CN1786169A - 嗜热长链烷烃单加氧酶及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种嗜热长链烷烃单加氧酶及其编码基因与应用。该嗜热长链烷烃单加氧酶的pI为6.86，最适温度约为60℃，最适pH值约为7.5，分子量约为50400道尔顿，可高效氧化C15～C36烷烃的末端甲基产生相应的一元醇。该酶可以在石油污染物和石油废水的处理中以及在提高微生物石油采收率中广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶及其编码基因与应用，特别涉及一种嗜热长链烷烃单加氧酶及其编码基因与应用。
背景技术
在微生物代谢脂肪族烷烃途径的第一步酶反应中，烷烃单加氧酶(alkane 1-monooxygenase EC 1.14.15.3)首先将烷烃末端甲基氧化成相应的一元醇，然后该烷烃依次在其它酶的作用下氧化成醛、脂肪酸，再β-氧化成二氧化碳和水(Berthe-Corti等，Acta Biotechnologica，22：299-336，2002)。自从Peterson等首次报道了恶臭假单胞菌产生烷烃单加氧酶之后(Peterson等，J.Bol.Chem，242：4334-4340，1967)，相继在不同的微生物中，如棒杆菌(Corynebacterium sp.)(Cardini，J.Biol.Chem，245：2789-2796，1970)，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(Matsuyama，Agric.Biol.Chem.45：9-14，1981)，麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)(Zimmer，Biochem.Biophys Res.Commun，251：244-247，1998)，诺卡氏菌(Nocardioides sp.)(Hamamura，Appl.Environ.Microbiol，67：4992-4998，2001)，红球菌(Rhodococcus sp.)(Van Hamme，Microbiol Mol Biol Rev，67：503-549，2001)等发现了烷烃单加氧酶，而不动杆菌(Acinetobacter sp.)(Sakai，Biosci.Biotechnol.Biochem，58：2128-2130，1994)产生的烷烃双加氧酶能氧化长链烷烃(C12～C44)。已发现的烷烃单加氧酶均为膜蛋白，并且只氧化C6-C12的中长链烷烃。有关嗜热的能氧化长链烷烃的单加氧酶胞内可溶性蛋白的酶学和分子生物学特性还未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基因，其能编码嗜热的能氧化长链烷烃的单加氧酶。
本发明的另一目的是提供一种嗜热长链烷烃单加氧酶，其可在高温条件下，将C15～C36的一系列长链烷烃的末端甲基氧化为相应的一元醇。
本发明的另一目的是提供一种能表达嗜热长链烷烃单加氧酶的重组质粒。
本发明的再一目的是提供一种能产生嗜热长链烷烃单加氧酶的重组菌。
本发明的又一目的是提供一种在石油污染物和石油废水处理或提高微生物石油采收率中使用上述嗜热长链烷烃单加氧酶的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提出一种编码嗜热长链烷烃单加氧酶的基因，其具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；
c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的嗜热长链烷烃单加氧酶的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，上述编码嗜热长链烷烃单加氧酶的基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明提出一种嗜热长链烷烃单加氧酶，其具有选自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列：
d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
f)上述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有嗜热长链烷烃单加氧酶的活性。
在本发明的一个实施例中，上述嗜热长链烷烃单加氧酶具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
本发明提出一种表达嗜热长链烷烃单加氧酶的重组质粒，其至少包括上述编码嗜热长链烷烃单加氧酶的基因。
在本发明的一个实施例中，上述重组质粒的载体为pCom8。
在本发明的另一实施例中，上述重组质粒的载体为pET-28a(+)。
本发明提出一种产生嗜热长链烷烃单加氧酶的重组菌，该菌内导入了上述编码嗜热长链烷烃单加氧酶的基因。
在本发明的一个实施例中，上述重组菌例如为荧光假单胞菌或大肠杆菌，优选为荧光假单胞菌KOB2Δ1菌株或大肠杆菌BL21菌株。
本发明还提出一种石油污染物和石油废水的处理方法，该方法包括在石油污染物和石油废水的处理过程中使用上述嗜热长链烷烃单加氧酶的步骤。
本发明还提出一种提高微生物石油采收率的方法，该方法包括在石油开采中使用上述嗜热长链烷烃单加氧酶的步骤。
应当指出的是，上述提到的术语“严格杂交条件”在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格杂交条件可以是，相互之间的同源性不小于70％的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90％的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件：将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS)中，50℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(2×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(0.5×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜30min。
所属技术领域的技术人员应该知道，本发明的编码嗜热长链烷烃单加氧酶的DNA序列，还包括编码对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
另外，对本发明的嗜热长链烷烃单加氧酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有嗜热烷烃单加氧酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。
本发明提出的上述嗜热长链烷烃单加氧酶的性能不同于已知的烷烃单加氧酶，其具有嗜热的长链烷烃单加氧酶活性，pI为6.86，最适温度约为60℃，最适pH值约为7.5，分子量约为50400道尔顿，可高效氧化C15～C36烷烃的末端甲基产生相应的一元醇。本发明的长链烷烃单加氧酶的热稳定性，在迄今发现的烷烃单加氧酶中是最高的。
基于本发明的嗜热长链烷烃单加氧酶的上述特性和功能，该酶可以在石油污染物和石油废水的处理中以及在提高微生物石油采收率中广泛应用。一方面，该酶在高温下能降解长链(重质)烷烃，提高轻质烷烃与重质烷烃的比例、改善原油流动性等特性，从而利于原油的开采，提高石油采收率；另一方面，该酶在高温下对长链烷烃的降解特性，对由油田开采、输油作业的跑漏、溢流所引起的环境石油污染物以及由石油化工带来的高温石油废水的处理也具有良好的应用前景。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明实施例中的嗜热长链烷烃单加氧酶基因重组质粒pComALK的构建模式图。
图2为本发明实施例中的嗜热长链烷烃单加氧酶基因重组质粒pETALK的构建模式图。
图3为嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2对不同烷烃的降解结果。
图4为本发明的重组嗜热长链烷烃单加氧酶作用正十六烷后的产物质谱图。
图5为本发明的重组嗜热长链烷烃单加氧酶作用正二十八烷后的产物质谱图。
图6为本发明的重组嗜热长链烷烃单加氧酶的底物特异性分析结果。
图7为温度对本发明重组嗜热长链烷烃单加氧酶活性影响的曲线图。
图8为pH值对本发明重组嗜热长链烷烃单加氧酶活性影响的曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例一
1.嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2(CGMCC No.1228)总DNA的提取
研究证明，嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2在以原油或液体石蜡为碳源条件下产生较多的烷烃单加氧酶，该酶特别适于在高温条件下氧化C15～C36的长链烷烃。因此，在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2(该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.1228)，取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于250μl 50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，加入10μl 0.4MEDTA(pH8.0)，混匀后37℃保温20min，之后加入30μl 20mg/ml溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5μl 20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μl 10％SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提两次，氯仿∶异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，沉淀溶于100μl TE缓冲液(pH8.0，10mMTris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase 2μl，65℃保温30min，分别用酚∶氯仿∶异戊醇、氯仿∶异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μl TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280＝1.95，A260＝0.73。
2.嗜热长链烷烃单加氧酶基因的克隆和筛选
取前面所述的总DNA溶液0.5μl(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行20个循环PCR。
设定的PCR循环参数如下：
95℃，3min；95℃，30s；50℃，45s；72℃，2min；72℃，5min；4℃，2hr
引物序列如下：
上游引物5’-GTGACCCGGGATGACAAAAAAAATCCATATTAATGC-3’
下游引物5’-TAGAAGCTTTTATACATTTGAAGAAATATTTCGAT-3’
将上述PCR产物用SmaI和HindIII双酶切，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收1.3kb酶切产物片段。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pCom8连接，转化感受态荧光假单胞菌KOB2Δ1[该菌株由瑞士联邦苏黎士高等理工学院(Swiss Federal Institute of Technology Zurich)的J.B.Van Beilen教授提供，参见J.Bacterology，Mar.2002，1733-1742]后，涂于含50μg/ml Gm(庆大霉素)的LB固体培养基上。35℃培养12小时，再在30℃培养24小时，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQID NO：1所示的DNA序列的pCom8质粒为重组质粒pComALK(见图1)，含有该质粒的重组荧光假单胞菌KOB2Δ1菌株为荧光假单胞菌KOB2Δ1ALK。将该重组菌株分别接入以不同C原子数烷烃(正十二烷-正十八烷)作为唯一碳源的E2培养基(每升E2培养基含NaNH4HPO4·4H2O3.5g，K2HPO4·H2O 7.5g，KH2PO4 3.7g，1ml微量元素溶液，1ml 1MMgSO4·7H2O；每升微量元素溶液含FeSO4·7H2O 2.78g，MnCl2·4H2O 1.98g，CoSO4·7H2O 2.81g，CaCl2·2H2O 1.47g，CuCl2·2H2O 0.17g，ZnSO4·7H2O0.29g)中培养，48小时后，转化子菌株荧光假单胞菌KOB2Δ1ALK能在分别以15烷、16烷、18烷为唯一碳源的培养基中生长，而不能在分别以12烷、13烷、14烷为唯一碳源的培养基中生长，而对照菌株荧光假单胞菌KOB2Δ1不能在含有上述碳源的培养基中生长，从而表明重组质粒pComALK转化到荧光假单胞菌KOB2Δ1中后，可表达出烷烃单加氧酶的活性。
3.嗜热长链烷烃单加氧酶基因克隆入大肠杆菌
以上述重组质粒pComALK为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行20个循环PCR。
设定的PCR循环参数如下：
95℃，3min；95℃，30s；50℃，45s；72℃，2min；72℃，5min；4℃，2hr
引物序列如下：
上游引物：5’-CCAGAATTCATGACAAAAAAAATCCATATTAATGC-3’
下游引物：3’-TAGCTTTATAAAGAAGTTTACATATTGAGCTCGATC-5’
上述PCR产物用EcoRI和XhoI双酶切，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收1.3kb酶切产物片段。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌BL21(该菌株购自天津开发区厚普生物技术开发有限公司，货号为69387-3)后，涂于含50μg/ml Kan(卡拉霉素)的LB固体培养基上。37℃培养16～18小时，挑取单克隆菌落鉴定，插入有SEQ ID NO：1的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pETALK(见图2)，含有该质粒的重组大肠杆菌菌株为大肠杆菌BL21ALK。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，该基因DNA片段全长1323bp，由ATG起始密码开始，到TAA终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该完整的ORF编码一个由440个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质属于单加氧酶家族，最高相似性同荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Pf-5的单加氧酶基因，同源性为51％。
实施例二 重组嗜热烷烃单加氧酶的纯化和特性
将上述重组菌E.Coli BL21ALK单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入200ml含50μg/ml Kan的LB培养基(共10个摇瓶)，37℃，220rpm/min培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，45℃，150rpm/min诱导4小时。离心收集菌体，悬于50mMTris-Cl(pH7.5)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组烷烃单加氧酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组烷烃单加氧酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量约为50000道尔顿，与理论上推算的分子量(50400道尔顿)相似；等电点沉淀法测得的重组酶的等电点pI为6.86；重组酶反应的最适温度为约为60℃，最适pH值约为7.5。该重组酶仅对C15～C36的长链烷烃有作用，并对16烷的活性最高(见图6)，这与嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2发酵降解烷烃的特性一致(见图3)。
实施例三 重组嗜热烷烃单加氧酶氧化长链烷烃
在20ml旋盖试管中装入3ml下列反应体系：1mM烷烃，50mM Tris-Cl(pH7.5)，0.001％(W/V)Plysurf A-210G表面活性剂，1mM NADH，1mMMgSO4，2mg实施例二中制得的重组烷烃单加氧酶的纯化酶制剂。60℃，250rpm/min反应5min。加入3ml环己烷萃取，萃取的有机相经FINNICANPolaris Q气-质联用仪分析。结果显示该酶作用长链烷烃的末端甲基，其产物为相应的一元醇(见图4和图5)。
实施例四 重组烷烃单加氧酶活性测定
在20ml旋盖试管中装入3ml下列反应体系：1mM正十六烷，50mMTris-Cl，1mM MgSO4，0.001％(W/V)Plysurf A-210G表面活性剂，1mMNADH，0.2～0.3mg实施例二中制得的重组烷烃单加氧酶的纯化酶制剂，一定温度下，250rpm/min反应5min。加入3ml环己烷萃取，萃取的有机相经气相色谱仪(Agilent 6820)测定烷烃降解量，并计算酶活。
1.最适酶活温度
上述反应条件下，在37-70℃范围内测定上述重组烷烃单加氧酶的活性，结果表明保持该酶活性的最适温度约为60℃(见图7)。
2.最适pH
在上述反应条件下(温度为60℃)，在50mM Tris-Cl的不同pH缓冲液的条件下测定上述重组烷烃单加氧酶的活性，结果表明上述实施例一中构建的重组菌株E.Coli BL21ALK中表达的烷烃单加氧酶的最适pH值约为7.5(见图8)。
3.pH稳定性
将上述实施例二中制得的重组烷烃单加氧酶的纯化酶制剂与pH6.0～8.5的50mM Tris-Cl缓冲液混合，30℃放置24hr，测定酶活，其结果如下表所示，结果表明酶活在pH7.0～7.5范围内比较稳定。
本发明的嗜热长链烷烃单加氧酶在不同pH条件下的稳定性
| pH | 酶活性(μmol烷烃/mg蛋白/min) | 残留活性(％) |
| 负对照(未加酶)未处理(正对照)6.06.57.07.58.08.5 | 01.63740.11390.23050.89821.22680.52730.1259 | 01006.9614.0854.8674.9232.207.69 |
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110>南开大学
<120>嗜热长链烷烃单加氧酶及其编码基因与应用
<130>5P99012-CN-A
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1323
<212>DNA
<213>嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2
<400>1
atgacaaaaa aaatccatat taatgcattt gaaatgaatt gtgtaggtca tatagctcat 60
ggactttgga ggcatcctga aaatcagcgg caccgttata cagatttgaa ttattggaca 120
gaacttgcac aattattaga aaaggggaaa ttcgatgctt tatttttagc tgatgtagtt 180
ggaatttatg atgtctatag acaaagtagg gatactgcag ttcgtgaagc tgttcaaatt 240
cctgtaaatg atcccttaat gcttatttca gcgatggcct atgtaacaaa acatctagca 300
ttcgctgtca ccttctcaac aacctatgag catccatatg gtcacgcaag acgtatgtca 360
acattagatc acttgacaaa aggtagaatt gcttggaatg ttgtaacttc gcatctcccg 420
agtgctgata agaactttgg tatcaaaaaa atacttgaac atgatgagcg ttacgatttg 480
gcagatgaat atctagaagt gtgttataaa ctatgggaag ggagttggga agataatgca 540
gtaattcggg atatagaaaa taatatatat actgatccga gcaaagtaca cgaaataaat 600
cactcaggaa aatattttga agttcccgga ccacatttat gcgaaccctc tcctcagcgt 660
acgccagtta tttatcaagc aggtatgtcc gaacggggac gcgaatttgc cgcaaaacat 720
gcagaatgtg ttttcttagg tggaaaagat gtagagactc taaaattttt tgtcgacgat 780
ataagaaaaa gagccaaaaa gtatggacgt aatccagatc atattaaaat gtttgccgga 840
atatgtgtaa ttgttggaaa aacacatgat gaagcaatgg aaaaattaaa ttctttccaa 900
aaatattgga gcttagaagg acatttagca cattacggag gtggaactgg gtacgattta 960
tctaaatata gttctaatga ttatataggt agcatatctg tcggagaaat tattaataat 1020
atgagtaaac tcgatggtaa atggtttaaa ttatctgtag gtactccgaa aaaagttgcg 1080
gacgaaatgc aatatttagt tgaggaagca ggtatcgacg gatttaatct agtacaatat 1140
gtatcaccag gtacttttgt tgattttatt gaactagtag ttccagaatt acagaaacga 1200
ggtctatacc gagtagatta tgaggaagga acctatagag aaaaattgtt cggtaaagga 1260
aattatcgat taccggatga tcatattgct gcacgatatc gaaatatttc ttcaaatgta 1320
taa 1323
<210>2
<211>440
<212>PRT
<213>嗜热脱氮芽胞杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2
<400>2
Met Thr Lys Lys Ile His Ile Asn Ala Phe Glu Met Asn Cys Val Gly
1 5 10 15
His Ile Ala His Gly Leu Trp Arg His Pro Glu Asn Gln Arg His Arg
20 25 30
Tyr Thr Asp Leu Asn Tyr Trp Thr Glu Leu Ala Gln Leu Leu Glu Lys
35 40 45
Gly Lys Phe Asp Ala Leu Phe Leu Ala Asp Val Val Gly Ile Tyr Asp
50 55 60
Val Tyr Arg Gln Ser Arg Asp Thr Ala Val Arg Glu Ala Val Gln Ile
65 70 75 80
Pro Val Asn Asp Pro Leu Met Leu Ile Ser Ala Met Ala Tyr Val Thr
85 90 95
Lys His Leu Ala Phe Ala Val Thr Phe Ser Thr Thr Tyr Glu His Pro
100 105 110
Tyr Gly His Ala Arg Arg Met Ser Thr Leu Asp His Leu Thr Lys Gly
115 120 125
Arg Ile Ala Trp Asn Val Val Thr Ser His Leu Pro Ser Ala Asp Lys
130 135 140
Asn Phe Gly Ile Lys Lys Ile Leu Glu His Asp Glu Arg Tyr Asp Leu
145 150 155 160
Ala Asp Glu Tyr Leu Glu Val Cys Tyr Lys Leu Trp Glu Gly Ser Trp
165 170 175
Glu Asp Asn Ala Val Ile Arg Asp Ile Glu Asn Asn Ile Tyr Thr Asp
180 185 190
Pro Ser Lys Val His Glu Ile Asn His Ser Gly Lys Tyr Phe Glu Val
195 200 205
Pro Gly Pro His Leu Cys Glu Pro Ser Pro Gln Arg Thr Pro Val Ile
210 215 220
Tyr Gln Ala Gly Met Ser Glu Arg Gly Arg Glu Phe Ala Ala Lys His
225 230 235 240
Ala Glu Cys Val Phe Leu Gly Gly Lys Asp Val Glu Thr Leu Lys Phe
245 250 255
Phe Val Asp Asp Ile Arg Lys Arg Ala Lys Lys Tyr Gly Arg Asn Pro
260 265 270
Asp His Ile Lys Met Phe Ala Gly Ile Cys Val Ile Val Gly Lys Thr
275 280 285
His Asp Glu Ala Met Glu Lys Leu Asn Ser Phe Gln Lys Tyr Trp Ser
290 295 300
Leu Glu Gly His Leu Ala His Tyr Gly Gly Gly Thr Gly Tyr Asp Leu
305 310 315 320
Ser Lys Tyr Ser Ser Asn Asp Tyr Ile Gly Ser Ile Ser Val Gly Glu
325 330 335
Ile Ile Asn Asn Met Ser Lys Leu Asp Gly Lys Trp Phe Lys Leu Ser
340 345 350
Val Gly Thr Pro Lys Lys Val Ala Asp Glu Met Gln Tyr Leu Val Glu
355 360 365
Glu Ala Gly Ile Asp Gly Phe Asn Leu Val Gln Tyr Val Ser Pro Gly
370 375 380
Thr Phe Val Asp Phe Ile Glu Leu Val Val Pro Glu Leu Gln Lys Arg
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Arg Val Asp Tyr Glu Glu Gly Thr Tyr Arg Glu Lys Leu
405 410 415
Phe Gly Lys Gly Asn Tyr Arg Leu Pro Asp Asp His Ile Ala Ala Arg
420 425 430
Tyr Arg Asn Ile Ser Ser Asn Val
435 440
Claims (14)
1.一种编码嗜热长链烷烃单加氧酶的基因，该基因具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；
c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的嗜热长链烷烃单加氧酶的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的编码嗜热长链烷烃单加氧酶的基因，其特征是该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.一种嗜热长链烷烃单加氧酶，该酶具有选自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列：
d)权利要求1所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
e)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
f)上述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有嗜热长链烷烃单加氧酶的活性。
4.根据权利要求3所述的嗜热长链烷烃单加氧酶，其特征是该酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
5.一种表达嗜热长链烷烃单加氧酶的重组质粒，其特征是该质粒至少包括权利要求1或2所述的基因。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征是该重组质粒的载体为pCom8。
7.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征是该重组质粒的载体为pET-28a(+)。
8.一种产生嗜热长链烷烃单加氧酶的重组菌，其特征是该重组菌内导入了权利要求1或2所述的基因。
9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征是该重组菌为荧光假单胞菌。
10.根据权利要求9所述的重组菌，其特征是上述荧光假单胞菌为荧光假单胞菌KOB2Δ1菌株。
11.根据权利要求8所述的重组菌，其特征是该重组菌为大肠杆菌。
12.根据权利要求11所述的重组菌，其特征是上述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。
13.一种石油污染物和石油废水的处理方法，该方法包括在石油污染物和石油废水的处理过程中使用权利要求3或4所述的嗜热长链烷烃单加氧酶的步骤。
14.一种提高微生物石油采收率的方法，其包括在石油开采中使用权利要求3或4所述的嗜热长链烷烃单加氧酶的步骤。
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