： 8401-8415.)分别分泌表达并在所述一级支架蛋白ScafI上特异性的组装二级支架蛋白ScafII-1和ScafII-2；采用酵母菌群共培养的方式，实现酿酒酵母细胞自组装复合功能纤维小体，即分别在ScafII-1上组装纤维素酶、在ScafII-2上组装半纤维素酶。本发明采用能源草本植物狼尾草为酶解发酵底物，经蒸汽爆破预处后，再利用上述复合功能纤维小体进行批式补料同步糖化发酵生产乙醇。即本发明如下所述：
本发明的第一方面提供了一种批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建能共代谢木糖和葡萄糖、并且锚定有一级支架蛋白ScafI的重组酵母细胞；
(2)在酵母细胞表面组装来源于纤维素酶和半纤维素酶的纤维小体，得到相应的重组酵母细胞；
(3)将步骤(1)和步骤(2)中所述的重组酵母细胞进行共培养，通过重组酵母细胞的自组装，形成包含复合功能纤维小体的重组酵母细胞；
(4)将步骤(3)中所述重组酵母细胞接种到发酵培养基中，以蒸汽爆破狼尾草为唯一碳源，按照批式补料的方法进行发酵、生产乙醇。
其中，所述步骤(1)中所述重组酵母细胞的构建方法为：采用组成型启动子PGK和表面展示信号肽AGA2分别调控一级支架蛋白的编码基因ScafI 的转录和介导ScafI肽链锚定到酵母细胞表面。
所述步骤(2)中所述重组酵母细胞的构建方法包括：i)构建共表达二级支架蛋白ScafII1和ScafII2的酵母重组菌株；ii)构建共表达纤维素酶EGII、 CBHII和BGLI的酵母重组菌株；iii)构建共表达半纤维素酶XylA和XynII的酵母重组菌株。
所述步骤(3)中所述共培养的条件为：在YPD培养基中，分别接入1％ (v/v)、步骤(1)～(2)中所述的酵母重组细胞，于28～32℃，150rpm培养 20～28小时。
步骤(4)中所述发酵培养基为YP-蒸汽爆破狼尾草发酵培养基，该培养基包含：1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，1-2％(w/v)的蒸汽爆破狼尾草，10mmoL CaCl2，pH值为4.5～6.5；所述蒸汽爆破狼尾草在发酵培养基中的含量为10～15g/L，优选为12g/L；所述批式补料的方法为：在第48h和第72h 时分别分批次补加3～5g/L的蒸汽爆破狼尾草，优选为在第48h和第72h时分别分批次补加4g/L的蒸汽爆破狼尾草；所述发酵的总时间为92～100h，优选为 96h；发酵条件为33～38℃、80～100rpm，优选为35℃、90rpm。
在本发明第一方面所述的酵母细胞优选为酿酒酵母细胞。
本发明的第二方面提供了一种基于酵母的凝集素展示系统，所述凝集素展示系统包括：(i)能够共代谢木糖和葡萄糖、锚定有一级支架蛋白ScafI的重组酵母细胞；(ii)能够共表达二级支架蛋白ScafII1和ScafII2的重组酵母细胞；(iii)能够共表达纤维素酶和半纤维素酶的重组酵母细胞；优选的，所述纤维素酶为EGII、CBHII和BGLI，所述半纤维素酶为XylA和XynII，所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
发明的效果
本发明以20g/L的蒸汽爆破狼尾草为水解和发酵的底物，一方面，首次基于酿酒酵母的凝集素展示系统成功实现了二级支架蛋白结构的特异组装，另一方面实现了纤维素酶和半纤维素酶的共结合，可用于共水解纤维素和半纤维素成份。并且，本发明还首次实现了酿酒酵母利用纤维小体同步发酵己糖和戊糖产乙醇的功能，发酵96h时，乙醇浓度达到2.65g/L，比已报道纤维小体发酵产乙醇浓度平均值提高了约50％。此外，本发明的乙醇收率达到理论值的72％，乙醇产生速率达到28mg/L·h。本发明以蒸汽爆破狼尾草水解发酵生产获得的乙醇，其浓度高于目前以嵌合纤维小体水解纤维素或半纤维素发酵产生乙醇的浓度约50％。
为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：
附图说明
图1示出了激光共聚焦免疫荧光显微镜成像验证酿酒酵母细胞表面组装嵌合纤维小体的结果；其中图1中的A示出了纤维素酶与二级支架蛋白ScafII1 组装的结果，图1中的B示出了半纤维素酶与二级支架蛋白ScafII2组装的结果。
图2示出了流式细胞术测定嵌合纤维小体组装效率的结果。
图3示出了蒸汽爆破狼尾草水解发酵生产乙醇的浓度和总糖浓度随时间变化的曲线图。
图4示出了现有技术中不同嵌合纤维小体水解发酵产乙醇的性能比较，其中所述“乙醇产率”为每克糖发酵产乙醇的实际数值与理论值0.51g/g的比值。
具体实施方式
本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
实施例1：重组酿酒酵母菌株的构建
1.1根据NCBI公布的粘连模块基因序列(粘连模块基因及其基因序列编号为:CipA(GI:125972525)，CipC(GI:11056042)和ScaB (GI:13277318))。设计PCR反应引物，引物序列如表1所示。
表1：构建重组载体pYD1-PGK-Aga2-ScafI的引物序列
Figure RE-GDA0002723974600000081
分别以解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、热纤梭菌 (Clostridiumthermocellum)和生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的基因组为基因扩增的模板，扩增支架蛋白ScafI的粘连模块基因，并通过Over-lap PCR方法进行扩增。所述Over-lap PCR 反应体系为：4.0μL dNTPs，2.0μl Primer CipA-F，2.0μL Primer CipC-R，10.0μL5×Q5 Reaction Buffer，0.5μL Q5 DNA Polymerase (NEB有限公司)，CipA、CipC和ScaB基因各1.0μL，加无菌水最终至50.0μL。具体反应条件为：98℃预变性，30s；98℃变性，10 s；56℃退火，30s；72℃延伸45s，反应30个循环。将Overlap PCR 反应产物ScafI进行核酸电泳，鉴定无误后切胶回收，回收方法参照 OMGA琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书。将上述三段基因拼接成 CipA-ScaB-CipC片段，即一级支架蛋白基因ScafI。
然后将其用限制内切酶进行双酶切并插入载体 pYD1-PGK-AGA2(该载体是由PGK启动子(Saccharomyces cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase(PGK1)，GenBank:FJ415226.1) 替换pYD1-GAL1-AGA2载体(Invitrogen,Catalog no.V835-01)中 GAL1启动子构建而成)中，获得构建表面展示一级支架蛋白基因 ScafI的重组载体pYD1-PGK-Aga2-ScafI。
最后采用《精编分子生物学实验指南》中的醋酸锂转化法将所述重组载体pYD1-PGK-Aga2-ScafI转化到酿酒酵母Y5菌株细胞中，通过PCR方法筛选出阳性单克隆，并命名为Y5-ScafI。
1.2在酿酒酵母Y6细胞中分别构建：独立分泌表达ScafII1的重组菌株Y6-ScafII1、独立分泌表达ScafII2的重组菌株Y6-ScafII2、共表达ScafII1和ScafII2的重组菌株Y6-1。
其中ScafII1中粘连模块基因及其基因编号为：ScaA (GI:110171817)，ScaC(GI:148726264)，ScaE(GI:73587447)， CBM3a(GI:CP000568)和Doc-CipA(GI:125975033)，连接顺序为 ScaA-ScaC-CBM3a-ScaE-Doc-CipA。
ScafII2中粘连模块基因及其基因编号为：SdbA(GI:1531592)， OlpA(GI:543808)和Doc-CipC(GI:219998510)，连接顺序为 SdbA-OlpA-Doc-CipC。
基于分泌表达质粒pYD1-PGK-αMF(该质粒是由PGK启动子 (Saccharomycescerevisiae 3-phosphoglycerate kinase(PGK1)， GenBank:FJ415226.1)和分泌信号肽αMF(所述αMF基因片段克隆自pPIC9K载体(Thermofisher，V17520)分别替换pYD1-GAL1-AGA2载体中GAL1启动子和AGA2信号肽构建而成)分别构建重组载体 pYD1-PGK-αMF-ScafII1和pYD1-PGK-αMF-ScafII2。
构建重组载体pYD1-PGK-αMF-ScafII1和 pYD1-PGK-αMF-ScafII2的引物序列如表2所示，其构建过程与本实施例1.1节所述载体的构建方法相同。
表2：构建重组载体pYD1-PGK-αMF-ScafII1和 pYD1-PGK-αMF-ScafII2的引物序列
Figure RE-GDA0002723974600000101
采用醋酸锂转化法将包含上述基因ScafII-1和ScafII-2的重组载体pYD1-PGK-αMF-ScafII1和pYD1-PGK-αMF-ScafII2分别转化到酿酒酵母Y6细胞中。经过酶活测定和Western-blot验证筛选出阳性单克隆酵母菌株，得到重组菌株Y6-ScafII1和Y6-ScafII2。采用醋酸锂转化法将包含上述基因ScafII-1和ScafII-2的重组载体 pYD1-PGK-αMF-ScafII1和pYD1-PGK-αMF-ScafII2同时转化到酿酒酵母Y6细胞中。经过酶活测定和Western-blot验证筛选出阳性单克隆酵母菌株，得到重组菌株Y6-1。
1.3共表达纤维素酶BGLI、CBHII和EGII的菌株Y6-2，以及分别表达上述三种纤维素酶的菌株Y6-EGII、Y6-CBHII和Y6-BGLI的构建。
这三种纤维素酶的基因及其基因序列编号为EGII(GI:170548)， CBHII(GI:289152137)和BGLI(GI:355468368)。设计引物、扩增上述三种纤维素酶基因的成熟肽编码区的基因序列(见表3)，包含上述基因的重组载体pYD1-PGK-αMF-CBHII, pYD1-PGK-αMF-EGII和pYD1-PGK-αMF-BGLI的构建过程与本实施例第1.2节所述方法相同。
表3：构建纤维素酶分泌表达载体的引物序列
Figure RE-GDA0002723974600000111
采用醋酸锂转化法将上述重组载体pYD1-PGK-αMF-CBHII、 pYD1-PGK-αMF-EGII和pYD1-PGK-αMF-BGLI分别转化到酿酒酵母Y6细胞中。经过酶活测定和Western-blot验证筛选出阳性单克隆酵母菌株，得到相应的重组菌株Y6-EGII、Y6-CBHII和Y6-BGLI。
采用醋酸锂转化法将包含上述重组载体 pYD1-PGK-αMF-CBHII、pYD1-PGK-αMF-EGII和pYD1-PGK-αMF-BGLI同时转化到酿酒酵母Y6细胞中。经过酶活测定和Western-blot验证筛选出阳性单克隆酵母菌株，得到相应的重组菌株Y6-2。
1.4共表达半纤维素酶XynII和XylA的菌株Y6-3，以及分别表达上述两种半纤维素酶的菌株Y6-XynII和Y6-XylA的构建。
其中半纤维素酶基因及其编号为XylA(GI:AB013851)和XynII (GI:U24191)。设计引物、扩增这三种纤维素酶基因的成熟肽编码区基因序列(见表4)，包含上述基因的重组载体 pYD1-PGK-αMF-XylA和pYD1-PGK-αMF-XynII的构建过程与本实施例第1.2节所述方法相同。
表4：构建半纤维素酶分泌表达载体的引物序列
Figure RE-GDA0002723974600000121
采用醋酸锂转化法将包含上述重组载体pYD1-PGK-αMF-XylA 和pYD1-PGK-αMF-XynII分别转化到酿酒酵母Y6细胞中。经过酶活测定和Western-blot验证筛选出阳性单克隆酵母菌株，得到重组菌株Y6-XynII和Y6-XylA。
采用醋酸锂转化法将包含上述重组载体pYD1-PGK-αMF-XylA 和pYD1-PGK-αMF-XynII同时转化到酿酒酵母Y6细胞中。经过酶活测定和Western-blot验证筛选出阳性单克隆酵母菌株，得到重组菌株Y6-3。
实施例2：酿酒酵母自组装纤维小体的构建
在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，10mmoL CaCl2， pH为4.5～6.5)培养基中分别接入1％(v/v)实施例1中构建的酿酒酵母 Y5-ScafI、Y6-1和Y6-2细胞，以及分别将实施例1中分别表达纤维素酶(EGII、 CBHII和BGLI)和分别表达半纤维素酶(XylA和XynII)的分泌表达质粒转化酿酒酵母Y6细胞而构建成的重组菌株Y6-EGII、Y6-CBHII、Y6-BGLI、 Y6-XylA和Y6-XynII，于30℃，150rpm培养24小时。采用流式细胞术和激光共聚焦免疫荧光显微镜成像进行组装验证。
如图1所示，以转化pYD1空载体的酿酒酵母Y5细胞作为阴性对照 (NegativeControl)，纤维小体的一级支架蛋白ScafI的C端带有Xpress蛋白标签，与荧光抗体结合后在488nm激光激发下产生绿色荧光，说明ScafI锚定并展示在酿酒酵母Y5细胞表面；催化模块蛋白的C端带有6×His蛋白标签，与荧光抗体结合后在633nm激光激发下产生红色荧光，这说明纤维素酶EGII、 CBHII和BGLI通过二级支架蛋白ScafII1组装在ScafI上，半纤维素酶XynII和 XylA通过ScafII2结合到ScafI上。
实施例3：纤维素酶和半纤维酶的酶活性测定
(1)EG II和CBH II的酶活测定：在SD液体培养基(美坛，M300-03) 中培养重组酵母细胞Y6-EGII或Y6-CBHII至48h后，取500μl粗酶液于试管中，加入1mLmL底物(EGII的底物为1％羧甲基纤维素(Carboxymethyl Cellulose， CMC)，用0.2mM柠檬酸缓冲液配制，pH为5.0；CBHII的底物为1％PASC，用0.2mM醋酸钠缓冲液配制，pH为5.0)，漩涡振荡混匀后在50℃水浴中反应 30min，随后加入2.5mL的DNS显色液，煮沸5min后，在冰水中将其迅速冷却，加超纯水定容至25ml。通过紫外可见分光光度计在540nm处测定吸光值。分别测试3个样品，取其吸光值的平均值。在对照组中先加DNS显色液温浴30 min，再加粗酶液，其余操作与实验组相同，有底物无酶液的为空白对照，用于对分光光度计进行调零。
(2)BGL I的酶活测定：适当稀释后0.1mL的酶液与0.1mL的0.8％ pNPG(对硝基酚-β-葡萄糖苷)溶液(用0.1M醋酸钠溶液配制，pH为5.0) 混合后，37℃下保温10min，立即加入2mL Na2CO3(1M)溶液终止反应，加入10mL的蒸馏水，摇匀，显色后定容至25mL，在405nm下测定吸光值。
(3)Xyn II酶活测定：底物溶液(1％的白桦木聚糖，用pH为5.0醋酸钠缓冲液配制)50℃水浴中预热10min，然后取0.9mL的底物与0.1mL已经适当稀释的粗酶液混合，50℃反应30min，加入1.5mL DNS显色液沸水浴5min，冷水快速冷却，显色后定容至25mL，测定OD540nm吸光值，取三个独立样品的吸光值的平均值。同时，以XynII-SdbA粗酶液沸水浴10min灭活的样品作为空白对照。
(4)XylA酶活测定：0.1mL适当稀释的酶液与0.1mL pNPX(0.8％) 溶液(用0.1M醋酸钠溶液配制，pH为5.0)混合后，37℃下保温10min，立即加入2mL Na2CO3(1M)溶液终止反应，加入10mL的蒸馏水，摇匀，显色后定容至25mL，测定OD405nm吸光值，根据标准曲线计算产物浓度。
如表5所示，本发明所用真菌源纤维素酶和半纤维素酶均具有相应的纤维素或半纤维素水解活性。
表5纤维素酶和半纤维素酶的酶活测定结果
Figure RE-GDA0002723974600000141
实施例4：纤维小体组装效率的测定
取培养20～48h时的在实施例1中制备的重组酿酒酵母细胞于4℃，3000 r/min，离心10min。其中，Y5-ScafI菌株(即图2横坐标中出现的ScI)离心后弃上清，保留细胞沉淀，用BufferA(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10 mM CaCl2)重悬Y5-ScafI细胞；二级支架蛋白及酶蛋白分泌表达菌株 Y6-ScafII1(即图2横坐标中出现的II1)、Y6-ScafII2(即图2横坐标中出现的 II2)、Y6-EGII(即图2横坐标中出现的E)、Y6-CBHII(即图2横坐标中出现的C)、Y6-BGLI(即图2横坐标中出现的B)、Y6-XynII(即图2横坐标中出现的X)和 Y6-XylA(即图2横坐标中出现的A)均保留离心后的培养液上清。
取1mL Y5-ScafI加入1mL二级支架蛋白上清(如ScafII1或ScafII2)，于4℃孵育12h组装，再在4℃，3000r/min离心5min弃上清。然后分别加入1mL 纤维素酶或者半纤维素酶，4℃孵育12h，完成嵌合纤维小体的组装。最后在 4℃，3000r/min离心5min弃上清，收集细胞沉淀备用。
抗体孵育及激光共聚焦显微镜检测过程如下：用1mL的磷酸缓冲液 (PBS)重悬嵌合纤维小体细胞沉淀，4℃下3000r/min离心10min。然后弃上清，在沉淀中加入250μl的1％BSA(用PBS配制)重悬，按比例(1:1000v/v) 加入一抗(Mouse anti-Xpress tag,Rabbitanti-V5 tag或Rabbit anti-6×His tag)混匀，室温孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，使细胞呈悬浮状态。再于4℃， 3000r/min，离心10min，弃上清，用1mL的PBS洗涤细胞沉淀两次。然后重悬细胞沉淀于250μl的1％小牛血清溶液，然后按比例(1:250v/v)加入1μl 二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L)Alexa
Figure RE-GDA0002723974600000151
488，Donkey anti-Rabbit IgG(H+L)Rhodamine或Goat anti-Rabbit IgG(H+L), Alexa
Figure RE-GDA0002723974600000152
647)混匀，置于黑暗处1.5h，不断颠倒混匀，使其始终成悬浮状态。在4℃下5000r/min离心5min，用PBS洗涤细胞沉淀两次，重悬细胞于200μl的PBS中，稀释细胞量为104/mL。通过CSamplerTM Plus流式细胞仪检测样品的荧光强度。操作步骤参照流式细胞仪操作手册，使用BD FACSAria软件进行分数据分析
如图2所示，随着细胞表面锚定的纤维小体蛋白种类和数量增加，相对荧光强度数值随之提高，说明纤维小体的二级支架蛋白、纤维素酶蛋白和半纤维素酶蛋白能够通过Y5细胞表面的ScafI蛋白组装形成复杂结构的人工纤维小体。
实施例5：蒸汽爆破狼尾草批式补料同步糖化发酵生产乙醇
采用12g/L蒸汽爆破狼尾草(其中制备“整齐爆破狼尾草”的蒸汽爆破压力为1.6MPa，保留时间为7min)为唯一碳源，取实施例2中的酵母细胞，按照2g/L的细胞接种量接种于“YP-蒸汽爆破狼尾草发酵培养基”(1％酵母浸粉，2％蛋白胨，2％汽爆狼尾草，20mMCaCl2，用HCl调pH值至5.0， 121℃高压灭菌20min)中，于35℃下90rpm进行水解发酵。然后应用批式补料方法，在第48h和第72h时分别分批次补加4g/L蒸汽爆破狼尾草。该过程共发酵96小时，每间隔12h取样一次，分别采用DNS法和苯酚-硫酸法测定还原糖浓度和剩余总糖浓度，采用高效液相色谱(安捷伦1260)测定乙醇浓度。如图3所示，以汽爆狼尾草为底物发酵96小时，底物降解率达到70％，乙醇浓度达到2.65g/L。与已发表文献(Mo CL,Chen N,LvT et al.,“Direct ethanol production from steam-exploded corn stover using asynthetic diploid cellulase-displaying yeast consortium”，《Bioresources》，2015；10(3):4460-4472.) 的研究结果相比，这相当于使用0.61FPU/mL商业纤维素酶制剂的乙醇生产水平。
本发明证实汽爆狼尾草批式补料同步糖化发酵产乙醇的方法具有可行性，同时能够减少商业化酶制剂的用量，降低木质纤维素原料生产乙醇的成本，简化生产工艺，减少生产设备投入。
序列表
<110> 首都师范大学
<120> 一种蒸汽爆破狼尾草批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgctagca tgacagtcga gatcggcaaa gttac 35
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaactttaa gaccgtctga cggaacattt g 31
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcagacggt cttaaagtta cagtaggaac ag 32
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgatagccca tacactaccg tttgtcttag 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggtagtgta tgggctatcg atacagttac 30
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agctttgttt aaacttaatg atgatgatga tgatgctcga gtacactacc gtttgtc 57
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagggttat aacgttggca atgcaacacc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtgccgac tgcattcgga tcatctgacg 30
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggagctagc aaaagaccca cactttcaat cacaaag 37
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgccaacgt tataaccctg ctcaataccc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tccgaatgca gtcggcactg taacacccgg 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgtttcgcc atcagcattt gatgtctggc 30
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caaatgctga tggcgaaaca gtgcagatat c 31
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cactgtttcg tacgcttccg tttgttacac 30
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cggaagcgta cgaaacagtg ctttcaat 28
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agctttgttt aaactcacgt agaatcgaga ccgaggagag gg 42
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gacgccttcg cctgcacaaa caaacaccat tg 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cttttcatca aggtatgcct ccggagcgga tg 32
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaggatccaa aagagataaa gcctcgagc 29
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caatggtgtt tgtttgtgca ggcgaaggcg tc 32
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
catccgctcc ggaggcatac cttgatgaaa ag 32
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctgcggccgc ttataacaag aatgatttg 29
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcggatccaa aagagatctg tacgacgatg acgat 35
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgctcgagat catcaacatc gccatttgc 29
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcgaattcca agcttgctca agcg 24
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgctatgttt aaacttattt accgaatctt g 31
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgctcgagga tgaactggcg ttctctcctc c 31
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgctatgttt aaacttagcc attgattctg 30
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agctttgttt aaacttatat agttataagt cc 32
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agctttgttt aaacttactg tgcgtcgtaa 30
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaggatccaa aagacaagca aaccaaag 28
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agctttgttt aaacttatat agttataagt cc 32

Claims (10)

1.一种批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建能共代谢木糖和葡萄糖、并且锚定有一级支架蛋白ScafI的重组酵母细胞；
(2)在酵母细胞表面组装来源于纤维素酶和半纤维素酶的纤维小体，得到相应的重组酵母细胞；
(3)将步骤(1)和步骤(2)中所述的重组酵母细胞进行共培养，通过重组酵母细胞的自组装，形成包含复合功能纤维小体的重组酵母细胞；
(4)将步骤(3)中所述重组酵母细胞接种到发酵培养基中，以蒸汽爆破狼尾草为唯一碳源，按照批式补料的方法进行发酵、生产乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中所述重组酵母细胞的构建方法为：采用组成型启动子PGK和表面展示信号肽AGA2分别调控一级支架蛋白的编码基因ScafI的转录和介导ScafI肽链锚定到酵母细胞表面。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中所述重组酵母细胞的构建方法包括：i)构建共表达二级支架蛋白ScafII1和ScafII2的酵母重组菌株；ii)构建共表达纤维素酶EGII、CBHII和BGLI的酵母重组菌株；iii)构建共表达半纤维素酶XylA和XynII的酵母重组菌株。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中所述共培养的条件为：在YPD培养基中，分别接入1％(v/v)、步骤(1)～(2)中所述的酵母重组细胞，于28～32℃，150rpm培养20～28小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中所述发酵培养基为YP-蒸汽爆破狼尾草发酵培养基，该培养基包含：1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，1-2％(w/v)蒸汽爆破狼尾草，10mmoL CaCl2，pH值为4.5～6.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中所述蒸汽爆破狼尾草在发酵培养基中的含量为10～15g/L，优选为12g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中所述批式补料的方法为：在第48h和第72h时分别分批次补加3～5g/L的蒸汽爆破狼尾草；优选的，在第48h和第72h时分别分批次补加4g/L的蒸汽爆破狼尾草。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中所述发酵的总时间为92～100h，优选为96h；发酵条件为33～38℃、80～100rpm，优选为35℃、90rpm。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其中所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
10.一种基于酵母的凝集素展示系统，所述凝集素展示系统包括：(i)能够共代谢木糖和葡萄糖、锚定有一级支架蛋白ScafI的重组酵母细胞；(ii)能够共表达二级支架蛋白ScafII1和ScafII2的重组酵母细胞；(iii)能够共表达纤维素酶和半纤维素酶的重组酵母细胞；
优选的，所述纤维素酶为EGII、CBHII和BGLI，所述半纤维素酶为XylA和XynII，所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
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