CN112646797B - 一种异源表达大球盖菇β-葡萄糖苷酶基因的方法 - Google Patents

一种异源表达大球盖菇β-葡萄糖苷酶基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异源表达大球盖菇β‑葡萄糖苷酶基因的方法。该方法包括如下步骤：（1）在大球盖菇基因组中获得大球盖菇β‑葡萄糖苷酶，并设计引物；（2）提取大球盖菇RNA，反转录成CDNA作为模板，然后进行PCR扩增；（3）使用内切酶对扩增的EC2基因片段、载体质粒PMAL‑c5g分别进行双酶切，并进行片段回收；（4）连接目的片段和空载体片段；（5）连接体系转入感受态细胞转化培养，获得重组载体；（6）将重组载体转至大肠杆菌，选取表达β‑葡萄糖苷酶的大肠杆菌工程菌株。本发明改造的E.coil Rosetta(DE3)重组菌株能够更高效的表达β‑葡萄糖苷酶蛋白，对农业废弃资源进行降解利用。

Description

一种异源表达大球盖菇β-葡萄糖苷酶基因的方法
技术领域
本发明食用菌技术领域，具体涉及一种异源表达大球盖菇β-葡萄糖苷酶基因的方法。
背景技术
我国作为农业生产大国，拥有丰富的农作物秸秆资源。秸秆也是一种生物质能源，是仅次于煤炭、石油和天然气之后第四大能源，并且是唯一可再生的能源。而秸秆主要由纤维素、半纤维素、木质素组成。所以如何充分利用秸秆资源，早已成为科研工作者持续关注的问题。
食用菌作为秸秆资源基料化和原料化的有效利用物种，不仅能够快速的降解秸秆资源，还会产生可观的附加产值。大球盖菇作为食用菌中为数不多的能够在自然条件下对农作物秸秆进行降解的食用真菌，近年来已经在全国范围内大面积的推广和栽培种植。
大球盖菇在降解秸秆过程中主要分泌木质纤维素酶类对复杂的木质纤维素进行降解，其中β-葡萄糖苷酶是能特异性地催化水解低聚糖、烷基和芳香族羟基末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，从而释放葡萄糖单糖分子。在纤维素降解过程中，β-葡萄糖苷酶能够高效地作用于内切葡聚糖酶和外切纤维素酶降解纤维二糖或着纤维寡糖，从而进一步将纤维二糖降解为可利用的葡萄糖。由于其可有效地消除纤维二糖对外切纤维素酶的产物抑制作用，以提高整体纤维素酶的催化效率，从而促进农业秸秆中木质纤维素的降解。基于食用真菌强大的木质纤维素降解酶系，因此，将大球盖菇的β-葡萄糖苷酶进行异源表达研究，以期利用食用真菌的木质纤维素降解酶将难以利用的农业废弃资源（秸秆）进行进一步的整合利用，以避免秸秆资源无法利用造成的浪费和燃烧造成的环境污染等问题。
发明内容
本发明技术目的之一，在于提供了一种来自于人工栽培的大球盖菇（Strophariarugosoannulata）的β-葡萄糖苷酶基因，所述的大球盖菇菌种为上海市农业科学院食用菌所选育品种，已保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为：CGMCC5.2211。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种异源表达大球盖菇β-葡萄糖苷酶基因的方法，包括以下步骤：
（1）在大球盖菇基因组中获得大球盖菇β-葡萄糖苷酶核苷酸序列如SEDQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEDQ ID NO.2所示，并设计引物包括：
EC2-1F：ATCGTCGACATGAAGGACTCCTTTAACGT
EC2-1R: GCCGAATTCTTATCCACAGATATTGGGGT
（2）提取大球盖菇RNA，反转录成CDNA作为模板，然后根据设计的引物EC2-1F、EC2-1R进行PCR扩增；
（3）使用内切酶对扩增的EC2基因片段进行双酶切，并使用胶回收试剂盒进行β-葡萄糖苷酶基因片段回收；
（4）使用和步骤（3）中相同的内切酶对载体质粒PMAL-c5g进行双酶切，并使用胶回收试剂盒进行回收PMAL-c5G空载体片段；
（5）将步骤（3）获得的β-葡萄糖苷酶基因片段和步骤（4）获得的PMAL-c5G空载体片段进行连接；
（6）将步骤（4）的连接体系转入大肠杆菌Top 10感受态细胞转化培养；然后挑取阳性转化子进行PCR验证，并将验证成功的菌株进行测序，选择测序比对成功的菌株，作为重组载体；
（7）将重组载体转至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)中制备重组菌，同时将空载体PMAL-c5g也分别转至E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)中作为对照菌，挑取阳性转化子进行PCR验证，选取验证成功的菌株作为表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌工程菌株。
上述步骤（3）和步骤（4）中，内切酶为SalI和EcoRI；具体酶切体系为：β-葡萄糖苷酶基因片段或PMAL-c5G空载体片段 10ul；10×QC Buffer 3ul；酶Ⅰ 1μl；酶Ⅱ 1μl；补水至30ul，酶切条件为：37℃，1-2小时。
上述步骤（5）中，连接条件如下：SlutionⅠ 5μl，PMAL-c5G空载体片段 3μl，β-葡萄糖苷酶基因片段2μl，4℃， 16小时。
上述步骤（6）中，转化培养条件如下：获得的10μl连接体系，42℃热激90秒转入大肠杆菌Top 10感受态细胞中，加入800-1000μl LB培养基 37℃；200 rpm；复苏1-2小时，后并取100μl菌液涂布Amp抗性的LB平板，37℃ 16小时培养。
和现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的β-葡萄糖苷酶具有对木质纤维素降解强，纯化工艺简单，对原料利用率高的优点。本发明获得的改造的E.coil Rosetta(DE3)重组菌株能够更高效的表达β-葡萄糖苷酶蛋白，应用于木质纤维素降解机理特别是纤维素降解的研究，对农业废弃资源（秸秆）进行降解利用。
附图说明
图1为 实施例1中β-葡萄糖苷酶基因片段胶回收检验电泳图。
图2为实施例1中基因工程菌株构建载体图谱。
图3为 IPTG诱导重组菌株蛋白的表达；M:蛋白标记；1、对照菌IPTG诱导前；2、重组菌IPTG诱导前；3、对照菌IPTG诱导后；4、重组菌IPTG诱导后 ；A:对照菌和重组菌IPTG诱导前后SDS-PAGE胶图 ；B: E.coli BL21(DE3) 和E.coli Rosetta(DE3) 重组菌株β-葡萄糖苷酶蛋白表达量。
图4 为IPTG诱导的重组菌株β-葡萄糖苷酶活性测定；对照菌1为E.coli BL21(DE3)转化空载体PMAL-c5g；重组菌1为E.coli BL21(DE3) 转化PMAL-c5g+ec2; 对照菌2为E.coli Rosetta(DE3)转化空载体PMAL-c5g; 重组菌2为E.coli Rosetta(DE3)转化PMAL-c5g+ec2。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。
（1）在大球盖菇基因组中获得大球盖菇β-葡萄糖苷酶核苷酸序列如SEDQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEDQ ID NO.2所示，并设计引物包括：
EC2-1F：ATCGTCGACATGAAGGACTCCTTTAACGT (SEDQ ID NO.3)
EC2-1R: GCCGAATTCTTATCCACAGATATTGGGGT (SEDQ ID NO.4)
（2）提取大球盖菇RNA，反转录成CDNA作为模板，然后根据设计的引物EC2-1F/1R进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2×Primer star 25μl；EC2-1F 1μl；EC2-1R 1μl；CDNA 1μl；补水至50μl，反应条件为：94℃ 3min； 94℃ 30s； 58℃ 30s；72℃ 60s 循环35次；72℃5min。使用上海生物工程胶回收试剂盒进行回收目的片段。
（3）并使用SalI和EcoRI扩增的EC2基因片段进行双酶切，并使用上海生物工程胶回收试剂盒进行目的片段回收(图1)。 具体酶切体系为：目的片段 10μl；10×QC Buffer 3μl；酶Ⅰ 1μl；酶Ⅱ 1μl；补水至30μl，酶切条件为：37℃，1-2小时。
（4）同时使用的内切酶SalI/EcoRI对载体质粒PMAL-c5g进行双酶切，并使用上海生物工程胶回收试剂盒进行回收空载体片段。然后将获得的β-葡萄糖苷酶基因片段和获得的PMAL-c5G空载体片段进行连接，连接体系为：SlutionⅠ 5μl；PMAL-c5G空载体片段 3μl；目的片段2μl。连接条件为：4℃ 16小时。
（5）同时将获得的10μl连接体系，42℃热激90秒转入大肠杆菌Top 10感受态细胞中，加入800-1000μl LB培养基 37℃；200 rpm；复苏1-2小时，后并取100μl菌液涂布Amp抗性的LB平板，37℃ 16小时培养。
（7）然后挑取阳性转化子进行PCR验证，并将验证成功的菌株送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序比对成功的菌株用于后续实验。
（8）进一步将构建好的重组载体（图2），转至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)中制备重组菌，同时将空载体PMAL-c5g也分别转至E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)中作为对照菌，挑取阳性转化子进行PCR验证，验证成功的基因工程菌株进行下一步实验。
（9）将重组菌和对照菌分别接种到含有氨苄青霉素100μg/ml的LB液体培养基中37℃；200rpm培养4-5h后，测定菌液在600nm 处的吸光度值，当达到0.6时，加入IPTG 使其终浓度为１mmol/L，16℃ 200rpm诱导培养12h，然后测定对照菌和重组菌的β-葡萄糖苷酶蛋白的表达量和酶活性。
（10）取IPTG诱导前后对照菌和重组菌液20μl，加入等体积的上样loading buffer100℃煮10min作为上样蛋白， 采用SDS-PAGE法检测β-葡萄糖苷酶蛋白的表达量，同时用ImageJ软件对胶图灰度处理后的蛋白表达量进行分析如图3所示。E.coli BL21(DE3) 和E.coli Rosetta(DE3)对照菌IPTG诱导前后均无目的蛋白表达；而E.coli BL21(DE3) 和E.coli Rosetta(DE3)重组菌IPTG诱导前存在MBP标签蛋白表达，大小为40 KDa；重组菌IPTG诱导后β-葡萄糖苷酶蛋白大小为50.4 KDa，所以目的条带大小为90.4 KDa；E.coli BL21(DE3) 和E.coli Rosetta(DE3)重组菌蛋白均有β-葡萄糖苷酶蛋白表达（图3A）；对两种重组菌蛋白表达量化分析发现E.coli Rosetta(DE3)的β-葡萄糖苷酶蛋白表达量是E.coli BL21(DE3)的1.67倍（图3B）。
同时，进一步检验对照菌和重组菌分泌的β-葡萄糖苷酶酶活性，酶活性和蛋白含量测定采用苏州科铭生物技术公司试剂盒操作说明进行。首先测定了对照菌和重组菌中的总蛋白含量，同时测定β-葡萄糖苷酶酶活性时通过蛋白的浓度来计算酶的活性，如图4所示。分别测定了对照菌和重组菌总蛋白浓度(图4A)；同时还测定了对照菌和重组菌β-葡萄糖苷酶活性，结果表明，E.coli BL21(DE3) 和E.coli Rosetta(DE3)对照菌基本上没有测到β-葡萄糖苷酶活性；而E.coli Rosetta(DE3)重组菌酶活性比E.coli BL21(DE3) 重组菌酶活性高，且存在显著性差异(图4B)。
因此，本发明获得两种表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌工程菌株，其中，E. coli Rosetta(DE3)转化的工程菌株表达β-葡萄糖苷酶更为高效。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种异源表达大球盖菇β-葡萄糖苷酶基因的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> β-D-Glucosidase
<400> 1
atgaaggact cctttaacgt gctcgtggct ctctcacttg ccttcttgcc tcatgtcctc 60
tctctatcgt atggctttcc atatggctca gaaaaggttc gcggtgtcaa ccttggtggc 120
tggctcgtcc ttgagccatg gattacccct tcaatctttg acaacactgg cgactcacga 180
atagtcgatg aatatacctt cgggcagtac cagagcaaat cgtcagcact gactaccctt 240
cagaaccact ggaatacatg gataacagaa tcagattttg cagccattgc tgctgctggg 300
ctcaatcacg taagattgcc cattggttat tgggcctttg acgtatctgc cggcgagccc 360
tatattcaag gccaacttcc ttacctcacg aaagccgtgg gctgggccca gacgtacggg 420
ctaaaggtta tcgtggatct acatggtgct cctggtagtc agaatggctt tgataattct 480
gggcaacgaa tgagttcccc tatgtggcaa actcagcaga gttacgtcaa ccgcacgaag 540
gcaataataa cgaagttagc aaatatgttt gctaataacg tggacgtggt ccctattata 600
gcacctttga atgaacctgc cggttttgat ggcagtcaaa tcctctcagt caccagacaa 660
tactggtacg acagctatgg aactattaga tttcctttcg gaacctctca gcaaagtaat 720
cttgctgtaa tgattcacga cgctttccag cctctcagct actgggacaa cttcatgcct 780
tctcccagtt ggcagggtgt cttgcttgat acccatattt atcaaatgtt ttcggactct 840
gaagttgcat tttcgaactc tcagcacatc tcagctgcat gtgctcaagc cagtgcgcta 900
actgcgtctc cgctatggct ggtggttgga gagtggactc ctgccgccac agattgtgcc 960
aaatatttga acggtcgcgg tgtcggcgca agatacgatg gatcctttgc tgggtctacc 1020
gctgtgggga gttgcaaggg cctcaccgga agtgcctcta cgtttagctc aagttataaa 1080
actttccttc ggcaattctg ggaagctcag gtcatgtcct atgagaaggg aggccaagga 1140
tggatccagt ggacgtggaa ggcagagaat gcagacgaat ggacctatca ggccgggctg 1200
gctaatggat ggattccaca ggacccgact tcattcaaat accccaatat ctgtggataa 1260
<210> 2
<211> 419
<212> PRT
<213> β-D-Glucosidase
<400> 2
Met Lys Asp Ser Phe Asn Val Leu Val Ala Leu Ser Leu Ala Phe Leu
1 5 10 15
Pro His Val Leu Ser Leu Ser Tyr Gly Phe Pro Tyr Gly Ser Glu Lys
20 25 30
Val Arg Gly Val Asn Leu Gly Gly Trp Leu Val Leu Glu Pro Trp Ile
35 40 45
Thr Pro Ser Ile Phe Asp Asn Thr Gly Asp Ser Arg Ile Val Asp Glu
50 55 60
Tyr Thr Phe Gly Gln Tyr Gln Ser Lys Ser Ser Ala Leu Thr Thr Leu
65 70 75 80
Gln Asn His Trp Asn Thr Trp Ile Thr Glu Ser Asp Phe Ala Ala Ile
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Asn His Val Arg Leu Pro Ile Gly Tyr Trp Ala
100 105 110
Phe Asp Val Ser Ala Gly Glu Pro Tyr Ile Gln Gly Gln Leu Pro Tyr
115 120 125
Leu Thr Lys Ala Val Gly Trp Ala Gln Thr Tyr Gly Leu Lys Val Ile
130 135 140
Val Asp Leu His Gly Ala Pro Gly Ser Gln Asn Gly Phe Asp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Gln Arg Met Ser Ser Pro Met Trp Gln Thr Gln Gln Ser Tyr Val
165 170 175
Asn Arg Thr Lys Ala Ile Ile Thr Lys Leu Ala Asn Met Phe Ala Asn
180 185 190
Asn Val Asp Val Val Pro Ile Ile Ala Pro Leu Asn Glu Pro Ala Gly
195 200 205
Phe Asp Gly Ser Gln Ile Leu Ser Val Thr Arg Gln Tyr Trp Tyr Asp
210 215 220
Ser Tyr Gly Thr Ile Arg Phe Pro Phe Gly Thr Ser Gln Gln Ser Asn
225 230 235 240
Leu Ala Val Met Ile His Asp Ala Phe Gln Pro Leu Ser Tyr Trp Asp
245 250 255
Asn Phe Met Pro Ser Pro Ser Trp Gln Gly Val Leu Leu Asp Thr His
260 265 270
Ile Tyr Gln Met Phe Ser Asp Ser Glu Val Ala Phe Ser Asn Ser Gln
275 280 285
His Ile Ser Ala Ala Cys Ala Gln Ala Ser Ala Leu Thr Ala Ser Pro
290 295 300
Leu Trp Leu Val Val Gly Glu Trp Thr Pro Ala Ala Thr Asp Cys Ala
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Asn Gly Arg Gly Val Gly Ala Arg Tyr Asp Gly Ser Phe
325 330 335
Ala Gly Ser Thr Ala Val Gly Ser Cys Lys Gly Leu Thr Gly Ser Ala
340 345 350
Ser Thr Phe Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Phe Leu Arg Gln Phe Trp Glu
355 360 365
Ala Gln Val Met Ser Tyr Glu Lys Gly Gly Gln Gly Trp Ile Gln Trp
370 375 380
Thr Trp Lys Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Thr Tyr Gln Ala Gly Leu
385 390 395 400
Ala Asn Gly Trp Ile Pro Gln Asp Pro Thr Ser Phe Lys Tyr Pro Asn
405 410 415
Ile Cys Gly
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> EC2-1F
<400> 3
atcgtcgaca tgaaggactc ctttaacgt 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> EC2-1R
<400> 4
gccgaattct tatccacaga tattggggt 29

Claims (4)

1.一种异源表达大球盖菇β-葡萄糖苷酶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在大球盖菇基因组中获得大球盖菇β-葡萄糖苷酶核苷酸序列如SEDQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEDQ ID NO.2所示，并设计引物包括：
EC2-1F：ATCGTCGACATGAAGGACTCCTTTAACGT
EC2-1R: GCCGAATTCTTATCCACAGATATTGGGGT
（2）提取大球盖菇RNA，反转录成CDNA作为模板，然后根据设计的引物EC2-1F、EC2-1R进行PCR扩增；
（3）使用内切酶对扩增的EC2基因片段进行双酶切，并使用胶回收试剂盒进行β-葡萄糖苷酶基因片段回收；
（4）使用和步骤（3）中相同的内切酶对载体质粒PMAL-c5g进行双酶切，并使用胶回收试剂盒进行回收PMAL-c5G空载体片段；
（5）将步骤（3）获得的β-葡萄糖苷酶基因片段和步骤（4）获得的PMAL-c5G空载体片段进行连接；
（6）将步骤（4）的连接体系转入大肠杆菌Top 10感受态细胞转化培养；然后挑取阳性转化子进行PCR验证，并将验证成功的菌株进行测序，选择测序比对成功的菌株，作为重组载体；
（7）将重组载体转至大肠杆菌E. coli Rosetta(DE3)中制备重组菌，同时将空载体PMAL-c5g也分别转至E. coli Rosetta(DE3)中作为对照菌，挑取阳性转化子进行PCR验证，选取验证成功的菌株作为表达β-葡萄糖苷酶的大肠杆菌工程菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中，内切酶为SalI和EcoRI；具体酶切体系为：β-葡萄糖苷酶基因片段或PMAL-c5G空载体片段 10ul；10×QCBuffer 3ul；酶Ⅰ 1μl；酶Ⅱ 1μl；补水至30ul，酶切条件为：37℃，1-2小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，连接条件如下：SlutionⅠ 5μl，PMAL-c5G空载体片段 3μl，β-葡萄糖苷酶基因片段2μl，4℃， 16小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，转化培养条件如下：获得的10μl连接体系，42℃热激90秒转入大肠杆菌Top 10感受态细胞中，加入800-1000μl LB培养基37℃；200 rpm；复苏1-2小时，后并取100μl菌液涂布Amp抗性的LB平板，37℃ 16小时培养。
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