CN112143745A - 一种β-木糖苷酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种β‑木糖苷酶及其应用。本发明提供了一种编码β‑木糖苷酶的基因，β‑木糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码β‑木糖苷酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供的β‑木糖苷酶具有耐酸性及热稳定性，并且具有协助木聚糖酶水解木聚糖的能力，有利于其在生物质转化过程中的使用。

Description

一种β-木糖苷酶及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种β-木糖苷酶及其应用。

背景技术

来自工业和农业活动中的具有木质纤维素组合物废物的污染是主要的环境问题；然而，它们可以是低成本的可再生的起始材料，这种有价值的资源可以用于生产各种化学品和燃料，例如乙醇。为了利用废料中多糖部分生产乙醇，这些木质纤维素需要有效地水解成木糖。

木糖可通过微生物如酵母和假丝酵母念珠菌的发酵将木糖转化为乙醇，并且在啤酒生产过程中，由于生产原料中含有较高的β-葡聚糖及木聚糖，使得生产出来的啤酒会出现酒液混浊，啤酒滤膜堵塞等一系列问题，影响啤酒的质量，同时也使啤酒生产成本提高。通过研究发现利用β-木糖苷酶等酶，可解决上述出现的一些问题，提升啤酒品质，降低啤酒生产成本，因此木β-木糖苷酶在啤酒酿造行业具有潜在的应用前景。

目前，工业化β-木糖苷酶的生产主要通过传统固态发酵和液态发酵两种方法，相比于液态发酵，固态基质中水不溶性成分高，为微生物尤其是丝状真菌提供了良好的附着位点，微生物生长环境良好，酶产量高且酶系丰富。但固态发酵存在一些不可避免的缺点，例如发酵过程中产生过多次级代谢产物，为后期纯化带来困难。基于固态发酵的缺陷，利用毕赤酵母液态发酵异源表达β-木糖苷酶可有效解决上述问题。

然而，现有的β-木糖苷酶的适应pH值在偏酸和中性范围内，对温度的耐受也仅在50℃以下。这使得β-木糖苷酶在能源转化，尤其是生物酒精发酵的过程中受限制。因此发现新型的耐酸耐高温的β-木糖苷酶对工业生产具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出一种编码β-木糖苷酶的基因，所述β-木糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明基于PCR的方法克隆了β-木糖苷酶Ao-Xyl的核酸序列，序列分析结果表明，β-木糖苷酶结构基因全长2616bp，前57位为信号肽编码序列，无内含子序列。

根据本发明的实施例，该β-木糖苷酶Ao-Xyl包括870个氨基酸和一个终止密码子，N端分析前19位氨基酸为信号肽序列，去除信号肽后，成熟的β-木糖苷酶的理论分子量为94.51kDa。本发明获得的β-木糖苷酶具有生物活性，酶活力为481.03U/mL，并且具有较好的耐酸性和耐热性；其最适pH值为5.5，在pH 3～7的范围内稳定；最适温度为50℃，在60℃以下范围内具有较高的酶活力。

在本发明的第二方面中，根据本发明实施例，提供了一种表达载体，其包含上述编码β-木糖苷酶的多核苷酸。其中，多核苷酸为DNA序列。

在本发明的第三方面中，根据本发明实施例，提供了一种重组菌株，由前述表达载体转化宿主细胞获得。其中，宿主细胞采用毕赤酵母SMD1168。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备β-木糖苷酶的方法，其包括下列步骤：

1)以米曲霉基因组DNA为模板，通过设计特异性引物，利用PCR的方法扩增β-木糖苷酶基因序列；其中，米曲霉的保藏编号为CCTCC NO:M2019357，保藏名称为米曲霉Aspergillus oryzae sp.FJ0123；

2)将所述β-木糖苷酶基因克隆到质粒中，得到上述表达载体；

3)将所述表达载体转化宿主细胞，得到上述重组菌株；

4)将所述重组菌株在发酵罐上诱导表达，得到所述β-木糖苷酶。

根据本发明实施例，本发明通过设计了特异引物，利用PCR的技术方法将编码米曲霉β-木糖苷酶成熟蛋白的核酸序列从米曲霉基因组中扩增出来，克隆到载体上，获得一定拷贝数后，酶切酶连至毕赤酵母表达载体pPIC9K，构建重组表达载体pPIC9K-Ao-Xyl，采用电击法转化毕赤酵母SMD1168中，采用甲醇进行诱导表达，离心的上清中的β-木糖苷酶再进行纯化得到耐酸β-木糖苷酶。

根据本发明的实施例，上述方法还可以包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述步骤4)中，将所述重组菌株接种于罐上发酵培养基中进行甲醇诱导罐诱导表达。

根据本发明的实施例，所述甲醇诱导罐诱导表达包括：甘油分批发酵阶段、饥饿阶段及甲醇流加阶段。

在本发明的第五方面中，本发明提出了前述方法制得的β-木糖苷酶。如前所述，根据本发明的实施例，可制备出在酸性环境下酶活力高，且对于酸性环境的耐受能力强；在60℃条件下稳定，且对于其他影响因子例如金属离子、有机溶剂、抑制剂和表面活性剂都具有良好的耐受能力的β-木糖苷酶，这使得其在工业化生产中应用较为广泛。

在本发明的第六方面中，根据本发明实施例，本发明还提出了上述β-木糖苷酶在水解木聚糖中的应用。

β-木糖苷酶Ao-Xyl具有协同木聚糖酶处理木聚糖的能力，在这基础上，甘蔗渣水解实验中，Ao-Xyl与木聚糖酶、纤维素酶、纤维二糖酶(β-葡萄糖苷酶)对于木质纤维素的水解有着积极的效果。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为米曲霉β-木糖苷酶Ao-Xyl基因PCR扩增电泳结果；M：DL5000 marker，1-4：梯度扩增产物；

图2为菌液PCR鉴定pMD19T-Ao-Xyl克隆载体；其中M：DL5000 marker，1-5：通用性引物扩增结果，6-10：特异性引物扩增结果；

图3为菌液PCR鉴定pPIC9K-Ao-Xyl表达载体；其中M：DL5000 marker，1-5：通用性引物扩增结果，6-10：特异性引物扩增结果；

图4为线性化表达载体pPIC9K-Ao-Xyl电泳结果；M：DL15000 marker，1：未线性化质粒，2：线性化质粒；

图5为破壁PCR鉴定阳性酵母转化子电泳结果；M：DL5000 marker，1-5：特异引物验证，6-10：通用引物验证；

图6为甲醇诱导阳性转化子表达的表达产物SDS-PAGE电泳结果；1：蛋白marker，2-16：8-120h内每隔8h样品；

图7为甲醇诱导阳性转化子罐上表达的β-木糖苷酶Ao-Xyl活力变化曲线；

图8为重组β-木糖苷酶Ao-Xyl纯化结果SDS-PAGE电泳分析；

图9为Ao-Xyl结构域对比分析；

图10为Ao-Xyl氨基酸序列比对；

图11为Ao-Xyl进化树分析；

图12为Ao-Xyl最适反应温度及热稳定性测定曲线；

图13为Ao-Xyl最适反应pH及pH稳定性测定曲线；

图14为Ao-Xyl其他酶学性质；

图15为Ao-Xyl协同木聚糖酶处理木聚糖；

图16为Ao-Xyl与木聚糖酶和纤维素酶协同水解甘蔗渣还原糖变化曲线；(1)10U木聚糖酶(2)10U纤维素酶(3)10Uβ-木糖苷酶+10U木聚糖酶(4)10Uβ-木糖苷酶+10U木聚糖酶+10U纤维素酶(5)10Uβ-木糖苷酶+10U木聚糖酶+10U纤维素酶+10Uβ-葡萄糖苷酶。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实验材料和试剂

1.菌株及载体：本发明所用米曲霉，从厦门红树林采集土壤样品，通过平板初筛，固体发酵产酶复筛，根据酶活筛选，获得稳定传代菌株，对其进行菌种鉴定后，保藏于中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M2019357，分类命名为Aspergillus oryzae sp.FJ0123米曲霉FJ0123。克隆载体pMD-19T购于TaKaRa公司，毕赤酵母表达载体pPIC9k及菌株SMD1168购自于Invitrogen公司。

2.酶类及其他生化试剂：内切酶及连接酶购自TaKaRa公司，对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷购自上海源叶生物公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3.溶液及培养基：

(1)PDA培养基(用于保藏米曲霉)：去皮土豆200g，用蒸馏水煮至软而不烂后用八层纱布过滤取汁，加入20g葡萄糖及20g琼脂，定容至1L，分装至试管后121℃高压蒸汽灭菌20min，摆斜面冷却备用。

(2)LB培养基：蛋白胨10％，酵母粉5％，NaCl 10％，2％的琼脂，用于大肠杆菌的培养。

(3)YPD培养基：酵母粉10％，蛋白胨20％，葡萄糖20％，pH6.0，用于毕赤酵母的培养。

(4)MD培养基；葡萄糖20g，琼脂粉20g，用0.9L蒸馏水溶解，121℃高压灭菌20min，使用时分别加入无菌的10×YNB 100mL，以及0.02％生物素2mL，用于毕赤酵母的平板培养。

(5)BMGY培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，加0.7L蒸馏水溶解，121℃高压灭菌20min，冷却后在超净工作台内分别加入无菌的磷酸盐缓冲液100mL(1M，pH 6.0)，10×YNB100mL，10×甘油溶液100mL以及0.02％生物素溶液2mL，用于毕赤酵母的培养。

(6)BMMY培养基：将上述BMGY培养基中的碳源替换成为终浓度为0.5％的甲醇溶液100mL，用于毕赤酵母的诱导培养。

(7)罐上发酵培养基：85％磷酸80.1mL，0.093％CaSO₄，1.82％K₂SO4，0.41％KOH，1.5％MgSO₄·7H2O，4％甘油，0.5％酵母膏，0.5％蛋白胨，0.1％消泡油(v/v)，溶解后定容至3L，注入发酵罐中，121℃高压灭菌20min，冷却后备用，用于毕赤酵母的培养。

需要说明的是：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1米曲霉基因组提取

接种米曲霉(Aspergillus oryzae sp.FJ0123)菌株于PDA斜面上，30℃，培养4d后，生理盐水制备孢子悬液，调至OD₆₀₀为2.0，孢子悬液接入50mL带玻璃珠的PDA液体培养基中，于30℃、180rpm振荡培养24h，12000rpm离心收集菌体，菌体在液氮中快速研磨，直至研磨成细小白色粉末，后用Plant Genomic DNA Extraction Kit按照其说明书操作，提取基因组DNA。

实施例2β-木糖苷酶基因的PCR扩增

根据NCBI上预测的β-木糖苷酶基因(XM001817927.1)序列信息，利用Premier公司的Primer Premier 5设计引物，引物序列如下：

Ao-Xyl-F1：5’-ATGCCTGGTGCAGCGT-3’(SEQ ID NO：3)；

Ao-Xyl-R1：5’-CTATTGCGGCGCAATCAACT-3’(SEQ ID NO：4)；

以实施例1的米曲霉基因组DNA作为模板进行PCR扩增。反应参数为：95℃变性5min，94℃变性155sec，55-58℃梯度退火5sec，72℃延伸3min，30个循环后72℃保温10min，得到一段约2600bp片段，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果如图1所示，将该片段回收后送伯瑞生物技术有限公司测序。拼接后β-木糖苷酶Ao-Xyl基因全长为2616bp，编码870个氨基酸和一个终止密码子。

使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析表明，拼接后β-木糖苷酶N端前19个氨基酸为信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为94.51kDa。

实施例3重组克隆质粒pMD19T-Ao-Xyl的构建

1)β-木糖苷酶基因扩增产物与克隆载体连接

将实施例2得到的完整β-木糖苷酶基因重新进行扩增，得到的产物进行回收纯化与pMD19-T Simple vector(购自Takara公司)连接构建重组克隆质粒。

连接反应按照pMD19-T Simple vector连接试剂盒提供的说明书进行。在0.2mLPCR管中依次加入下列成分：

混匀后，瞬时离心，16℃下连接4h，获得连接产物。

2)大肠杆菌DH5α化学转化感受态细胞的制备

①使用LB平板培养基，用接种环挑取大肠杆菌(-20℃甘油保藏菌株)，在平板上分级划线，于37℃倒置培养14-16h。

②从LB平板上挑取活化的E.coli DH5α单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养12h。

③将上述培养物以1：100的比例接种于100mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5左右，放置冰上停止培养。

④取上述菌液1mL转入1.5mL离心管中，4000rpm，4℃离心10min，弃去上清。

⑤之后按Competent Cell Preparation Kit(Takara公司制备大肠感受态的试剂盒)说明书进行。

⑥冰上将感受态细胞分装成50μL/管，-80℃保存，获得感受态细胞DH5α。

3)克隆载体的转化及阳性转化子鉴定

从-80℃冰箱中取上述的感受态细胞DH5α，迅速冰浴解冻。取上述连接产物加入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s后，立即冰浴2min，加入1mL LB液体培养基，37℃复苏2h。接着取200μL菌液涂布于含有Amp抗性(终浓度为100μg/mL)的LB平板上，于37℃倒置培养12-16h。

挑取阳性单菌落接种到含有Amp抗性(终浓度为100μg/mL)的5mL LB液体培养基中，37℃、180rpm过夜培养。然后，通过菌液PCR验证阳性单菌落和测序分析表明克隆载体成功转化。

PCR验证的反应总体积为15μL，在0.2mL PCR管中依次加入下列成分：

混匀后瞬时离心，反应参数为：94℃变性2min；94℃变性30sec，57℃梯度退火30sec，72℃延伸1min30 sec，28个循环后72℃保温10min。

菌液PCR结果如图2所示，3个阳性转化子综合测序结果显示米曲霉β-木糖苷酶基因成功的连接到pMD19-T载体中。

实施例4重组表达载体pPIC9K-Ao-Xyl的构建

1)待插入的β-木糖苷酶基因片段的制备：

考虑到基因本身携带的信号肽序列会对毕赤酵母异源表达造成干扰，因此在设计引物时将上述预测的信号肽去除，并且加上酶切位点，引物序列如下：

Ao-Xyl-F2：5’-CCGGAATTCCAAGCAAACCAAAGCTACGT-3’(SEQ ID NO：5)，5’分别引入保护碱基和EcoRⅠ酶切位点(下划线)

Ao-Xyl-R2：5’-ATTTGCGGCCGCCTATTGCGGCGCAATCAACT-3’(SEQ ID NO：6)，5’分别引入保护碱基和Not I酶切位点(下划线)

以pMD19T-Ao-Xyl重组质粒作为模板，反应总体积为50μL，在0.2mL PCR管中依次加入下列成分：

混匀后瞬时离心，反应参数为：95℃变性5min；95℃变性15sec，57℃梯度退火5sec，72℃延伸3min，30个循环后72℃保温10min。

用小量DNA片段快速胶回收试剂盒(购自Takara公司)回收上述去除信号肽的米曲霉β-木糖苷酶基因，操作按产品说明书提供的步骤进行。

根据设计的上下游引物所带的酶切位点，选用EcoRⅠ酶和NotⅠ酶对所回收纯化的β-木糖苷酶基因PCR产物进行双酶切，20μL酶切体系，如下：

混匀后瞬时离心，37℃酶切12h。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。将目的条带切下放入1.5mL离心管中。用小量DNA片段快速胶回收试剂盒(购自Takara公司)，操作按产品说明书提供的步骤进行纯化回收。

2)毕赤酵母表达载体pPIC9K(购自Invitrogen公司)双酶切及其回收

双酶切采用20μL体系，如下：

混匀后瞬时离心，37℃酶切12h。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。将目的条带切下，放入1.5mL离心管中。使用小量DNA片段快速胶回收试剂盒(购自Takara公司)，按产品说明书提供的步骤进行纯化回收。

3)酶切片段与表达载体的连接

将上述步骤1)获得的米曲霉β-木糖苷酶基因，与上述步骤2)获得的表达载体pPIC9K酶连，构建成表达载体pPIC9K-Ao-Xyl。连接体系如下：

混匀后瞬时离心，16℃下连接8h，获得连接产物。

4)连接产物转化大肠感受态细胞DH5α及阳性转化子验证

从-80℃冰箱中取上述实施例3的感受态细胞DH5α，迅速冰浴解冻。取上述步骤3)获得连接产物加入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s后，立即冰浴2min，加入1mL LB液体培养基，37℃复苏2h。取200μL菌液涂布于含有Amp抗性(终浓度为100μg/mL)的LB平板上，37℃倒置培养12～16h。

挑取阳性单菌落接种到含有Amp抗性(终浓度为100μg/mL)的5mL LB液体培养基中，37℃、180rpm过夜培养，通过菌液PCR验证阳性单菌落和测序分析表明表达载体成功转化。

反应总体积为15μL，在0.2mL PCR管中依次加入下列成分：

混匀后瞬时离心，反应参数为：94℃变性2min；94℃变性30sec，57℃梯度退火30sec，72℃延伸1min30 sec，28个循环后72℃保温10min。

菌液PCR结果如图3所示，2个阳性转化子且综合测序结果显示米曲霉β-木糖苷酶基因成功的连接到pPIC9K载体中。

实施例5表达载体pPIC9K-Ao-Xyl转化毕赤酵母SMD1168

1)将实施例4构建的表达载体pPIC9K-Ao-Xyl利用PmeⅠ单酶切线性化，线性化采用20μL体系，线性化加入下列成分：

混匀，瞬时离心，反应条件：37℃反应12h，反应完成后，用琼脂糖凝胶电泳检测线性化是否完全，结果如图4所示，线性化后为单一条带且电泳速度相比未线性化较慢，回收PCR产物，-20℃储存备用。

2)酵母菌株的转化及阳性克隆的筛选

将上述步骤1)线性化的表达载体pPIC9K-Ao-Xyl通过电击转化法转化至毕赤酵母SMD1168感受态细胞内，加入预冷的1mol/L D-山梨醇溶液，30℃复苏2h，之后取200μL菌液涂布于MD固体培养基中初次筛选阳性克隆，30℃，倒置培养2～3d，观察单菌落生长情况。

之后从MD平板上挑取单菌落接种于含有G148抗性(终浓度为2.5mg/mL)YPD平板内进行二次筛选多拷贝，30℃培养至长出菌落。挑取菌落接种于无抗液体YPD培养基中培养16～18h，取TE/SDS处理后菌液进行破壁PCR鉴定验证阳性转化子。

破壁菌液PCR体系如下：

混匀后瞬时离心，反应参数为：94℃变性2min；94℃变性30sec，60℃梯度退火30sec，72℃延伸1min30 sec，28个循环后72℃保温2min。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定，结果如图5所示，五个转化子都显示为阳性克隆，根据测序结果确定转化子模板。

实施例6诱导重组米曲霉β-木糖苷酶Ao-Xyl的高效表达

1)种子液制备

将实施例5筛选得到的重组菌株接种于YPD培养基中进行活化，30℃，250rpm培养16～18h。之后将活化的菌种按1：100的比例接种于YPD种子培养基内，30℃，250rpm培养16～18h，得到150mL的种子液。

2)罐上发酵

5L发酵罐，加入3L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却后加入微量元素PTM13.2mL，用氨水调整pH为5.2，按1∶20比例接入种子液，发酵过程中温度控制在28℃，转速控制在600rpm左右。发酵具体分为以下三个阶段：

①甘油分批发酵阶段：发酵培养前16～24h(溶解氧(DO)>20％；通气量：4L)，直至培养基中甘油耗尽(表现为DO迅速回升)，补加甘油至菌体量达到160mg/mL。

②饥饿阶段：菌体达到所需密度后，停止补加甘油，溶氧(DO)迅速回升，此时不添加碳源，保证菌体饥饿状态30-60min，以避免影响菌体对甲醇的利用。

③甲醇流加阶段：饥饿一段时间后，将发酵温度调整为至26℃，pH维持在5.0左右，开始甲醇诱导阶段。诱导前12h，补加甲醇(含1.2％PTM)，补料速度为3mL/h添加；经12h诱导后，甲醇按6mL/h添加，持续96h。

发酵液上清用SDS-PAGE检测蛋白表达，结果如图6所示，随着发酵时间的延长，产酶量上升。

甘油补加阶段每隔8h取样测定生物量，甲醇诱导阶段每隔8h取样测定酶活力及生物量，结果如图7所示，生物量最高可达254mg/mL，罐上发酵诱导96h后，酶活力达到475.11U/mL，相比于摇瓶发酵，酶活力提高了51倍。

3)分离纯化

酶的凝胶柱层析

将上述获得的发酵上清液300mL用50KDa超滤膜，在4℃、5500rpm离心15min，收集截留的酶液，用0.22μm尼龙过滤头过滤浓缩液，放于4℃冰箱备用。

将浓缩的酶液上样至用0.02mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)平衡10CV的Sephacryl ^TM S-200 High Resolμtion柱(Ф16×100)上。

使用相同的柠檬酸-磷酸盐缓冲液以0.8mL/min的流速进行流洗。

以3min/tμbe的速度按峰收集流洗液并测定各管的酶活和蛋白浓度。

合并有酶活的收集管并用30KDa超滤膜进行浓缩，放于4℃冰箱备用。

酶的阴离子交换柱层析

将上述浓缩的酶液上样至0.02mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)平衡10CV的QSepharose柱(Ф16×20)上。

使用相同的缓冲液以2mL/min的流速洗涤10CV，并以5mL/tμbe的速度收集洗涤液。

使用相同的缓冲液(含0-1M NaCl)以2mL/min的流速线性洗脱10CV，并以5mL/tμbe的速度收集洗脱液。

测定各收集管的蛋白浓度和酶活，合并有酶活的收集管，用10KDa超滤膜进行浓缩，放于4℃冰箱备用。

将浓缩液上样于Sephacryl TM S-200 High Resolμtion柱(Ф16×60)上脱盐。

将上述纯化酶液经endo-F处理后进行SDS-PAGE验证分析纯化情况，结果见图8，纯化后为单一条带。

实施例7重组米曲霉β-木糖苷酶Ao-Xyl氨基酸保守序列分析及序列比对

保守序列(Conserved Sequence)：指DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段，它们在进化过程中基本保持不变。将β-木糖苷酶Ao-Xyl的氨基酸序列进行保守序列的分析，并与已知晶体结构的曲霉属β-木糖苷酶(6q7i.1)对比，结果如图9所示，俩者均具有BglX、PLN03080、PRK15098和GH3家族典型结构域特征，但是Ao-Xyl序列前端有着一段由87个氨基酸构成，名为“MF_alpha_N”的结构域序列，该结构域包含酿酒酵母交配因子α前体蛋白的N末端区域，该序列以Lys-Arg-Glu-Ala-Val-Ala-Asp-Ala开始，并与Lys-Arg-Glu-Ala-Asn-Ala-Asp-Ala的序列分隔，因此，α-因子可衍生自分别包含4和2个拷贝的信息素的165和120个氨基酸的2个不同的前体蛋白，有助于阐明信息素前体蛋白加工及其表达调控的机制。因此Ao-Xyl的氨基酸序列区别于其他β-木糖苷酶氨基酸序列。

将β-木糖苷酶Ao-Xyl的氨基酸序列进行Blast分析检索，经分析，Ao-Xyl的氨基酸序列与unnamed protein product[Aspergillus oryzae RIB40]、putative exo-1,4-beta-xylosidase xlnD[Aspergillus parasiticus]、putative exo-1,4-beta-xylosidase xlnD[Aspergillus pseudonomius]、beta-xylosidase XylA[Aspergillusnomiae NRRL 13137]和beta-xylosidase XylA[Aspergillus fumigatus var.RP-2014]分别有着99％、98％、89％、86％、73％的相似性，具体比对结果见图10。用碳水化合物活性酶家族(CAZy)数据库中糖苷水解酶4个家族中的23个鉴定的β-木糖苷酶建立进化树结果如图11所示。Ao-Xyl与来源于Prevotella bryantii B14的β-木糖苷酶在同一分支，这些β-木糖苷酶都属于GH3家族。综合结构域特点分析，可将Ao-Xyl归类于GH3家族。

实施例8重组β-木糖苷酶Ao-Xyl最适反应温度及热稳定性测定

重组酶活力的测定：向1.5mL离心管中加入150μL 2mM pNPX(溶于50mM柠檬酸缓冲液，pH＝5.5)，在一定温度下保温5min，再加入酶液50μL，反应10min后加入1mL 1mol/LNa₂CO₃终止反应，测定410nm吸光值。酶活定义：每分钟生成1μmol pNP所需的酶量为一个酶活单位(U/mL)。

温度对酶活性及稳定性的影响：重组β-木糖苷酶Ao-Xyl的最适反应温度测定是以2mM pNPX为底物，研究温度为30℃-70℃时重组酶的活力，将最高酶活力定义为100％；通过将重组β-木糖苷酶Ao-Xyl在55℃、60℃、65℃和70℃处理不同时间后检测其残余酶活来研究重组酶的热稳定性。将未经热处理的酶活力定义为100％。结果如图12a所示，重组β-木糖苷酶Ao-Xyl在30℃-70℃范围内均有活性，最适反应温度为50℃。当温度处于30-70℃范围内，酶活皆可达最大酶活的50％以上；图12b，重组β-木糖苷酶Ao-Xyl在55℃保温4h仍能保持79％以上的酶活力，在60℃条件下，同样处理4h，能保持75％以上的酶活力；图12c，重组β-木糖苷酶Ao-Xyl在65℃和70℃条件下分别处理30min、15min后酶活几乎全部丧失，在这温度下半衰期分别为4.45min和1.4min。

实施例9重组β-木糖苷酶Ao-Xyl最适反应pH及酸碱稳定性测定

pH值对酶活性及稳定性的影响：测定最适pH时，用不同pH的缓冲液配制2mM pNPX，在最适反应温度下测定酶活，以最高酶活100％。缓冲液分别为50mM的柠檬酸-柠檬酸三钠(pH 3–6)、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH 6–8)、Tris-HCl(pH 8–9)和甘氨酸-NaOH(pH 9–10)。通过测定酶液在不pH条件下4℃放置24h后的残余酶活来研究pH稳定性，以未处理的酶活力为100％。结果如图13a所示，重组β-木糖苷酶Ao-Xyl在柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲体系中酶活力最高，其最适反应pH为5.5，在pH 5.0-7.0范围内具有最高酶活70％以上的酶活力；图13b，重组β-木糖苷酶Ao-Xyl在酸性至中性(pH 3.0-7.0)范围内相对稳定，4℃处理24h后仍能保持91％以上的酶活力，Tris-HCl缓冲液中pH高于8.5条件和甘氨酸-NaOH缓冲液中pH高于10条件下，活力完全丧失。以上结果表明，此重组β-木糖苷酶具有较为宽广的pH适应范围。

实施例10重组β-木糖苷酶Ao-Xyl其他酶学性质测定

金属离子对重组β-木糖苷酶Ao-Xyl酶活的影响：通过测定酶液在4℃被不同金属离子(Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Al³⁺和Fe³⁺，1mM或10mM)处理1h后的残余酶活，来研究金属离子对酶活力的影响，以未被金属离子处理的酶活力为100％。结果如图14a所示，除了低浓度的Fe³⁺和Mn²⁺以及高浓度的Na⁺稍微抑制酶活性，基本所有离子的低浓度和高浓度都可以促进酶活力。但10mM Fe³⁺能基本抑制酶活，这种现象是由Fe³⁺的重金属作用造成的，重金属离子可使蛋白质变性，且这种作用与离子浓度成正相关。

抑制剂和表面活性剂对重组β-木糖苷酶Ao-Xyl活力的影响：在酶液中分别添加终浓度为1mM或10mM抑制剂(EDTA、CTAB、Urea)和1％(w/w或w/v)或10％(w/w或w/v)表面活性剂(SDS、Tween-20、Tween-80、Triton X-100)，4℃处理1h后，测定酶的剩余活力，以未添加抑制剂或去垢剂的酶活力为100％，研究抑制剂和去垢剂对酶活性的影响。结果如图14b所示，Ao-Xyl对表面活性剂中的Triton X-100、Tween-20、SDS和Tween-80均具有很好的抗性，以及对于抑制剂中的EDTA、CTAB、Urea同样也具有良好的抗性。

有机溶剂对重组β-木糖苷酶Ao-Xyl酶活的影响：通过测定酶液在4℃被不同有机溶剂(二甲基亚砜、正丁醇、正丙醇、异戊醇、苯、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和四氢呋喃，20％、40％或60％)处理1h的残余酶活，来研究有机溶剂对酶活力的影响，以未被有机溶剂处理的酶活力为100％。结果如图14c所示，正丁醇、异戊醇、苯、乙酸乙酯的低浓度20％、中浓度40％、高浓度60％对酶活力无明显促进或者抑制作用；二甲基亚砜和甲醇情况类似，浓度20％稍微促进酶活，40％稍微抑制酶活力，而60％的几乎抑制酶活力；而浓度为60％的正丙醇和四氢呋喃可以完全抑制酶活力。

实施例11重组β-木糖苷酶Ao-Xyl与其他来源β-木糖苷酶比较

据文献报道，不同来源的β-木糖苷酶的酶学性质存在差异。β-木糖苷酶的等电点大多呈弱酸性，pH范围在4.0-7.0之间，少数呈弱碱性，pH范围在7.0-8.0之间，因此β-木糖苷酶的最适pH的范围较广在4.0-8.0之间，但对于pH稳定性，大多数β-木糖苷酶仅在很窄的pH范围内保持活性的稳定；β-木糖苷酶的最适反应温度的范围较宽，大多数介于30℃-70℃之间。最近有研究报道在一些嗜热菌中分离得到能耐高温及在高温条件下稳定的β-木糖苷酶，如Suryani从Clostridium stercorarium中分离得到的β-木糖苷酶的最适反应温度为80℃，在50-70℃的范围内保持稳定，而非嗜热菌来源的β-木糖苷酶仅能在60℃及以下的环境下保持酶活性的稳定。有关β-木糖苷酶酶学性质数据列于下表，对比下表中的微生物来源的β-木糖苷酶，本发明的β-木糖苷酶Ao-Xyl在广泛酸性至中性条件下(3-7)残余酶活达到80％以上，甚至在pH为3.5-6.5条件下有着酶活性的促进作用，因此Ao-Xyl具有良好的酸稳定性，并且Ao-Xyl在60℃下处理4h后残余酶活80.6％，热稳定也较为优秀，因此利于其贮存和工业处理，具有很高的应用潜力。

实施例12重组β-木糖苷酶Ao-Xyl与木聚糖酶协同水解木聚糖

为了研究重组β-木糖苷酶在协助木聚糖酶水解木聚糖的能力。在600μL的柠檬酸缓冲液反应体系中，含有2.0mg/mL的山毛榉木聚糖，加入1U的木聚糖酶或者1U的木聚糖酶与1U的Ao-Xyl组合。将反应体系置于50℃水浴锅中，使其反应30min。反应完毕煮沸处理，通过DNS的方法分析水解产物中还原糖的含量。结果如图15所示，重组β-木糖苷酶Ao-Xyl可以协助木聚糖酶水解木聚糖，结果发现β-木糖苷酶的添加使得还原糖的产量增加到了木聚糖酶单独作用结果的122％。

实施例13重组β-木糖苷酶Ao-Xyl与木聚糖酶和纤维素酶协同水解甘蔗渣

为了研究重组β-木糖苷酶在实际应用中的实际情况，选取甘蔗渣作为研究的木质纤维素类材料。在前处理中，甘蔗渣经过风干，碾磨并通过0.3mm的筛网。反应体系均含有0.2g的甘蔗渣，反应在20mL的0.05M pH 5.0的柠檬酸缓冲液进行。根据酶的不同，分为以下五组，分别含有：

(1)10U木聚糖酶

(2)10U纤维素酶

(3)10Uβ-木糖苷酶+10U木聚糖酶

(4)10Uβ-木糖苷酶+10U木聚糖酶+10U纤维素酶

(5)10Uβ-木糖苷酶+10U木聚糖酶+10U纤维素酶+10Uβ-葡萄糖苷酶

样品分别在反应0，3，6，9，12，18，24，36，48小时的时间点取样，并用DNS法测量样品中还原糖的含量。并以时间为自变量，单位质量甘蔗渣还原糖释放量为因变量做图。

结果如图16所示，在48h的水解之后，木聚糖酶单独水解甘蔗渣释放还原糖的量达到0.526mmol/g甘蔗渣。在添加了Ao-Xyl之后，还原糖的释放量提高到了0.735mmol/g甘蔗渣，增幅达到了39.7％。更进一步地，当纤维素酶与木聚糖酶和Ao-Xyl一起协同水解的时候，经过60h的反应，还原糖的浓度达到0.799mmol/g甘蔗渣，最后当有纤维二糖酶(β-葡萄糖苷酶)参与水解反应时，还原糖终浓度达到0.847mmol/g甘蔗渣。甘蔗渣水解实验表明了重组β-木糖苷酶Ao-Xyl对于木质纤维素的水解有着积极的效果。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一种β-木糖苷酶及其应用

<130> 无

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 871

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Gln Ala Asn

85 90 95

Gln Ser Tyr Val Asp Tyr Asn Ile Glu Ala Asn Pro Asp Leu Phe Ser

100 105 110

Glu Cys Leu Glu Thr Gly Gly Thr Ser Phe Pro Asp Cys Glu Ser Gly

115 120 125

Pro Leu Ser Lys Thr Leu Val Cys Asp Thr Ser Ala Lys Pro His Asp

130 135 140

Arg Ala Ala Ala Leu Val Ser Leu Leu Thr Phe Glu Glu Leu Val Asn

145 150 155 160

Asn Thr Ala Asn Thr Gly His Gly Ala Pro Arg Ile Gly Leu Pro Ala

165 170 175

Tyr Gln Val Trp Asn Glu Ala Leu His Gly Val Ala His Ala Asp Phe

180 185 190

Ser Asp Ala Gly Asp Phe Ser Trp Ser Thr Ser Phe Pro Gln Pro Ile

195 200 205

Ser Thr Met Ala Ala Leu Asn Arg Thr Leu Ile His Gln Ile Ala Thr

210 215 220

Ile Ile Ser Thr Gln Gly Arg Ala Phe Met Asn Ala Gly Arg Tyr Gly

225 230 235 240

Leu Asp Val Tyr Ser Pro Asn Ile Asn Thr Phe Arg His Pro Val Trp

245 250 255

Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly Glu Asp Ala Tyr Cys Leu Ala Ser

260 265 270

Thr Tyr Ala Tyr Glu Tyr Ile Thr Gly Ile Gln Gly Gly Val Asp Ala

275 280 285

Asn Pro Leu Lys Leu Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr Ala Gly Tyr Asp

290 295 300

Ile Glu Asn Trp Asp Asn His Ser Arg Leu Gly Asn Asp Met Gln Ile

305 310 315 320

Thr Gln Gln Asp Leu Ala Glu Tyr Tyr Thr Pro Gln Phe Leu Val Ala

325 330 335

Ser Arg Asp Ala Lys Val His Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Ala Val

340 345 350

Asn Gly Val Pro Ser Cys Ser Asn Ser Phe Phe Leu Gln Thr Leu Leu

355 360 365

Arg Asp Thr Phe Asp Phe Val Glu Asp Gly Tyr Val Ser Gly Asp Cys

370 375 380

Gly Ala Val Tyr Asn Val Phe Asn Pro His Gly Tyr Ala Thr Asn Glu

385 390 395 400

Ser Ser Ala Ala Ala Asp Ser Ile Arg Ala Gly Thr Asp Ile Asp Cys

405 410 415

Gly Val Ser Tyr Pro Arg His Phe Gln Glu Ser Phe His Asp Gln Glu

420 425 430

Val Ser Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gly Val Thr Arg Leu Tyr Ala Ser

435 440 445

Leu Ile Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Gly Lys Thr Ser Pro Tyr Arg Asn

450 455 460

Ile Thr Trp Ser Asp Val Val Ser Thr Asn Ala Gln Asn Leu Ser Tyr

465 470 475 480

Glu Ala Ala Ala Gln Ser Ile Val Leu Leu Lys Asn Asp Gly Ile Leu

485 490 495

Pro Leu Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Lys Thr Ile Ala Leu Ile Gly

500 505 510

Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Met Leu Gly Asn Tyr Tyr Gly Pro

515 520 525

Ala Pro Tyr Leu Ile Ser Pro Leu Gln Ala Phe Gln Asp Ser Glu Tyr

530 535 540

Lys Ile Thr Tyr Thr Ile Gly Thr Asn Thr Thr Thr Asp Pro Asp Ser

545 550 555 560

Thr Ser Gln Ser Thr Ala Leu Thr Thr Ala Lys Glu Ala Asp Leu Ile

565 570 575

Ile Phe Ala Gly Gly Ile Asp Asn Thr Leu Glu Thr Glu Ala Gln Asp

580 585 590

Arg Ser Asn Ile Thr Trp Pro Ser Asn Gln Leu Ser Leu Ile Thr Lys

595 600 605

Leu Ala Asp Leu Gly Lys Pro Leu Ile Val Leu Gln Met Gly Gly Gly

610 615 620

Gln Val Asp Ser Ser Ala Leu Lys Asn Asn Lys Asn Val Asn Ala Leu

625 630 635 640

Ile Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln Ser Gly Gly Gln Ala Leu Ala Asp

645 650 655

Ile Ile Thr Gly Lys Arg Ala Pro Ala Ala Arg Leu Val Thr Thr Gln

660 665 670

Tyr Pro Ala Glu Tyr Ala Glu Val Phe Pro Ala Ile Asp Met Asn Leu

675 680 685

Arg Pro Asn Gly Ser Asn Pro Gly Gln Thr Tyr Met Trp Tyr Thr Gly

690 695 700

Thr Pro Val Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Phe Tyr Thr Asn Phe Thr

705 710 715 720

Ala Ser Ala Ser Ala Gly Ser Gly Thr Lys Asn Arg Thr Ser Phe Asn

725 730 735

Ile Asp Glu Val Leu Gly Arg Pro His Pro Gly Tyr Lys Leu Val Glu

740 745 750

Gln Met Pro Leu Leu Asn Phe Thr Val Asp Val Lys Asn Thr Gly Asp

755 760 765

Arg Val Ser Asp Tyr Thr Ala Met Ala Phe Val Asn Thr Thr Ala Gly

770 775 780

Pro Ala Pro His Pro Asn Lys Trp Leu Val Gly Phe Asp Arg Leu Ser

785 790 795 800

Ala Val Glu Pro Gly Ser Ala Lys Thr Met Val Ile Pro Val Thr Val

805 810 815

Asp Ser Leu Ala Arg Thr Asp Glu Glu Gly Asn Arg Val Leu Tyr Pro

820 825 830

Gly Arg Tyr Glu Val Ala Leu Asn Asn Glu Arg Glu Val Val Leu Gly

835 840 845

Phe Thr Leu Thr Gly Glu Lys Ala Val Leu Phe Lys Trp Pro Lys Glu

850 855 860

Glu Gln Leu Ile Ala Pro Gln

865 870

<210> 2

<211> 2616

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttac gtagaattcc aagcaaacca aagctacgtc 300

gactacaaca tcgaagcgaa cccagacctc ttctctgaat gtctggagac cggtggtacc 360

tcattcccag actgcgaaag cggtcccttg agcaagactc tggtctgcga tacttcggca 420

aaaccccatg atcgagctgc tgccctcgtc tccctcctga ccttcgagga gctggtgaac 480

aacaccgcca acaccggcca tggtgcccct agaatcggcc tgcccgcgta tcaggtgtgg 540

aatgaagctc tccacggtgt cgcccatgcc gatttcagcg atgccggtga cttcagctgg 600

tccacgtcct tcccgcagcc gatctcgaca atggctgccc tcaaccgcac cctaattcac 660

cagatcgcca ccatcatctc cacgcaaggc cgtgccttca tgaacgccgg ccgctacgga 720

ctcgacgtct actctcccaa catcaatacc ttccgccacc cagtttgggg ccgcggccag 780

gaaaccccag gcgaagacgc ctactgcctc gcctccacct acgcatacga atacatcacc 840

ggcatccagg gcggcgtcga cgccaaccct ctcaaactca tcgcaacagc gaagcactac 900

gccggctacg atatcgagaa ctgggacaac cactcccggc tcggtaacga catgcaaatc 960

acccaacaag acctggccga atactacact ccccaattcc tcgtcgcctc gcgagacgcc 1020

aaagtccaca gcgtgatgtg ctcctacaac gccgtcaacg gcgtccccag ctgctccaac 1080

tccttcttcc tgcaaaccct cctccgcgac accttcgact tcgtcgaaga cggctacgtc 1140

tccggcgact gcggcgcagt ctacaacgtc ttcaacccgc acggctacgc caccaacgaa 1200

tcatccgccg ccgcagactc catccgcgca ggaaccgaca tcgactgcgg cgtctcctac 1260

ccacgccact tccaagaatc cttccacgac caggaagtct cccgacaaga cctcgaacgc 1320

ggcgtcaccc gtctctacgc cagcctcatc cgcgcaggct acttcgacgg caaaaccagt 1380

ccataccgca acataacctg gtccgacgtg gtgtccacca acgcccaaaa cctctcctac 1440

gaagccgccg cccaaagcat cgtcctgctc aaaaacgacg gcatcctccc ccttacctcc 1500

accagttcct ccacaaaaac catcgcccta atcggcccct gggcaaacgc aaccacccaa 1560

atgctaggca actactacgg cccagccccc tacctaatca gcccgctgca agccttccaa 1620

gactcagaat acaaaatcac ctacaccatc ggcacaaaca caaccaccga cccggactcc 1680

acctcccaat ccaccgccct caccaccgcc aaagaagcag acctaatcat cttcgccggc 1740

ggcatcgaca acaccctcga aaccgaagcc caagaccgca gcaacataac ctggccctcc 1800

aaccaactct ccctaataac caagctcgcg gacctaggca aacccctcat cgtcctccaa 1860

atgggcggcg ggcaggtcga ctcctccgcc ctgaagaaca acaagaacgt caacgccttg 1920

atttggggcg gatacccggg tcagtcgggt ggacaggccc tggccgatat catcacgggg 1980

aaacgggccc ccgcggctcg gctagttacg acgcagtatc cggctgagta cgccgaggtg 2040

ttcccggcta ttgatatgaa tctgagaccg aatgggtcga atccaggaca aacttatatg 2100

tggtataccg ggacgccggt ttatgagttt ggacatgggc tgttttatac taatttcact 2160

gcttctgctt ctgcgggtag tgggactaag aatcggacgt cgtttaatat cgatgaggtt 2220

ctgggacgcc cgcatcctgg gtataagctg gtggagcaga tgccgttgtt gaattttacg 2280

gtcgacgtga agaatactgg agacagggtg tcggattata ctgccatggc gtttgtgaat 2340

acgactgctg ggccggcgcc gcatcctaat aagtggctgg ttgggtttga tcggttgagt 2400

gctgtcgagc ctgggtcggc gaagactatg gttattccgg tgacggtgga tagtctggct 2460

cggactgatg aggaggggaa tcgggtgttg tatcctggac ggtatgaagt ggcgttgaat 2520

aatgagaggg aggtggtttt gggatttacg ctcacggggg agaaggctgt gcttttcaag 2580

tggcctaagg aggagcagtt gattgcgccg caatag 2616

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcctggtg cagcgt 16

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctattgcggc gcaatcaact 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggaattcc aagcaaacca aagctacgt 29

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atttgcggcc gcctattgcg gcgcaatcaa ct 32

Claims (8)

1.一种编码β-木糖苷酶的基因，其特征在于，所述β-木糖苷酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的编码β-木糖苷酶的基因。

3.一种重组菌株，其特征在于，通过如权利要求2所述的表达载体转化宿主细胞获得。

4.一种制备β-木糖苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以米曲霉基因组DNA为模板，通过设计特异性引物，利用PCR的方法扩增β-木糖苷酶基因序列；

2)将所述β-木糖苷酶基因克隆到质粒中，得到如权利要求2所述的表达载体；

3)将所述表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

4)将所述重组菌株在发酵罐上诱导表达，获得高浓度β-木糖苷酶。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，将所述重组菌株接种于罐上发酵培养基中进行甲醇诱导表达β-木糖苷酶。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲醇诱导重组菌株表达包括：甘油分批发酵阶段、饥饿阶段及甲醇流加阶段。

7.权利要求4～6中任一项所述的方法制得的β-木糖苷酶。

8.权利要求7所述的β-木糖苷酶在水解木聚糖中的应用。

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