CN1245507C - 一种高温β－葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途 - Google Patents

Abstract

由嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4总DNA获得高温β-葡萄糖苷酶基因(β-glucosidase gene)，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达β-葡萄糖苷酶。通过氨基酸序列比较，该酶为一新型β-葡萄糖苷酶。

Description

一种高温β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其用途

技术领域

本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说，本发明涉及一种编码嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4的β-葡萄糖苷酶DNA序列，还涉及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)可以催化水解多种β葡萄糖苷键，具有底物广谱性。在医药、食品、调味品、能源等工业具有重要应用价值。如在酒精发酵工业，从纤维素质农业废弃物生产酒精成为目前人们关注的热点[Bothast等，现代应用微生物学(Adv.Appl.Microbiol.)44：261-286，1997；Pemberton等，加拿大化学工程杂志(Can.J.Chem.Eng.)58：723-729，1980]。利用生物酶转化纤维素为葡萄糖，需要三种酶协同作用，包括：纤维素酶(EC3.2.1.4)、外切纤维素酶(EC 3.2.1.91)、和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。纤维素酶(EC 3.2.1.4)、外切纤维素酶(EC 3.2.1.91)协同作用于纤维素产生纤维二糖，之后纤维二糖被β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)水解为葡萄糖。通常纤维二糖抑制纤维素酶对纤维素的降解，而β-葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖从而解除其对纤维素酶的抑制作用，因此β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中起重要作用。

β-葡萄糖苷酶已从不同的微生物中分离，如Aspergillus[Kwon等，FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)97：149-154，1992]，Humicola[Peralta等，FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)146：291-295，1997]，Fusarium[Christakopoulos等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)224：379-385，1994]，Volvariella[Cai等，应用和环境微生物学(Appl Environ Microbiol)65：553-559，1999]，Candida[Christopher等，应用和环境微生物学(Appl EnvironMicrobiol)61：518-525，1995]。具有一定热稳定性的β-葡萄糖苷酶主要来自嗜热菌，如Sulfolobus solfataricus[Aguilar等，分子生物学杂志(J Mol Biol)，271：789-802，1997]，Pyrococcus furiosus[Kengen等，欧洲生物化学杂志(EurJ Biochem)213：305-312，1993]，Thermotoga maritime[Gabelsberger等，FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)，109：131-138，1993]，Thermosphaeraaggregans[Chi等，FEMS通讯(FEBS Letters)，445：375-383，1999]，Clostridium thermocellum[Ait等，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)128：569-577，1982]。

关于β-葡萄糖苷酶基因已有专利和文献报道。如：Dion等报道了Thermus thermophilus的β-葡萄糖苷酶基因[糖共轭物杂志(GlycoconjugateJ)，16：27-37，1999]；Gonzalez等报道了芽胞菌Bacillus polymyxa的β-葡萄糖苷酶基因[生物化学和生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)，194：1359-1364，1993]；Wright等报道了Microbispora bispora的β-葡萄糖苷酶基因[应用和环境微生物学(Appl.Environ Microbil)，58：3455-3465，1992]；Paavilainen等报道了Bacillus circulans的β-葡萄糖苷酶基因[应用和环境微生物学(Appl Environ Microbiol)，59：927-932，1993]；Breves等报道了Thermoanaerobacter brockii的β-葡萄糖苷酶基因[应用和环境微生物学(Appl Environ Microbiol)，63：3902-3910，1997]；Lieb等报道了Thermotoga mariti的β-葡萄糖苷酶基因[分子普通遗传学(Mol Gen Genet.)242：111-115，1994]；Tonouchi等报道了Acetobacter xylinum的β-葡萄糖苷酶基因(美国专利USP 6316251，2001年11月31日)。

微生物产生β-葡萄糖苷酶种类多，不同来源的β-葡萄糖苷酶具有多方面不同性质，从而导致各具特色的应用范围。因而需要持续不断地开发新特性β-葡萄糖苷酶以更好地满足工业需要。耐热酶在应用上具有很大优越性，可以提高反应速度、减少污染、增强对化学试剂的耐受力等。因此开发高温β-葡萄糖苷酶酶已成为热点。

发明内容

本发明提出的一种新的高温β-葡萄糖苷酶，其一级结构与已知的β-葡萄糖苷酶不同，它的特性也与已知的β-葡萄糖苷酶不同。

因此，本发明的目的是提供一种新型β-葡萄糖苷酶、及其编码结构基因、重组质粒和重组菌体，该基因表达产物β-葡萄糖苷酶在高温条件下显示活性，可应用于纤维素降解工艺和其他工业过程。同时本发明提供了一种方法，即通过分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它受体菌，由其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的β-葡萄糖苷酶。

本发明研究证明，嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)(薛燕芬等，系统与环境微生物国际杂志IJSEM，51：1335-1341，2001)在高温条件下产生高温β-葡萄糖苷酶，该酶水解纤维二糖形成葡萄糖。

本发明从嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)得到β-葡萄糖苷酶的基因，它是1578bp的DNA，编码一个由526个氨基酸组成的蛋白质。通过分子生物学方法获得了含有该基因的重组质粒，转化大肠杆菌使重组菌株表达β-葡萄糖苷酶。因此本发明同时提供了一种可能性，即通过遗传工程或分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其它受体菌，由其它菌株或在其它培养条件产生本发明涉及的β-葡萄糖苷酶。

为达到本发明的目的，实现本发明的具体技术步骤如下：从嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)中提取总DNA，利用shot-gun技术，得到所需要的DNA片段，连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌DH5α，获得含高温葡萄糖苷酶基因的重组质粒pGLUB及重组大肠杆菌菌株DH5αGLUB。该重组菌表达高温葡萄糖苷酶活性。在可使上述β-葡萄糖苷酶基因表达的条件下培养该重组菌，经活性测定，证明该重组菌表达高温β-葡萄糖苷酶活性。该蛋白质具有高温β-葡萄糖苷酶活性，作用温度60-80℃，pH6-7，可水解纤维二糖产生葡萄糖。测序表明，目的基因含有1578bp，编码一个由526个氨基酸组成的蛋白质。

本发明涉及的β-葡萄糖苷酶是一新型的β-葡萄糖苷酶。新的β-葡萄糖苷酶的一级结构与已知的β-葡萄糖苷酶的不同，与其它已报道的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列相比，相似性小于51％。应当指出的是，对本发明的β-葡萄糖苷酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因而本发明也包括与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有β-葡萄糖苷酶的活性的功能类似物。根据酶的氨基酸序列相似性，目前已知的β-葡萄糖苷酶分属于糖苷水解酶第1和3两个家族。通过对本发明涉及的β-葡萄糖苷酶基因推导的氨基酸序列比较分析，本发明涉及的β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶第3家族中的一员。

本发明涉及的β-葡萄糖苷酶可以在化工、纺织、食品、医药工业方面应用。

本发明涉及的β-葡萄糖苷酶，主要特性如下：

(1)来源于高温厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)或其它衍生菌。衍生菌是指转化有本发明涉及的DNA片段的重组菌株；

(2)它的基因具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列；

(3)它具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列；

(4)具有β-葡萄糖苷酶活性，作用温度60-80℃，pH6-7，分子量59000道尔顿。

进一步按照本发明所述，本发明涉及一DNA序列，该DNA序列编码本发明涉及的β-葡萄糖苷酶，此DNA核苷酸序列：

(1)由SEQ NO.1中的DNA序列组成。

(2)编码一蛋白质，其氨基酸序列如SEQ NO.2中的氨基酸序列。

本发明涉及的DNA序列，除了编码本发明涉及的β-葡萄糖苷酶SEQNO.1外，还应当包括：编码对本发明的β-葡萄糖苷酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物也能达到本发明的目的DNA核苷酸序列，因而本发明也包括编码与SEQNO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有β-葡萄糖苷酶活性的功能类似物的DNA核苷酸序列。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

图1.pGLUB质粒的构建图。

具体实施方式

实施例1.

嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)总DNA的提取

采用从中国云南腾冲热泉分离的嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis MB4)，取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mMEDTA(pH8.0)，混匀后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保温1小时，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％和无水乙醇洗，真空干燥，用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。

β-葡萄糖苷酶基因的克隆

取前面所述的总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2-10kbDNA片段。取2μl(5μg)Sau3AI酶解DNA片段与1μl(1μg)经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pUC18DNA在20μl连接体系进行连接反应，其中含2μl(10X连接缓冲液)，1μl T4DNA连接酶，14μl水。连接体系在16℃反应16小时，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50ug/ml Amp(氨苄青霉素)，0.01％5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucopyranoside的LB固体培养基上。37℃培养16-18小时，然后在60℃培养1-5小时，菌落变蓝色的即为阳性克隆。阳性克隆在Amp-LB培养基中37℃培养16-18小时，经活性测试具有耐热β-葡萄糖苷酶活性。对阳性菌落用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片段插入质粒，其大小约为3.5kb。含该DNA片段的重组质粒称为pGLUB，含此重组质粒pGLUB的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DH5αGLUB。

此重组质粒pGLU可高频转化大肠杆菌表达β-葡萄糖苷酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜热菌MB4的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，证实重组质粒pGLUB中插入的DNA片段来自嗜热菌MB4的染色体DNA。

采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示插入片段含有一个长1578bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个由526个氨基酸组成的蛋白质。属β-葡萄糖苷酶家族，最高相似性同Clostridiumacetobutylicum的β-葡萄糖苷酶基因(51％)。

实施例2.

重组β-葡萄糖苷酶的纯化和特性

重组菌E.coli DH5αGLUB的菌体悬于50mM醋酸缓冲液(pH6.5)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组β-葡萄糖苷酶的粗酶液。此上清酶液70℃加热15分钟，离心去除变性蛋白，上清酶液经离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组β-葡萄糖苷酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为60000道尔顿，与理论上推算的分子量(59000道尔顿)相似；重组酶作用温度为60-80℃，pH6-7。

实施例3

重组β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖

向2％的纤维二糖溶液(用pH6，0.2M的磷酸钠缓冲液配制)中，加0.1V酶液，升温至60℃保温6小时。高压液相色谱法测得重组高温β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生葡萄糖。

                           SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种高温β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其应用

<130>IM021103

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1581

<212>DNA

<213>Thermoanaerobacter tengcongensis MB4

<400>1

atgaagaaaa tagaagaaat gacattggaa gaaaaaatag ggcaaatgct gatgataggt     60

tttccgtcag ctttttacga cgaccatata agagaattag taacaagtta taaaataggg    120

aatgtaatac tcttttcaag aaatgtgcag gatgcaaggc aagtaatgga tttatgcact    180

gacatacaga aagaagcaat agaaaatacc ggaataccag cttttatctc tattgaccag    240

gaaggtggca tggtcacaag gatttacaga ggagctactt attttcccgg caatatggct    300

attggtgcta caaaagaccc agaaaatgct tataaagtgg gagaaatagc tggaagagaa    360

ttaagaacta taggcataaa cataaatttc gctccggtta tggatgtgaa caataaccct    420

ttaaatccag tgataggagt caggtcttac ggtgaaaacc cagaggatgt ggctaatttt    480

ggaataaact acataaaagg gcttcaaaaa gaaggtgtga tagctacagc taaacatttc    540

ccaggacatg gagacacaac tgtggattct caccttgatt taccgaaagt caatcatggc    600

aaggataggc tttatgaagt ggaattatat ccgtttaaga aagctgtaga aaatggcgta    660

gatgcgataa tgacagctca tatacttttt ccggctttag aagatagtaa agttcctgca    720

actctttctt ataatatcct tacccgcatc ttaagggaag aattcaagtt tgatgggctt    780

gttataactg actgtatgga aatgaatgcg atagccaaat attttggcac tcaaaaggca    840

gcgtcaatgg ctataaaagc tggagcagat atagtacttg tttctcatac taaagagcta    900

cagataaaag cttttgaaaa tataaaagaa gctgtagaaa gaggagatat ctctgtagaa    960

agaatagatg aatcagtaag aaggatactc aagatgaaag aaaaatatgg actttttgat   1020

aggccatatc ctgagaaaga caaatttgac accacagttg gaattgagaa acatagaaaa   1080

attgcaaaag ccataagttt aaagagcata acagttgtta aagatgagaa aaaattaatc   1140

cctttaaaga cgaaaaatgt actggcaatt tctcctgaaa cagttccggt ttcttttgta   1200

gacgatgctt tgatggatag gctttctttt gcaagacaat ttacttctac atttggagga   1260

gtagaagaaa ctatttctgt aaatccaaac aatagagaaa tctcagtaat tctagaaaag   1320

gcaaaggata aagaagtagt tgtcgtaggt acttacaatg ctaatttaaa tgaaggtcaa   1380

gtaaaactag taaacgcact tttgcaagtg aacaaaaatg taattgttgt agctttgaga   1440

aatccttatg accttcaaaa gtttgaaaat gtgcctactt atgtatgtgc ttacgagtac   1500

accccattgt cagtagaaag cgtgatagga gtcttgacgg ggaaatatcc tgctgaagga   1560

aaacttcctg tgaccatatg a                                             1581

<210>2

<211>526

<212>PRT

<213>Thermoanaerobacter tengcongensis MB4

<400>2

Met Lys Lys Ile Glu Glu Met Thr Leu Glu Glu Lys Ile Gly Gln Met

1               5                   10                  15

Leu Met Ile Gly Phe Pro Ser Ala Phe Tyr Asp Asp His Ile Arg Glu

            20                  25                  30

Leu Val Thr Ser Tyr Lys Ile Gly Asn Val Ile Leu Phe Ser Arg Asn

        35                  40                  45

Val Gln Asp Ala Arg Gln Val Met Asp Leu Cys Thr Asp Ile Gln Lys

    50                  55                  60

Glu Ala Ile Glu Asn Thr Gly Ile Pro Ala Phe Ile Ser Ile Asp Gln

65                  70                  75                  80

Glu Gly Gly Met Val Thr Arg Ile Tyr Arg Gly Ala Thr Tyr Phe Pro

                85                  90                  95

Gly Asn Met Ala Ile Gly Ala Thr Lys Asp Pro Glu Asn Ala Tyr Lys

            100                 105                 110

Val Gly Glu Ile Ala Gly Arg Glu Leu Arg Thr Ile Gly Ile Asn Ile

        115                 120                 125

Asn Phe Ala Pro Val Met Asp Val Asn Asn Asn Pro Leu Asn Pro Val

    130                 135                 140

Ile Gly Val Arg Ser Tyr Gly Glu Asn Pro Glu Asp Val Ala Asn Phe

145                 150                 155                 160

Gly Ile Asn Tyr Ile Lys Gly Leu Gln Lys Glu Gly Val Ile Ala Thr

                165                 170                 175

Ala Lys His Phe Pro Gly His Gly Asp Thr Thr Val Asp Ser His Leu

            180                 185                 190

Asp Leu Pro Lys Val Asn His Gly Lys Asp Arg Leu Tyr Glu Val Glu

        195                 200                 205

Leu Tyr Pro Phe Lys Lys Ala Val Glu Asn Gly Val Asp Ala Ile Met

    210                 215                 220

Thr Ala His Ile Leu Phe Pro Ala Leu Glu Asp Ser Lys Val Pro Ala

225                 230                 235                 240

Thr Leu Ser Tyr Asn Ile Leu Thr Arg Ile Leu Arg Glu Glu Phe Lys

                245                 250                 255

Phe Asp Gly Leu Val Ile Thr Asp Cys Met Glu Met Asn Ala Ile Ala

            260                 265                 270

Lys Tyr Phe Gly Thr Gln Lys Ala Ala Ser Met Ala Ile Lys Ala Gly

        275                 280                 285

Ala Asp Ile Val Leu Val Ser His Thr Lys Glu Leu Gln Ile Lys Ala

    290                 295                 300

Phe Glu Asn Ile Lys Glu Ala Val Glu Arg Gly Asp Ile Ser Val Glu

305                 310                 315                 320

Arg Ile Asp Glu Ser Val Arg Arg Ile Leu Lys Met Lys Glu Lys Tyr

                325                 330                 335

Gly Leu Phe Asp Arg Pro Tyr Pro Glu Lys Asp Lys Phe Asp Thr Thr

            340                 345                 350

Val Gly Ile Glu Lys His Arg Lys Ile Ala Lys Ala Ile Ser Leu Lys

        355                 360                 365

Ser Ile Thr Val Val Lys Asp Glu Lys Lys Leu Ile Pro Leu Lys Thr

    370                 375                 380

Lys Asn Val Leu Ala Ile Ser Pro Glu Thr Val Pro Val Ser Phe Val

385                 390                 395                 400

Asp Asp Ala Leu Met Asp Arg Leu Ser Phe Ala Arg Gln Phe Thr Ser

                405                 410                 415

Thr Phe Gly Gly Val Glu Glu Thr Ile Ser Val Asn Pro Asn Asn Arg

            420                 425                 430

Glu Ile Ser Val Ile Leu Glu Lys Ala Lys Asp Lys Glu Val Val Val

        435                 440                 445

Val Gly Thr Tyr Asn Ala Asn Leu Asn Glu Gly Gln Val Lys Leu Val

    450                 455                 460

Asn Ala Leu Leu Gln Val Asn Lys Asn Val Ile Val Val Ala Leu Arg

465                 470                 475                 480

Asn Pro Tyr Asp Leu Gln Lys Phe Glu Asn Val Pro Thr Tyr Val Cys

                485                 490                 495

Ala Tyr Glu Tyr Thr Pro Leu Ser Val Glu Ser Val Ile Gly Val Leu

            500                 505                 510

Thr Gly Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Lys Leu Pro Val Thr Ile

        515                 520                 525

Claims (9)

1.一种来源于嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列由SEQ NO.2所示的氨基酸序列或对SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸替换、插入或缺失所得到的具有同样功能的氨基酸序列组成。

2.一种编码权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列由SEQ NO.1所示的核苷酸序列组成。

4.一种含有权利要求3所述的基因的重组质粒，是pGLUB。

5.一种含有权利要求2或3所述的β-葡萄糖苷酶的基因的表达载体。

6.一种含有权利要求5所述表达载体的重组菌。

7.一种含有权利要求5所述表达载体的重组大肠杆菌DH5αGLUB。

8.一种制备β-葡萄糖苷酶的方法，包括用权利要求6所述的重组菌通过微生物发酵和酶工程制备高温β-葡萄糖苷酶。

9.通过权利要求8的方法得到的高温β-葡萄糖苷酶在化工、纺织、食品或医药工业方面应用。