CN100335640C - 一种嗜热碱性β－葡萄糖苷酶及其编码基因 - Google Patents
一种嗜热碱性β－葡萄糖苷酶及其编码基因 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因。该酶具有在高温、碱性条件下保持较高酶活性的特点，其最适反应温度约为70℃，最适反应pH值约为8.0，该酶能催化水解β-葡萄糖苷键生成葡萄糖，在食品、医药、纺织、能源等方面具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶及其编码基因，特别涉及一种嗜热碱性β-葡萄糖苷酶及其编码基因。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，是一种能催化水解多种β-葡萄糖苷键的酶，是纤维素酶系中一类重要的酶，在食品、医药、纺织、能源等方面具有重要的应用价值。纤维素降解酶系大致由三类水解酶组成，分别是纤维素酶(EC 3.2.1.4)、外切纤维素酶(EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，在纤维素降解过程中，从纤维素分解成葡萄糖需以上三种酶协同作用。β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)可将纤维二糖水解为葡萄糖(Machida.M等，Appl EnvironMicrobiol，4：31-47，1988)，是纤维素水解糖化过程中的限速步骤。另外，通常纤维二糖抑制纤维素酶对纤维素的降解，但β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)可以降解纤维二糖，解除对纤维素酶的抑制作用，因此在纤维素酶系中的作用是很重要的。
β-葡萄糖苷酶已经从多种微生物中分离出，其中包含有部分嗜热菌，如酵母菌(Saccharomycopsis)(Machida.M等，Appl Environ Microbiol，4：31-47，1988)，曲霉菌(Aspergillus)(Kwon等，FEMS Microbiol Lett，97：149-154，1992)，腐殖菌(Humicola)(Peralta等，FEMS Microbiol Lett，146：291-295，1997)，镰刀菌(Fusarium)(Christakopoulos等，Eur.J.Biochem，224：379-385，1994)，小包脚菇(Volvariella)(Cai等，Appl Environ Microbiol，65：553-559，1999)，念珠菌(Candida)(Christopher等，Appl Environ Microbiol，61：518-525，1995)，里氏木霉(Trichoderma reesei)(Zhiyou Wen等，(ApplBiochem Biotechnology)121：93-104，2005)，硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)(Aguilar等，J Mol Biol，271：789-802，1997)，Thermotogamaritima(Gabelsberger等，FEMS Microbiol Lett，109：131-138，1993)，聚集耐热球菌(Thermosphaera aggregans)(Chi等，FEMS Letters，445：375-383，1999)，热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(Ati等，J Gen Microbiol，128：569-577，1982)等。
关于β-葡萄糖苷酶已有的专利和文献报道，例如，Gonzale报道了模式芽孢菌(Bacillus polmyxa)的β-葡萄糖苷酶基因(Biochem Biophys ResCommun，194：1359-1364，1993)；Wright等报道了小双孢菌属(Miscrobispora)的β-葡萄糖苷酶基因(Appl Environ Microbiol，58：3455-3465，1992)；Paavilainen等报道了环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的β-葡萄糖苷酶基因(Appl Environ Microbiol，59：927-932，1993)；Reves等报道了Thermoanaerobacter brockii的β-葡萄糖苷酶基因(Appl EnvironMicrobiol，63：3902-3910，1997)；Lieb等报道了Thermotoga mariti的β-葡萄糖苷酶基因(Mol Gen Genet.，242：111-115，1994)等。
微生物产生的β-葡萄糖苷酶种类多，不同来源的β-葡萄糖苷酶具有多种不同的性质，从而导致各具特色的应用范围。由于工业上应用的不同，因而需要不断开发出具有新特征的β-葡萄糖苷酶以更好的适应生产的需要。具有高pH和高热环境下仍保持高活性的β-葡萄糖苷酶在工业上可以减少污染、增加产量，以及可以在所需要的特殊条件下进行反应，因而成为研究热点。但目前来看，能够同时在高pH(pH＞8.0)和高温(T＞70℃条件下仍具有高活性的β-葡萄糖苷酶还没有见到相关的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基因，其能编码一种在高温和高pH条件下仍保持高活性的β-葡萄糖苷酶。
本发明的另一目的是提供一种嗜热碱性β-葡萄糖苷酶，其可在高温和高pH条件下降解纤维二糖。
本发明的另一目的是提供一种能表达嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的重组质粒。
本发明的再一目的是提供一种能产生嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的重组菌。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提出一种编码嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的基因，其具有选自于a)、b)或c)的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；
c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，上述编码嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明提出一种嗜热碱性β-葡萄糖苷酶，其具有选自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列：
d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
f)上述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的活性。
在本发明的一个实施例中，上述嗜热碱性β-葡萄糖苷酶具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
本发明提出一种表达嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的重组质粒，其至少包括上述编码嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的基因。
在本发明的一个实施例中，上述重组质粒的载体为pET-28a(+)。
本发明提出一种产生嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的重组菌，该菌内导入了上述编码嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的基因。
在本发明的一个实施例中，上述重组菌为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21菌株。
应当指出的是，上述提到的术语“严格条件”在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格条件可以是，相互之间的同源性不小于70％的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90％的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件：将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS)中，50℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(2×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(0.5×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜30min。
所属技术领域的技术人员应该知道，本发明的编码嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的DNA序列，还包括编码对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
另外，对本发明的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质，也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有嗜热碱性β-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。
和已知的β-葡萄糖苷酶相比，本发明提出的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶是一种新型的β-葡萄糖苷酶，通过对本发明提出的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶基因推导的氨基酸序列比较分析，本发明的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶与其它已报道的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列相比，绝大多数相似性小于55％。相似性高于55％的β-葡萄糖苷酶来源于嗜热芽孢杆菌(Bacillus kaustophilus)HTA426(Takami，H等，Nucleic Acids Res.，32(21)，6292-6303，2004，未作功能鉴定)；耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125(Takami，H等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，63，943-945，1999，未作功能鉴定)；嗜盐深海芽孢菌(Oceanobacillus iheyensis)HTE831(Takami，H.等(Nucleic AcidsRes.)30(18)，3927-3935(2002)，未作功能鉴定)；克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)KSM-K16(Kobayashi，T等，(Appl.Microbiol.Biotechnol.)43(3)，473-481(1995)，蛋白结构研究)；产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterethanolicus)ATCC 33223(Copeland，A.等，未公开发表)；肺炎链球(Streptococcus pneumoniae)TIGR4(Rothberg，J.M.and Margulies，M等，未公开发表)；无害利斯特菌(Listeria innocua)(Glaser，P.，Frangeul，L.等，Science 294(5543)，849-852(2001)，未作功能鉴定)等。
由此可见，本发明的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶与其它已报道的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列相比后，相似性大于55％的已发现菌株中，基本上都是进行序列比对或蛋白结构的研究，没有发现对相应菌株的β-葡萄糖苷酶基因的功能进行鉴定的相关文献。通过酶的氨基酸序列相似性，目前已知的β-葡萄糖苷酶分别属于糖苷水解酶第1和第3家族，通过对本发明的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶基因推导的氨基酸序列分析，本发明的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶第3家族的一员。
此外，本发明的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的性能不同于已知的β-葡萄糖苷酶，其反应温度经活性测定，证明该酶具有在高温和高pH条件下保持高活性的特征，其反应温度为40℃-90℃，其最适反应温度约为70℃；pH值为6.0-9.0，最适反应pH值约为8.0，在pH9.0时，其活性仍能保持在最适pH时的75％，具有在高温、碱性条件下保持较高酶活的特点。该酶的分子量为52000道尔顿，pI为6.41。纯化后该酶的最佳比活力为85.2U/mg，可水解纤维二糖生成葡萄糖。该酶是一种能催化水解β-葡萄糖苷键生成葡萄糖的酶，是纤维素酶系中一类重要的酶，在食品、医药、能源等方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例中的β-葡萄糖苷键基因重组质粒pETGLUB的构建模式图。
图2表示本发明重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶在不同温度下的比活力。
图3表示本发明重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶在不同pH值下的比活力。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例一
1.嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)总DNA的提取
研究证明，由嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2基因组能够分离出编码β-葡萄糖苷酶的基因，该酶特别适于在高温条件下降解纤维二糖，其能够在高PH和高温环境下保持酶的高活性，不同于已知的β-葡萄糖苷酶的特征，是一种新型的β-葡萄糖苷酶。因此，在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2，取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于250微升50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入10微升0.4M EDTA(pH8.0)，混匀后37℃保温20min，之后加入30微升20mg/ml溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5微升20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20微升10％SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，氯仿∶异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，沉淀溶于100微升TE缓冲液(pH8.0，10mMTris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase2微升，65℃保温30min，分别用酚∶氯仿∶异戊醇、氯仿∶异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50微升TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.95，A260＝0.73。
2.本发明嗜热碱性β-葡萄糖苷酶基因的克隆和筛选
取前面所述的总DNA溶液0.5微升(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行20个循环PCR。
设定的PCR循环参数如下：
95℃，5min；95℃，30s；56℃，45s；72℃，2min；72℃，5min；4℃，2hr
引物序列如下：
上游引物：5’-ACGACCATGGTGGAACAACAATCGAAGCAGT-3’；
下游引物：5’-TGCACTCGAGTAAATCCGTTGTTTTCCGCGAC-3’，
上述PCR产物用NcoI和XhoI双酶切，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收1.4kb酶切产物片断。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50μg/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37℃培养12小时，挑取单克隆转接到20ml LB培养基中进行培养(50μg/ml Kan)，37℃培养12小时后，提取质粒鉴定，插入有SEQ ID NO：1的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pETGLUB(见图1)，将重组质粒pETGLUB转入表达宿主大肠杆菌BL21(该菌株可向天津开发区厚普生物技术开发有限公司订购，货号为69387-3)中，得到含有该重组质粒的重组菌株为BL21GLUB，此重组质粒pETGLUB可高频转化大肠杆菌BL21表达嗜热碱性β-葡萄糖苷酶活性和抗卡那霉素性能。
将重组质粒中的DNA插入片段用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，证明重组质粒pETGLUB中的插入DNA片段来自嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2的染色体。
采用Sanger法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入片段含有一个长1413bp的开放阅读框架，编码一个由471个氨基酸组成的蛋白质，属于β-葡萄糖苷酶家族。
实施例二 本发明重组β-葡萄糖苷酶的纯化和特性
将上述重组菌E.Coli BL21GLUB单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入200ml含50μg/mlKan的LB培养基(共10个摇瓶)，37℃，220rpm/min培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，37℃，150rpm/min诱导4小时。离心收集菌体，悬于50mMTris-Cl(pH7.5)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组β-葡萄糖苷酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组β-葡萄糖苷酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为51600道尔顿，与理论上推算的分子量(52000道尔顿)相似；该酶具有高温和高pH条件下保持高活性的特征，其反应温度为40℃-90℃，其最适反应温度约为70℃；pH值为6.0-9.0，最适反应pH值约为8.0，在pH9.0时，其活性仍能保持在最适pH时的75％，具有高温、碱性条件下保持较高酶活的特点。纯化后酶的最佳比活力为85.2U/mg，可水解纤维二糖生成葡萄糖。
实施例三 本发明重组β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖
向2％的纤维二糖溶液(用pH7.5，0.2M的磷酸钠缓冲液配制)中，加入上述实施例二制得的纯化后酶液，加入量为2％的纤维二糖溶液体积的十分之一，升温至70℃保温六小时。高压液相色谱法测得上述重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生葡萄糖。
实施例四
1.测定本发明重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶在不同温度下的比活力
对上述实施例二中制得的重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶进行最适反应温度的测定，具体方法为：取一定稀释的实施例2制得的纯化后酶液0.1ml，分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃中放置10min后，加入0.1ml用0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸(CP)缓冲液(pH7.0)配制的10mmol/L β-对硝基酚葡萄糖苷(β-pNPG)底物反应10min，加入0.1ml 0.6mol/L Na2CO3试剂，用水定容至2ml后在405nm处测光吸收，以每分钟生成1μmolp-nitrophenol所需酶量定义为1个酶活力单位，测定结果参见图2。从该图中可以看出，该重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的最适反应温度约为70℃。
2.测定本发明重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶在不同温度下的比活力
对上述实施例二中制得的重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶进行最适pH值的测定，具体方法为：取一定稀释的上述实施例二制得的纯化后酶液0.1ml，分别于pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0的缓冲液(配方见表1)中室温放置过夜后，70℃预热20min，加入0.1ml 70℃预热好且用相应pH值的缓冲液配制的10mmol/L β-pNPG底物反应10min，加入0.1ml 0.6mol/L Na2CO3试剂，用水定容至2ml后在405nm处测光吸收，以每分钟生成1μmolp-nitrophenol所需酶量定义为1个酶活力单位，测定结果参见图3，从该图中可以看出，该重组嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的最适pH值约为8.0。
表1.嗜热碱性β-葡萄糖苷酶酶活测定中所用的缓冲液
| pH范围 | 缓冲液1 | 缓冲液2 |
| pH2-8 | 0.1M Na2HPO4(pH9.0) | 0.1M柠檬酸(pH2.0) |
| pH9-11 | 0.1M Na2CO3(pH11.8) | 0.1M NaHCO3(pH8.4) |
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110>南开大学
<120>一种嗜热碱性β-葡萄糖苷酶及其编码基因
<130>5P99014-CN-A
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1413
<212>DNA
<213>嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2
<400>1
atggaacaac aatcgaagca gtcaatcacg taccgcttcc ctgccggttt ttggtgggga 60
agcgcgacgt ccgcaacgca aatggaaggg gcagccaacg agggggggaa agggaaaaat 120
atttgggatc attggtatga aaaggagcca catcgctttt ttaacggcgt cggcccgtca 180
actacatcag atttttatca ccgctacaaa gaggatattg ctttgatgaa ggagatcggg 240
cataattcat tccggttttc gatttcatgg tcacgcttga ttccaaaggg aatcggtgag 300
gtcaatccgg aagccgtgcg gttttacaat gcagtcatcg atgaactatt ggcgagtggg 360
atcgagccat ttgtgaattt gtatcatttt gatatgccgt tagcaatgca aaatatcgga 420
ggttgggaaa accgcgaagt cgtggatgca tacgcccgct acgccagcat ttgttttgag 480
ttgttcgggg atcgggtaaa aaaatggttt acccacaatg aaccgatcgt tccggtggaa 540
ggagggtatt tatacgattt tcattaccca aacatcgtag acttccgccg tgctgtacaa 600
gtggcttacc atacggtgat tgcccatgcc aaagcggttg ccgccttccg caaggcggcc 660
atcccgggag gacagattgg catcattttg aatttgacgc cgtcttaccc gcgcagccag 720
cacccagctg atgtaaaagc ggcacatatt gcggatttgt tgtttaaccg gagtttctta 780
gatccggcgg tgaaaggaga atacccgcaa gatttgattg aactgttgga tgaacatggc 840
tttttgcctg taacggaagc cggtgatcgc gagctgatca aagaaaacac gatcgatttg 900
ctcggcatca actactatca accgcgccgc gttaaggcaa aagagcatct ccccaacccg 960
gatgccccgt ttttgccgga gcgatttttc gattattatg ctatgcctgg acggaaaatg 1020
aatccgtatc gcggttggga aatttatgaa aaaggcattt atgatatttt aatcaatatc 1080
aaagaaaact atggaaacat tgagtgcttt atttctgaaa atggcatggg cgtcgaaggg 1140
gaagatcggt ttcgtaatga aaacggcatg attgatgacg actaccggat tgctttcatc 1200
cgcgaacatt taaaatgggt gcatcgcgcg gtggaagaag gggtcaatgt gaaaggctat 1260
cacctttgga cgtttatgga caactggtcg tggaccaatg cctataaaaa tcggtacggg 1320
ctcgtcgcgg ttgatttgga caacggcttg aagcgaacga tcaaaaaaag tggctattgg 1380
tttaaaacag tcgcggaaaa caacggattt tga 1413
<210>2
<211>470
<212>PRT
<213>嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2
<400>2
Met Glu Gln Gln Ser Lys Gln Ser Ile Thr Tyr Arg Phe Pro Ala Gly
1 5 10 15
Phe Trp Trp Gly Ser Ala Thr Ser Ala Thr Gln Met Glu Gly Ala Ala
20 25 30
Asn Glu Gly Gly Lys Gly Lys Asn Ile Trp Asp His Trp Tyr Glu Lys
35 40 45
Glu Pro His Arg Phe Phe Asn Gly Val Gly Pro Ser Thr Thr Ser Asp
50 55 60
Phe Tyr His Arg Tyr Lys Glu Asp Ile Ala Leu Met Lys Glu Ile Gly
65 70 75 80
His Asn Ser Phe Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ser Arg Leu Ile Pro Lys
85 90 95
Gly Ile Gly Glu Val Asn Pro Glu Ala Val Arg Phe Tyr Asn Ala Val
100 105 110
Ile Asp Glu Leu Leu Ala Ser Gly Ile Glu Pro Phe Val Asn Leu Tyr
115 120 125
His Phe Asp Met Pro Leu Ala Met Gln Asn Ile Gly Gly Trp Glu Asn
130 135 140
Arg Glu Val Val Asp Ala Tyr Ala Arg Tyr Ala Ser Ile Cys Phe Glu
145 150 155 160
Leu Phe Gly Asp Arg Val Lys Lys Trp Phe Thr His Asn Glu Pro Ile
165 170 175
Val Pro Val Glu Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Phe His Tyr Pro Asn Ile
180 185 190
Val Asp Phe Arg Arg Ala Val Gln Val Ala Tyr His Thr Val Ile Ala
195 200 205
His Ala Lys Ala Val Ala Ala Phe Arg Lys Ala Ala Ile Pro Gly Gly
210 215 220
Gln Ile Gly Ile Ile Leu Asn Leu Thr Pro Ser Tyr Pro Arg Ser Gln
225 230 235 240
His Pro Ala Asp Val Lys Ala Ala His Ile Ala Asp Leu Leu Phe Asn
245 250 255
Arg Ser Phe Leu Asp Pro Ala Val Lys Gly Glu Tyr Pro Gln Asp Leu
260 265 270
Ile Glu Leu Leu Asp Glu His Gly Phe Leu Pro Val Thr Glu Ala Gly
275 280 285
Asp Arg Glu Leu Ile Lys Glu Asn Thr Ile Asp Leu Leu Gly Ile Asn
290 295 300
Tyr Tyr Gln Pro Arg Arg Val Lys Ala Lys Glu His Leu Pro Asn Pro
305 310 315 320
Asp Ala Pro Phe Leu Pro Glu Arg Phe Phe Asp Tyr Tyr Ala Met Pro
325 330 335
Gly Arg Lys Met Asn Pro Tyr Arg Gly Trp Glu Ile Tyr Glu Lys Gly
340 345 350
Ile Tyr Asp Ile Leu Ile Asn Ile Lys Glu Asn Tyr Gly Asn Ile Glu
355 360 365
Cys Phe Ile Ser Glu Asn Gly Met Gly Val Glu Gly Glu Asp Arg Phe
370 375 380
Arg Asn Glu Asn Gly Met Ile Asp Asp Asp Tyr Arg Ile Ala Phe Ile
385 390 395 400
Arg Glu His Leu Lys Trp Val His Arg Ala Val Glu Glu Gly Val Asn
405 410 415
Val Lys Gly Tyr His Leu Trp Thr Phe Met Asp Asn Trp Ser Trp Thr
420 425 430
Asn Ala Tyr Lys Asn Arg Tyr Gly Leu Val Ala Val Asp Leu Asp Asn
435 440 445
Gly Leu Lys Arg Thr Ile Lys Lys Ser Gly Tyr Trp Phe Lys Thr Val
450 455 460
Ala Glu Asn Asn Gly Phe
465 470
Claims (9)
1.一种编码嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的基因，该基因具有选自于a)或b)的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的编码嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的基因，其特征是该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.一种嗜热碱性β-葡萄糖苷酶，该酶具有选自于下列d)或e)的氨基酸序列：
d)权利要求1所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的嗜热碱性β-葡萄糖苷酶，其特征是该酶具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
5.一种表达嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的重组质粒，该质粒至少包括权利要求1或2所述的基因。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征是该重组质粒的载体为pET-28a(+)。
7.一种产生嗜热碱性β-葡萄糖苷酶的重组菌，该重组菌内导入了权利要求1或2所述的基因。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征是该重组菌为大肠杆菌。
9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征是上述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。
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