CN114807182A - 降解长链烷烃的酵母菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及降解长链烷烃的酵母菌株及其应用。本发明以解脂耶式酵母为底盘，将外源烷烃羟化酶基因模块整合酵母基因组，得到烷烃羟化酶外源单拷贝表达酵母菌株。在此基础上，对菌株进行优化，得到的烷烃羟化酶外源多拷贝表达酵母菌株，其降解效率可达71.50％，烷烃降解酶活性为0.65U/mg，并在以葡萄糖为底物时其降解效率较高；更进一步强化，得到的内源性烷烃转运蛋白与外源烷烃羟化酶基因模块组合的菌株烷烃降解效率进一步提高，降解效率可达75.12％，疏水性为91.8％。并且，外源基因模块整合菌株烷烃降解效率优于内源基因模块整合菌株。

Description

降解长链烷烃的酵母菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及降解长链烷烃的酵母菌株及其应用。

背景技术

随着我国经济和社会迅速有力地发展，对能源的需求和消耗量也在不断增加。然而，各种溢油事故的发生率也在不断增加，给我国的环境和经济造成了不可估量的破坏。随着环保意识的增强，石油烃环境污染的生物修复研究不断加强。与常用的物理和化学修复方法相比，生物修复由于其效率高、副产物环保、成本低等优点而受到越来越多的关注。近年来，通过系统生物学策略改造的基因工程菌已经实现了对多种石油污染物的生物降解。在代谢工程策略和合成生物技术的帮助下，基因工程已被证明可以切实有效地提高微生物的整体能力。功能基因不仅是研究石油降解微生物的群落结构特征、固有降解菌和降解潜力的基础，也是构建基因工程菌进行生物修复的依据。如将来源于Acidovorax sp.CHX100的环己烷降解功能基因：细胞色素P450、铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白，在菌株Pseudomonas taiwanensis VLB120中进行过量表达，可极大地提高菌株对环己烷的氧化降解效能。微生物整体能力的提高直接表现为对石油污染物降解效率的提高；Diana V.Cortés-Espinosa等人筛选并获得了一株可以降解菲的黑曲霉菌。通过将来自寒带菌的锰过氧化物酶基因(mnp1)整合到其中，黑曲霉对土壤中的菲的去除率提高到31.94％。这些成功案例表明，系统生物学在强化石油污染物降解菌和加速生物修复方面具有巨大潜力。

现有的石油烃降解菌研究集中在细菌领域，虽然细菌可以利用多种石油成分，但它们对简单结构和短链烷烃的消化能力强于长链烷烃和多环芳烃。并且大部分石油烃降解菌基因组信息和代谢网络不清晰，基因操作难进行，所以目前，酵母由于其遗传背景清晰，分子操作方便的特性，而被用于构建烷烃降解工程菌。但以酿酒酵母为底盘的烷烃降解工程菌对长链烷烃降解效率低，很难达到工业化对烷烃的降解需求。所以需要对以酵母为底盘的工程菌株进行优化及改造，进一步提高石油烃的降解效率。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供降解长链烷烃的酵母菌株及其应用。

本发明提供了一种核酸组合，包括：编码烷烃羟化酶的核酸和编码烷烃转运蛋白的核酸。

本发明中，所述编码烷烃羟化酶的核酸包括如下I)～IV中的任意一种：

I)、AlmA1、LadA或AlmA2，其中，AlmA1的来源为Acinetobacter sp.ADP1；LadA的来源为Geobacillus thermodenitrificans NG80；AlmA2的来源为Acinetobacter sp.M-1；

II)、与如I)所示的核酸具有至少80％同源性且与I)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；

III)、如I)所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；

IV)、与如I)所示的核酸互补或部分互补的核酸。

本发明中，所述编码烷烃转运蛋白的核酸包括如下i)～iv)中的任意一种：

i)、来源于解脂耶式酵母的烷烃转运蛋白ABC1；

ii)、与如i)所示的核酸具有至少80％同源性且与i)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；

iii)、如i)所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；

iv)、与如i)所示的核酸互补或部分互补的核酸。

本发明实施例中，所述的烷烃羟化酶是通过在烷烃末端的不同位点插入氧原子来启动烷烃的有氧降解，在一些具体实施例中，过表达烷烃羟化酶，可提高烷烃降解能力。

本发明实施例中，以解脂耶式酵母ATCC 201249作为出发菌株，过表达AlmA1、AlkM、LadA或AlmA2，结果表明：除过表达AlkM外，过表达其他三种烷烃羟化酶的菌株石油烃降解能力均有明显提高。

一些实施例中，所述的核酸组合包括AlmA1和ABC1。

另一些实施例中，所述的核酸组合包括LadA和ABC1。

另一些实施例中，所述的核酸组合包括AlmA2和ABC1。

本发明中，所述烷烃羟化酶为AlmA1，其来源可以包括Acinetobacter sp.ADP1，也可以包括其他物种来源的AlmA1。在本发明实施例中，以Acinetobacter sp.ADP1为受试对象，结果表明，其可以提高菌株ATCC 201249的石油烃降解水平。在一些具体实施例中，所述AlmA1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中，所述烷烃羟化酶为LadA，其来源可以包括Geobacillusthermodenitrificans NG80 LadA，也可以包括其他物种来源的LadA。在本发明实施例中，以Geobacillus thermodenitrificans NG80 LadA为受试对象，结果表明，其可以提高菌株ATCC 201249的石油烃降解水平。在一些具体实施例中，所述LadA的核酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明中，所述烷烃羟化酶为AlmA2，其来源可以包括Acinetobacter sp.M-1AlmA2，也可以包括其他物种来源的AlmA2。在本发明实施例中，以Acinetobacter sp.M-1AlmA2为受试对象，结果表明，其可以提高菌株ATCC 201249的石油烃降解水平。在一些具体实施例中，所述AlmA2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明中，所述编码烷烃转运蛋白ABC1的核酸来源可以包括解脂耶式酵母ATCC201249，也可以包括其他物种来源的ABC1。本发明中，所述的烷烃转运蛋白ABC1介导分子跨膜转运，对于疏水或脂质化合物的输入和输出具有重要性作用。在本发明实施例中，以解脂耶式酵母ATCC 201249的ABC1为受试对象，将其与烷烃羟化酶进行组合，结果表明，其可以提高石油烃的降解水平，在一些具体实施例中，所述ABC1的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一些具体实施例中，研究表明，表达如SEQ ID NO.3所示核酸序列的LadA基因的解脂耶氏酵母对正十六烷的降解效率及烷烃羟化酶活性更高。

本发明还提供了一种表达单元，包括启动子和如本发明所述核酸中至少一个。

本发明中，所述的表达单元包括启动子、本发明所述的核酸组合及终止密码子，其中，启动子包括：PFBAin和/或PHp4d中的至少一个。

一些实施例中，所述表达单元包括PFBAin和AlmA1。

另一些实施例中，所述表达单元包括PFBAin和LadA。

或者所述表达单元包括PFBAin和 AlmA2。

一些实施例中，所述表达单元包括 PHp4d和 AlmA1。

另一些实施例中，所述表达单元包括PHp4d和LadA。

或者所述表达单元包括PHp4d和AlmA2。

一些实施例中，所述表达单元包括PFBAin和ABC1。

另一些实施例中所述表达单元包括PHp4d和ABC1。

进一步的，在一些具体实施例中，本发明中所述的表达单元也包括：含烷烃羟化酶的表达元件与含烷烃转运蛋白ABC1的表达元件组合形成的组合表达元件。

本发明中，所述的表达单元还包括单个或多个本发明所述的核酸以串联、融合表达或及其他可行方式进行组合形成的表达单元，本发明对此不做限定。

本发明所述表达单元，还可以包括复制子、终止子等调控元件，本发明对此不做限定。

进一步的，本发明还提供了一种载体，包括载体骨架和本发明所述的核酸组合或本发明所述的表达单元。

本发明所述的载体，还包括将所述的核酸组合或表达单元与单个或多个载体骨架形成的多种形式的载体。

进一步的，本发明所述的载体为整合型质粒载体或游离型质粒载体。在本发明实施例中，所述质粒载体为整合型载体。一些实施例中，所述整合型质粒为单拷贝的PUC57，另一些实施例中，所述的整合载体为多拷贝的PINA1269。

更进一步的，本发明提供了菌株，包括本发明所述的核酸组合、表达单元及载体。

本发明所述菌株的底盘为解脂耶氏酵母。

一些具体实施例中，所述解脂耶氏酵母为解脂耶式酵母ATCC 201249

本发明提供了一种菌株构建方法，包括将本发明所述的载体转化或转染入酵母菌株。

本发明还提供了菌株在降解石油烃中的应用。

本发明实中，所述的石油烃包括烃类:正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃等多种烃类和少量其他有机物，一般4个碳原子的烃类为气体，5～18个碳原子为烃类为液体，18个碳原子以上的为固体，均亲油性。本发明以十六烷烃为受试对象，鉴定菌株对石油烃的降解效果。

进一步的，本发明提供了石油烃的降解方法，利用本发明所述的菌株对含石油烃的基质进行降解，所述降解的基质中包含葡萄糖和正十六烷。

更进一步的，本发明所述的基质中的葡萄糖浓度为20g/L；正十六烷的含量为10g/L。

在一些具体实施例中，本发明所述的菌株在添加葡萄糖的基质的降解效率更高，可能由于葡萄糖在糖酵解过程中，辅助因子(NADH)再生系统的作用，葡萄糖底物不断为细胞内表达的烷烃羟化酶提供有效活性的NADH造成。

本发明所述的菌株及所述的石油烃的降解方法，可被用于海洋原油泄露、港口和船舶含油污水排放、餐厨油污废水的处理等方面。

本发明以解脂耶式酵母为底盘，将外源烷烃羟化酶AlmA1、AlkM、LadA和AlmA2基因模块整合酵母基因组，得到烷烃羟化酶外源单拷贝表达酵母工程菌株，长链烷烃降解效率可达66.35％；对烷烃降解菌株的表达模块、降解条件进行优化，得到的烷烃羟化酶外源多拷贝表达酵母工程菌株，其降解效率可达71.50％，烷烃降解酶活性为0.65U/mg，并在以葡萄糖为底物时其降解效率较高；对烷烃降解菌株进一步强化，得到的内源性烷烃转运蛋白与外源烷烃羟化酶基因模块组合的工程菌株烷烃降解效率进一步提高，降解效率可达75.12％，最高疏水性达到91.8％。并且，外源基因模块整合菌株烷烃降解效率优于内源基因模块整合菌株。

附图说明

图1示解脂耶氏酵母降解途径；

图2示烷烃羟化单拷贝强化路径的构建；

图3示单拷贝菌株利用正十六烷的研究，(a)为生长曲线；(b)为96h降解率；

图4示烷烃羟化多拷贝路径强化的构建；

图5示烷烃羟化酶差异表达对解脂耶氏酵母降烃的影响；

图6示解脂耶氏酵母降解途径；

图7示烷烃羟化酶差异表达对解脂耶氏酵母降烃的影响；

图8示组合筛选烷烃羟化酶和CPR对解脂耶氏酵母降烃的影响；

图9示烷烃羟化酶活性的测定；

图10示菌株利用正十六烷的研究，(a)为生长曲线；(b)为96h降解率；

图11示解脂酵母在不同时间疏水性研究。

具体实施方式

本发明提供了降解长链烷烃的酵母菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

本发明中，所述的至少80％同源性，是指与所述核酸序列相似度≥80％的序列，进一步的，是指与所述核酸序列相似度≥85％的序列；更进一步的，是指与所述核酸序列相似度≥90％的序列；具体的，所述的80％，是指与所述核酸序列相似度为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的核酸序列。

本发明中，AlmA1是来自于Acinetobacter sp.的烷烃羟化酶，其编码核酸的序列为：atgaaggttgatgtcatcatcggtgcaggtatctctggtattggtgccgtccattccaagaactgtcgtaagatcagaagatcaggtggtacttgggatcgttacggtatcagatccgactctgacatgtctactggtaacaaatgggctaaggataaggttgcttccggtgccatcaagggttactctgacgtgatttccaacaaggacaaaatacacggtcacagagtttctgctaattacgattccaccaagaagaagtgggttattgacaacaacaagaagaagacctggtctgccaacgttatgggttgcaccggttactacaactacgacggttacgctaagaaggacaagggtatccaccattggaacgactacactggcaaaaaggttgttattattggttccggtgctactgctatcactgtttccatggttaagggtggtgctggtcatgttaccatgagatccacttacatcgccaccatctccatcgatatttacaagactcgtaagatgtccactgcttacaaaaccagagctagaaacattggtatgcgtggtatctacgctgccaagtacaagaccgtcagaagaaagggcattaaaggtaaggttgacatgaaacacactagttacaactgggacagatgtgtcgtcgatggtgacaaggctagaggtgcttccgttacagacatcaagactgctaacggtatcaagtctggtaagcacgctgacattgtcatctctgctaccggtattatcggtggtgttggttctatcgatggtaagatgaacacttcacacatgtacggtgtcatggtttctgatgttaacatggctatgattattggttacattaacgcttcttggaccaaggttgacattgctgctgattacatctgtagaatcaaccacatggacaagaatggtgatgtcattgctcacgccgattctagaaatgacactatcatgggtaagatgtcttctggttatattgccagagctgccgacgttatgaagggtaaggcttggaagatcaccaacaactatgccgacagaaaaaaagatgctaagaacgatggtgttcacaagagaggtactgctaacagaaagaaggtcagctaa(SEQ IDNO.1所示)。

本发明中，LadA是来自于Geobacillus thermodenitrificans NG80-2的烷烃羟化酶，其编码核酸的序列为：atgaccaagaagatccacatcaacgccttcgagatgaactgcgtgg gccacatcgcccacggcctgtggcgacatcccgagaaccagcgacaccgatacaccgacctcaactactggaccgagctggcccagctgctggagaagggcaagttcgacgctctgttcctcgccgacgtcgttggcatctacgacgtctaccgacagtcccgagacaccgccgtgcgagaggctgtgcagattcccgtgaacgaccccctgatgctgatctccgctatggcctacgtcaccaagcatctggccttcgccgtcaccttctccaccacctacgagcacccctacggccacgcccgacgaatgtccaccctggaccacctgaccaagggccgaatcgcctggaacgtcgtcacctcccacctgccttccgccgacaagaacttcggcatcaagaagatcctcgagcacgatgagcgatacgacctggccgacgagtacctcgaggtttgctacaagctgtgggagggttcctgggaggacaacgctgtgattcgagacatcgagaacaacatctacaccgacccctccaaggtccacgagatcaaccactccggcaagtacttcgaggtccccggcccccacctgtgcgagccttcccctcagcgaacccccgtcatctaccaggccggcatgtccgagcgaggccgagagttcgccgccaagcacgctgagtgcgtcttcctgggtggcaaggacgttgagactctgaagttttttgttgacgacatccgaaagcgagccaagaagtacggccgaaaccccgaccacatcaagatgttcgccggtatctgcgttatcgtcggcaagacccacgacgaggccatggagaagctgaactccttccagaagtactggtccctggagggccacctggcccactacggtggtggtactggctacgatctgtccaagtactcgtctaacgactacatcggatctatctccgtcggcgagatcattaacaacatgtctaagctggacggtaagtggttcaagctgtctgtgggtactcccaagaaggtcgccgacgagatgcagtacctggtcgaggaggccggcattgatggttttaacctggtccagtacgtcagccctggtactttcgtggacttcatcgagctggtggtccccgagctccagaagcgaggactgtaccgagtcgattacgaggagggtacttaccgagagaagctgtttggcaagggcaactaccgactgcccgatgaccacatcgccgcccgataccgaaacatctcctccaacgtgtaa(SEQ ID NO.3所示)。

本发明中，AlmA2是来自于Acinetobacter sp.M-1的烷烃羟化酶，其编码核酸的序列为：atggagaagcaggtcgatgtcctgatcatcggcgccggtatctccggtatcggcctggc tgttcacctgtccaagaactgcccccagcgaaagttcgagatcctggagcgacgagactcctttggcggcacctgggacctgttccgataccctggtatccgatctgactccgacatgtccacctttggcttcaacttcaagccctgggccaaggacaaggtcctggcttctggagccgagattaagggctacctgtctgacgtcatttctgagaaccagctcaaggacaagatccacttcggtcaccgagtcctctccgccaactacgactccgctaagaagaagtgggccgtcgagatcgaggactccaacaagaagaagcagacctggtccgccaacttcgtgatgggctgcaccggttactacaactacgaccagggatacgcccccaagttccccaagcaggaggacttcaagggccagctgatccacccccagcactggcctgagaacctggactacaccggcaagaaggtggtcatcatcggctccggagccaccgctatcaccctggttccttccatggtcaagggcggagccggtcacgttaccatgctccagcgatccccctcctacatcgccaccatcccttccatcgacttcatctacgagaagacccgaaagttcatgtctgaggagactgcctacaagttcacccgagcccgaaacatcggcatgcagcgaggtatctacgccctggctcagaagtaccccaagaccgtccgacgactgctgctgaagggcatcgagctgcagctgaagggcaaggtcgatatgaagcacttcaccccctcctacaacccctgggaccagcgactgtgcgtggttcctgacggagacttgtttaaggccctgcgagagggccaggccaacgttgagactgaccagattgagaagttcaccgccaacggcattcagctcaagtccggcaagcacctggaggctgacatcgtgatttccgccaccggactggagatccagatcctgggaggtgtgaagggaaccatcgacggcaagcccatggacacctcccagcacatgctgtaccagggcgtgatggtcagcgatgttcccaacatggccatgatcattggctacatcaacgcctcctggaccctgaaggtcgatatcgccgccgactacatctgccgactcctgaaccacatggacaagaacggctacgacgaggtcatcgcccacgctgaccctgctctgcgagagcaggacaccatcatgggaaagatgtcctccggttacatcgcccgagccgctgacgttatgcccaagcagggtaagaaggccccctggaagattaccaacaactacctggccgaccgaaaggagctgaaggacgcttcctttaacgacgtggtcctgcagtttcacaagcgaggcgagcaggtcgatcgaaagcccaagctcgtatcctaa(SEQ ID NO.4所示)。

本发明中，ABC1是来自于解脂耶式酵母ATCC 201249的烷烃转运蛋白，其编码核酸的序列为：atggcgcactactacccgtcgggcgtgtcgtcggtcggcaacttcgactcgctagatgtcgagatcagatcgctggccgagggaatggtacacaaacctcaccatcgagaatcgcgatacattttcgaccacacctttgacgacgagtttcgagaagagcatgaggacgaatacgactatgatatgctgcggaagacgtcttttgagaaccccgacgtcaacccttacgtggaggccagtgcggagccggagctggatccctggtcgggcgagttcaactcgcgaaagtggatcaagaccgtgctgggtctcaaggagcgatttggaaacagtaagggaatcacggccggcgtgtcgttcaagaacctgggtgcctacgggtacggcagtcgcagtgactaccagaagacgtttctcaacgtcattgtggccactggagatttgctgcgaagtgctattggcgctaaacggacaagcaaaatccagattctgcgcaagtgcgatggactggtgcttccaggtgaaacctgtgtagttctgggacgtcccggatcaggatgcactacatttctcaagagtattgcttgcgagacgtacggatttcatgtggaggaagagacacaatggaactatcagggtgagtatttgggattatggggctatgaggttatgagggagatggaaataccggaatgaacatcttccaggtggtctattctttcttgttggccgttattttgtgtccacctgattttttttatttttttattttttattttttatttttgtgtgttgcacacattccaatcagtgcagatcactcccaacacggccggtatctaatacctagacccgaatagagtgttctgtacgcgataatcataccaggtgggaatcagaacacaagaacaaagaaagcagatttccgcggagcgcgaaaaacaataaccaataatgaccctactaacgcaggcgtaccacgagatgtcatgacaaagcattgccgaggagaaattgtctacaatgctgaacacgatatccatttccctcacttgacggtcggacagaccctcatgtttgcggctctagcccgaactccccgaaaccgagtgctgggagtgacccgagagcagtatgctcgtcacacccgagatgttaccatggccactctcggtctgtctcacacaatcaacaccaaggttggatccgatctagtgcgtggagtctccggtggagagagaaaacgagtctctattgccgagtccgtcgtctgcggagcgcctctacagtgctgggataactccactcgaggtctggatgctgcgaacgccaccgaattcattcgatctctgcgactttccgcccagatgacaggcgcctccatgtttgtgtctctgtaccaggcttcccaggaggcctacgacatgttcgacaaggtgtgtctgctgtacgagggacgacaaatcttcttcggtaaggccggagaggccacatcatactttgagggtctgggattcgagcgagcccatcgccagaccactggtgattttctgacctcccttacaaaccctgtcgagcgaagaatcaaggctggatgggagaagctcgtgcctcgaactcccgaggagtttgagtctcgatggagatcgtcccgaacacacgctctgttagtttacaacatcgaccgattcaataccactcatcctcttggtggtcagggttatgtcgagttcatgaagctccgaaaggagtctcaggcccgaaatacccgtctgtcgtcgccatatctgctctcctggcccatgcaggttcgtctgtgtctctggagaggcttcttgttggtgagaggagacttgtccatgacgctgatgaccatcattggtaacttcatcatggccctcattctggcatcaatgtactataatttgcgagagtcgactgatgccttcttctcgcgatctgccctgcttttcttggccatgttgctgaacgctatggcctccgttttggagattttcgtgctgtacggacagcgaccactgattgagaaacacaaacgatatgcattgtaccatccctttgcagaatcaatcgcgtcaatgttggttgatttaccgaccaaactggcaactctgatttcagtcaacctcgctctttacttcatgactaacctgagacgaaccccgggtgccttcttcatcttcctgctcttttcgttcacctgtaccatggcaatgtccatgattttccggttcactgcttctgtcaccaagactatggaacaggctctggcccccgcctctgtgctagttttggcactggttatttacactggtttcacgcttcccgtcgattacatgcatggatgggcccgatggatgaattacctcaatcctgttgcttatgcgtttgaggcagtaatggtgaacgagttccgaaacagaaggttcccttgtggactttacgttccttcccggtctttctacaactctgtgcccgctgagtccaagtcttgtgtggctatcggcgccaagctcggccaggactacgtcgatggctccgtgttcatcagcacggcctacaagtacgagactggacacctgtggcgaaacctgggcattctgtgggcctttgctggctttttctgcggcgtctacctgcttgctgccgagtacgtgaccatggcccagtccaagggtgaggttctgctgttcaagcgatcccagcatcgaaagaacctcaaggccaagcctgacaagcgattccaagacgttgagcttggagacaacctcggcgaccacaacttggaccaaaacctcggcgacaaccactcgacgtactcttaccagcaacccatccaggctcagattcccccttctcggtacgcccagcaggctcccatgactcccgctcctatgatgcatgtccccatgactcctggtggcatgctttctcccggtcagcaaatgttctctcccggtcagcaaatgatgacgcctggtcccatgtcacccgcaggcatgatgactcccggttttacatatgtgcccccccatggagacactattcaccaaccgcctaccgttggagacgacatcaactacacgactcccgcgccccaggtgaacttcacccctgccactccagctcagtacactactcccgccaccccagctcagtacaacactcctggcacccctggtattactggtgggtacgagccccctcatggagacactgttcacatgccccccacagttggtgatgacacaaactacattcccaccaaggttcgcaccaacctgtctctcaactcgtccaaatctaacttgcagcactctggagtgttccaatggaccgatgtttgctacgatatcaaggttgctggtgagaacaagcgattgctggaccatatcgacggttacgtgaagcccggtaccctcaccgctctcatgggagcttctggtgctggaaagactactcttcttgatgtgctggctgatcgaaaatccactggtattgttcatggagacatgttggtcaatggccagcagcgaaacgcctctttccagcgaaagaccggatacgttcaacagcaggatttgcatactgccactgccactgttcgtgagtctctcgagttctcagctctgttgcgacagccctcttctgtgtctcgagctgacaagctggcttacgtcgatgaggtcatttctattcttgagatggattcttacgctgatgccgttgttggtgttcctggtgaaggtcttaacgtggaacagcgaaagcgtctgactatcggcgtcgagcttgctgccaagcccgagctgctgcttttcctggatgagcctacctccggtctggattcccagactgcttggtctatcgtctctctgctcaaaaagctggctgccaacggtcaggctatcctgtgtaccatccatcagccctctgccattctgttccaagagtttgatcgacttctgttcctggcagccggtggaaagacagtgtactacggagacctcggtgataaggcgtctctgctcattgaatactttgaaagtaacggtgctgacccttgtcctgataacggtaaccctgccgaatggatgctggaggtaattggtgctgctcctggttcccgggccaagaaggactggccctcagtctggcgatactcccagcttcgacgacaacagcgtgaggaactcgatgatatgcgtcttgcattcaacgctgactctcaggcagctcttgcagttggaggagaagacactgatttcgccgtgtctcagtggacccagctgtactacgttaccaagcgactgctgcagttccactggcgaactccctcctatctgtggtccaagatgactctgtgtattggttgtgctctgttcattggtttctccttctacaagtcggctcgagacattcagggtcttcagaaccaaatgtttagtattttcctcatgttcctgattttcaccacagttgccgagcagattatgcctcttttcatgattcagcgagacttgtacgaggctcgagagcgtgcttccaagacttactcgtggcaggtgttcctcggcggaaatatgctcgcggagcttccctggcagattatcgtggcggttgtcgtcttcttctgcatgtactaccccattggattctatcgaattgcggctgagaaccaccagacacaggagcgaggagctctctacttcctcttcctgctggtcttcttcatttacgactctacctacgctcacatgattggtgtcatgttcaacaaccacgagacggcagccaactttgcatacctgctcttctccttctgtcttatgttctgtggtgtgctggccacgaaggagtccatgcctggattctggatcttcatgtaccgagcgtcgcctctgacatacttcattggcggtttcatggccactggtttggccggaggaaaggtg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ID NO.5所示)。

在一些具体实施例中，本发明所述的一种菌株构建方法步骤为：

(1)烷烃羟化酶密码子优化；

(2)烷烃羟化酶基因或羟基转移酶ABC1基因与载体骨架进行整合；

(3)整合体系转化大肠杆菌，经菌落PCR验证筛选正确的转化子；

(4)获得整合载体并NotI酶切获得整合片段；

(5)整合片段转化酵母底盘菌株，获得重组酵母工程菌株。

进一步的，本发明所述的烷烃密码子优化是指经过解脂酵母密码子优化。

更进一步地，本发明所述的烷烃羟化酶基因或羟基转移酶ABC1基因与载体骨架进行整合，是利用酶切连接的方式，设计带有酶切位点的PCR引物，扩增得到带有酶切位点的目的片段，随后对片段及载体均进行酶切，用T4酶连接后转化大肠杆菌。

在一些具体实施例中，本发明所述的整合片段是将构建好的重组质粒经NotI酶切、琼脂糖凝胶电泳后回收正确的目的条带进行酵母基因组整合。

在一些具体实施例中，本发明所述的整合片段的启动子及拷贝数对菌株石油烃降解效率影响较大，更换启动子、提高拷贝数均可以对石油烃降解效率造成影响。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1强化烷烃降解路径的解脂底盘的构建

本发明选择解脂耶氏酵母，分别外源表达来源于Acinetobacter sp.ADP1的AlmA1和AlkM、来源于Geobacillus thermodenitrificans NG80-2的LadA烷烃羟化酶基因和来源于Acinetobacter sp.M-1的AlmA2，以实现长链烷烃的高效降解。解脂耶氏酵母降解长链烷烃途径如图1所示。

1.烷烃羟化酶的筛选

本研究选取解脂耶式酵母ATCC 201249作为出发菌株，将经过解脂耶氏酵母密码子优化后的烷烃羟化酶(AlmA1、AlkM、LadA和AlmA2)基因整合在PUC57载体上，载体两端为BsaI酶切位点。利用BsaI酶切后，将酶切体系进行凝胶电泳，并利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行片段回收，得到带有黏性末端的线性片段AlmA1、AlkM、LadA和AlmA2。本次研究选用具有强启动子PFBAin的PUC57-K8FB-HUM(序列如SEQ ID NO.7所示)整合载体，利用BsaI对K8FB进行单酶切，胶回收得到线性载体K8FB。接下来，利用T4连接酶将回收后的线性片段与K8FB载体连接在一起。将连接体系转化到大肠杆菌后，利用对应的引物进行菌落PCR验证(引物如表1所示)，筛选正确的转化子，挑选正确转化子送测，获得单拷贝菌株：EGAH01～EGAH04。接下来提取正确的大肠杆菌质粒，获得单拷贝质粒pK8FB-AlmA1、pK8FB-AlkM、pK8FB-LadA以及pK8FB-AlmA2。然后将重组质粒经NotI释放后进行凝胶电泳并回收正确片段。将回收后的片段分别转化入出发菌株解脂酵母ATCC 201249中，涂布到SC-Ura的固体培养基中，放置到30℃培养箱中培养2-3天(图2所示)。在4个固体平板中分别随机挑取24个单菌落，利用对应引物进行菌落PCR验证，筛选出烷烃羟化基因成功整合到基因组中的转化子并送测，获得长链烷烃羟化单拷贝表达酵母菌株：YAH01～YAH04。

表1.引物

将构建好的菌株YAH01～YAH04进行发酵，所用培养基为SC-葡萄糖+正十六烷(10g/L)，每隔24h取样测OD₆₀₀，96h后按烷烃萃取流程进行取样，计算正十六烷的消耗量，结果如图3所示。结果表达经过工程改造的菌株YAH01～04相较于野生型解脂耶式酵母Y具有更良好的生长状态，其中YAH01和YAH04经过96h生长OD₆₀₀可达6左右，是Y菌株OD₆₀₀的两倍(图3中的a)。对照菌株Y在发酵培养96h时，正十六烷降解率为45.00％，而改造后的工程菌株除YAH02外，均有明显提高，YAH01，YAH03和YAH04降解率分别为61.96％，66.35％和65.75％(图3中的b)。所以，在四株工程改造菌株中，YAH03的96h正十六烷的降解率最高，为66.35％。

2.外源烷烃羟化酶的优化表达

尽管已经在解脂耶氏酵母中成功构建了异源烷烃羟化强化通路，但是其降解烷烃能力仍然较低，降解能力最强的YAH03菌株96h正十六烷的降解率仅为66.35％，仅比对照菌株Y的降解率提高21％，因此我们从烷烃羟化模块着手对其进行优化，希望通过优化系列烷烃羟化酶的表达增强烷烃的降解效果。于是，本次研究选用带有高效人工启动子PHp4d的多拷贝载体PINA1269，该载体为整合型质粒，携带pBR322同源序列。首先利用BamHI/KpnI对多拷贝载体PINA1269(序列如SEQ ID NO.6所示)进行双酶切，回收得到线性载体PINA1269。再按照同样的方法，选择上节有明显降解效果的AlmA1、LadA和AlmA2基因，利用引物进行扩增PCR得带有同源臂的目的片段。将目的片段与线性化载体PINA1269同源重组，构建了新的烷烃羟化模块PHp4d-AlmA1-xpr2t、PHp4d-LadA-xpr2t以及PHp4d-AlmA2-xpr2t。连接产物转化大肠杆菌，以表1所列引物进行菌落PCR验证，挑选正确转化子送测，获得多拷贝烷烃羟化菌株EGAH05～EGAH07。提取大肠杆菌质粒，将重组质粒经NotI释放后进行凝胶电泳并回收片段。将目的片段分别转化出发菌株Y，涂布到SC-Leu的固体培养基中，放置到30℃培养箱中培养2-3天。在3个固体平板中分别随机挑取24个单菌落，利用对应引物进行菌落PCR验证，筛选条带正确转化子并送测，获得多拷贝酵母菌株YAH05～YAH07(如图4所示)。

YAH05～YAH07菌株液体培养96h，所用培养基为SC-葡萄糖+正十六烷(10g/L)，其降解正十六烷的情况如图5所示。采用新表达模块之后，多拷贝菌株YAH05、YAH06、YAH07的降烃效果相比于单拷贝菌株有了进一步提升，分别为65.13％、71.5％以及69.91％。即目前多拷贝表达LadA基因的YAH06菌株实现了正十六烷96h最高降解率71.50％，分别比单拷贝表达LadA基因的菌株YAH03和野生型Y的96h正十六烷降解率提高了约5％和26％。但是，现有的降解烷烃效果距离构建石油烃高效降解细胞工厂的目标依然有较大距离。

3.内源性NADPH-细胞色素还原酶和烷烃羟化酶的组合筛选

微生物中的细胞色素P450具有很大的应用潜力，因为他们可以作为生物催化剂，同时，他们也是微生物体内天然产物形成以及生物自我修复的关键因素。细胞色素P450与NADPH-细胞色素还原酶(CPR)偶联形成的系统能够催化复杂的反应，例如，区域选择性和立体选择性的氧化碳氢化合物上的C-H键，从而生成相应的羟基(COH)化合物。最近的一项研究表明，NADPH-细胞色素P450还原酶参与的电子传递是n-正烷烃羟基化中的限速步骤(图6)。

解脂耶氏酵母拥有十二个Alk基因，它们编码CYP52家族中的细胞色素P450(图6)。我们选取了对长链烷烃具有偏好性的Alk2和ω-末端显示出强氧化活性的Alk5和Alk7，将这三个P450基因分别与CPR共表达，组合筛选具有更高降解活性的菌株。构建过程如图7所示，以菌株ATCC 202149基因组为模板利用引物进行PCR扩增，分别获得带有PINA1269同源臂目的片段CPR和带有K8FB同源臂的目的片段Alk2、Alk5和Alk7。将目的片段通过同源重组的方法分别与线性化载体PINA1269和线性化载体K8FB进行组装，组装产物转化大肠杆菌，以表1所列引物进行菌落PCR验证，挑选条带正确的转化子送测，获得过表达菌株EGAH08～EGAH11。提取大肠杆菌质粒，将重组质粒经NotI释放后进行凝胶电泳并回收正确片段，CPR和P450基因两两组合转化入出发菌株Y中，分别涂布到SC-Ura-Leu的固体培养基中，随机挑取24个单菌落，利用对应引物进行菌落PCR验证，筛选条带正确转化子并送测，获得酵母菌株YAH09～YAH11。

YAH09～YAH11菌株液体培养96h，所用培养基为SC-葡萄糖+正十六烷(10g/L)，其降解正十六烷的情况如图8所示。结果表明，内源性羟化基因与CPR的组合可以促进解脂耶式酵母降解正十六烷，其中对C链长16有偏好性的Alk2基因与CPR的共表达实现96h正十六烷最高降解率63.81％，但是其降解效果不如过表达外源的烷烃羟化基因。

4.烷烃羟化酶活性的测定

为了研究解脂耶式酵母降解烷烃的能力，我们评估了参与其降解的主要酶之一，即烷烃羟化酶。烷烃羟化酶通过在烷烃末端的不同位点插入氧原子来启动烷烃的有氧降解。前期我们已经改造了一系列具有良好降烃功能的工程解脂酵母，我们选取了具有较高正十六烷降解率的菌株YAH06、YAH07以及出发菌株Y，在YPD培养基中进行96h发酵，对这三只菌株的细胞内烷烃羟化酶活性进行了不同时间段的比较检测，结果如图9中的a所示。结果表明解脂酵母烷烃羟化酶活性随着培养持续增加并在第三天达到峰值，随后酶活性下降。菌株YAH06和YAH07相较于Y表现出更加优异的烷烃羟化酶活性，此结果应该与在菌株中过表达外源烷烃羟化基因有关，即LadA和AlmA2基因过表达于解脂酵母可以明显提高菌株细胞内烷烃羟化酶活性，从而提高其降解烷烃的效率。烷烃羟化酶峰值活性在Y、YAH06以及YAH07中分别为0.44U/mg、0.65U/mg以及0.625U/mg(图9中的a)。其中YAH06菌株烷烃羟化酶活性是出发菌株Y的1.48倍。

研究表明，烷烃羟化酶的活性还受培养基中亲水底物存在的调节。因此，我们对于不添加葡萄糖对菌株YAH06中烷烃羟化酶活性的影响进行了研究。菌株YAH06在YPD减葡萄糖培养基中进行96h发酵，每隔24h取样检测细胞内烷烃羟化酶活性，结果如图9中的b所示。我们发现在不添加葡萄糖的情况下，YAH06在第1天实现最大的细胞内酶活性，即0.255U/mg，之后逐渐平稳下降并保持一定活性。实验结果表面葡萄糖的存在增强了整体细胞内烷烃羟化酶的活性。我们推测这是由于在葡萄糖分解为葡萄糖酸的过程中，辅助因子(NADH)再生系统的作用，葡萄糖底物不断为细胞内表达的烷烃羟化酶提供有效活性的NADH。

实施例2强化烷烃转运路径的解脂底盘的构建

1.烷烃转运蛋白的过表达

目前烷烃降解机制方面的研究除了烷烃进入细胞第一步的羟化过程，还集中在编码烷烃转运蛋白相关基因的研究上。蛋白质介导的小分子跨细胞质膜转运对于疏水或脂质化合物的输入和输出具有重要性。尽管膜转运蛋白参与了酵母中三分之一的重建代谢网络，但它们仍然被广泛忽视。在解脂耶氏酵母中，烷烃转运蛋白ABC1，类似于酵母多效耐药转运蛋白PDR5，被确定为烷烃吸收所必需。

因此我们将解脂酵母内源性烷烃转运蛋白(ABC1)过表达于野生型解脂酵母和工程酵母YAH06中，希望能进一步提高烷烃的降解效果。以菌株ATCC 202149基因组为模板进行利用表1所示引物进行PCR扩增，分别获得带有K8FB同源臂目的片段ABC1-1和带有PINA1269同源臂的目的片段ABC1-2。将两个目的片段通过同源重组的方法分别与线性化单拷贝载体K8FB和线性化多拷贝载体PINA1269进行组装，组装产物转化大肠杆菌，进行菌落PCR验证，挑选条带正确的转化子送测，获得过表达菌株EGAH11～EGAH12。提取大肠杆菌质粒，将重组质粒经NotI释放后进行凝胶电泳并回收正确片段，线性化载体PINA1269-ABC1转化入出发菌株Y中，回收后的目的片段片段Ku80up-pFBAin-ABC1-octt-Ku80dn转化入菌株YAH06，分别涂布到SC-Leu或SC-Ura-Leu的固体培养基中，放置到30℃培养箱中培养2-3天。随机挑取单菌落进行菌落PCR验证，筛选条带正确转化子并送测，获得酵母菌株YAH12和YAH13。

YAH12和YAH13菌株分别发酵培养96h，所用培养基为SC-葡萄糖+正十六烷(10g/L)，其生长和降解正十六烷的情况如图10所示。过表达解脂酵母内源基因ABC1的菌株YAH12和组合表达ABC1和LadA基因的YAH13生长状态差距不大(图10中的a)，工程菌株YAH12和YAH13均实现了提高烷烃降解效果的功能，96h烷烃降解率分别为65.04％和75.12％。在目前已改造菌株中，组合表达的YAH13的96h烷烃降解率最高，是出发菌株Y的1.67倍(图10中的b)。

2.细胞表面疏水性测定

生物细胞表面理化性质对微生物的生长代谢过程至关重要,在微生物领域有关表面理化性质的研究正在逐渐增加。微生物细胞表面理化性质主要包括疏水性和表面带电性等。细胞表面疏水性(Cell-surface hydrophobicity,CSH)是微生物细胞最重要的理化性质之一，是决定碳氢化合物与细胞表面粘附的主要因素。BATH测定用于测量选定菌株对正十六烷作为底物时细胞的表面疏水性，菌种的BATH百分比的范围为0％～100％,结果越大表示疏水性越好。因此我们探究在过表达烷烃转运蛋白的菌株中，酵母细胞的表面疏水性会有怎样的变化。出发菌株Y、YAH12以及YAH13在YPD培养基中发酵培养96h，每隔24h进行微生物疏水性测定，结果如图11所示。

结果表明，解脂耶式酵母的疏水性普遍随着时间先增大后减小,在24h达到最高疏水性，过表达烷烃转运蛋白ABC1的工程酵母YAH12和YAH13的疏水性比野生型高，其中YAH12在48h达到最高疏水性91.8％。说明过表达烷烃转运蛋白可以改变酵母细胞表面的疏水性，使其吸附摄取烷烃的效果更好。目前已经提出了三种可能的碳氢化合物吸收机制。在第一种机制中，微生物直接吸收溶解在水相中的烃。其次，微生物细胞吸收溶解或类似溶解且比细胞小得多的碳氢化合物颗粒。第三，微生物细胞直接与比细胞大的碳氢化合物接触，然后吸收碳氢化合物。由于石油烃类具有很强的疏水性，微生物群落可能通过第二种或第三种模式吸收石油烃类。而本研究中YAH12的BATH平均值为68.45％,疏水性属于中等偏上,因此YAH12更可能会以第3种模式摄取正十六烷(图11),即解脂酵母通过强化的烷烃转运蛋白来直接摄取烷烃，也可能会与比其小得多的被溶解、似溶解的烷烃颗粒作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 降解长链烷烃的酵母菌株及其应用

<130> MP22009192

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1131

<212> DNA

<213> 不动杆菌ADP1 (Acinetobacter sp. ADP1)

<400> 1

atgaaggttg atgtcatcat cggtgcaggt atctctggta ttggtgccgt ccattccaag 60

aactgtcgta agatcagaag atcaggtggt acttgggatc gttacggtat cagatccgac 120

tctgacatgt ctactggtaa caaatgggct aaggataagg ttgcttccgg tgccatcaag 180

ggttactctg acgtgatttc caacaaggac aaaatacacg gtcacagagt ttctgctaat 240

tacgattcca ccaagaagaa gtgggttatt gacaacaaca agaagaagac ctggtctgcc 300

aacgttatgg gttgcaccgg ttactacaac tacgacggtt acgctaagaa ggacaagggt 360

atccaccatt ggaacgacta cactggcaaa aaggttgtta ttattggttc cggtgctact 420

gctatcactg tttccatggt taagggtggt gctggtcatg ttaccatgag atccacttac 480

atcgccacca tctccatcga tatttacaag actcgtaaga tgtccactgc ttacaaaacc 540

agagctagaa acattggtat gcgtggtatc tacgctgcca agtacaagac cgtcagaaga 600

aagggcatta aaggtaaggt tgacatgaaa cacactagtt acaactggga cagatgtgtc 660

gtcgatggtg acaaggctag aggtgcttcc gttacagaca tcaagactgc taacggtatc 720

aagtctggta agcacgctga cattgtcatc tctgctaccg gtattatcgg tggtgttggt 780

tctatcgatg gtaagatgaa cacttcacac atgtacggtg tcatggtttc tgatgttaac 840

atggctatga ttattggtta cattaacgct tcttggacca aggttgacat tgctgctgat 900

tacatctgta gaatcaacca catggacaag aatggtgatg tcattgctca cgccgattct 960

agaaatgaca ctatcatggg taagatgtct tctggttata ttgccagagc tgccgacgtt 1020

atgaagggta aggcttggaa gatcaccaac aactatgccg acagaaaaaa agatgctaag 1080

aacgatggtg ttcacaagag aggtactgct aacagaaaga aggtcagcta a 1131

<210> 2

<211> 885

<212> DNA

<213> 不动杆菌 (Acinetobacter sp.)

<400> 2

atgaacgctg tccacgttga caacgtcatc aatgctgcca gatccatgag aatcgacaga 60

aagagatact ggatgatttc agctgttatc ggtattggca ttgctggtta ctctagaatc 120

aagaaaatcg ccggtggtat cgttcacatt atcatcgtca ttgatactat cattggtaaa 180

gatgcttcta acacttccat caagaatgac tactatgcta gagtcaaatc tatctacatt 240

gctaacgttt acgcttgtta cgtttccaga aagaagacca gtattgacaa gatcggtatc 300

tctatgggtg ctataaacgg tatcgccgtt aacaccgctc attctcacaa ggctgacaga 360

gatcacatct cccacgccgt cactggttac aaccacagaa tccactacgg tcaccacaag 420

cgtgccgcta ctgatgcctc ttccatgggt acttactgga gaaccgtcgg ttccaagtcc 480

gctatcatca ctcacagaaa gcgtaaaggt aagaagtggt ctaaggacaa cggttggggt 540

atgtctgctg ctcacagctc tattattgct attggtaagg gtactatcta cgtgactgct 600

tacggtattt ccatcatcaa ctatattcac tacggaaagc gtaagagagc tgatggtaac 660

tacagaacaa tgcactcttg gaacaataac aacattgtta ccaactacag acactctgac 720

catcacgctt acaccagagc tagacatgat gcttctggtt acgcctccat ggctatgatc 780

tggaagatga tggacaaaag agttcattat aaggatacca aggccaacat ctacaagaga 840

agagctaaga ttgccaaggg tactgataac atcaacggta agtaa 885

<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

<213> 嗜热脱氮土壤芽孢杆菌NG80-2(Geobacillus thermodenitrificans NG80-2)

<400> 3

atgaccaaga agatccacat caacgccttc gagatgaact gcgtgggcca catcgcccac 60

ggcctgtggc gacatcccga gaaccagcga caccgataca ccgacctcaa ctactggacc 120

gagctggccc agctgctgga gaagggcaag ttcgacgctc tgttcctcgc cgacgtcgtt 180

ggcatctacg acgtctaccg acagtcccga gacaccgccg tgcgagaggc tgtgcagatt 240

cccgtgaacg accccctgat gctgatctcc gctatggcct acgtcaccaa gcatctggcc 300

ttcgccgtca ccttctccac cacctacgag cacccctacg gccacgcccg acgaatgtcc 360

accctggacc acctgaccaa gggccgaatc gcctggaacg tcgtcacctc ccacctgcct 420

tccgccgaca agaacttcgg catcaagaag atcctcgagc acgatgagcg atacgacctg 480

gccgacgagt acctcgaggt ttgctacaag ctgtgggagg gttcctggga ggacaacgct 540

gtgattcgag acatcgagaa caacatctac accgacccct ccaaggtcca cgagatcaac 600

cactccggca agtacttcga ggtccccggc ccccacctgt gcgagccttc ccctcagcga 660

acccccgtca tctaccaggc cggcatgtcc gagcgaggcc gagagttcgc cgccaagcac 720

gctgagtgcg tcttcctggg tggcaaggac gttgagactc tgaagttttt tgttgacgac 780

atccgaaagc gagccaagaa gtacggccga aaccccgacc acatcaagat gttcgccggt 840

atctgcgtta tcgtcggcaa gacccacgac gaggccatgg agaagctgaa ctccttccag 900

aagtactggt ccctggaggg ccacctggcc cactacggtg gtggtactgg ctacgatctg 960

tccaagtact cgtctaacga ctacatcgga tctatctccg tcggcgagat cattaacaac 1020

atgtctaagc tggacggtaa gtggttcaag ctgtctgtgg gtactcccaa gaaggtcgcc 1080

gacgagatgc agtacctggt cgaggaggcc ggcattgatg gttttaacct ggtccagtac 1140

gtcagccctg gtactttcgt ggacttcatc gagctggtgg tccccgagct ccagaagcga 1200

ggactgtacc gagtcgatta cgaggagggt acttaccgag agaagctgtt tggcaagggc 1260

aactaccgac tgcccgatga ccacatcgcc gcccgatacc gaaacatctc ctccaacgtg 1320

taa 1323

<210> 4

<211> 1491

<212> DNA

<213> 不动杆菌 (Acinetobacter sp.)

<400> 4

atggagaagc aggtcgatgt cctgatcatc ggcgccggta tctccggtat cggcctggct 60

gttcacctgt ccaagaactg cccccagcga aagttcgaga tcctggagcg acgagactcc 120

tttggcggca cctgggacct gttccgatac cctggtatcc gatctgactc cgacatgtcc 180

acctttggct tcaacttcaa gccctgggcc aaggacaagg tcctggcttc tggagccgag 240

attaagggct acctgtctga cgtcatttct gagaaccagc tcaaggacaa gatccacttc 300

ggtcaccgag tcctctccgc caactacgac tccgctaaga agaagtgggc cgtcgagatc 360

gaggactcca acaagaagaa gcagacctgg tccgccaact tcgtgatggg ctgcaccggt 420

tactacaact acgaccaggg atacgccccc aagttcccca agcaggagga cttcaagggc 480

cagctgatcc acccccagca ctggcctgag aacctggact acaccggcaa gaaggtggtc 540

atcatcggct ccggagccac cgctatcacc ctggttcctt ccatggtcaa gggcggagcc 600

ggtcacgtta ccatgctcca gcgatccccc tcctacatcg ccaccatccc ttccatcgac 660

ttcatctacg agaagacccg aaagttcatg tctgaggaga ctgcctacaa gttcacccga 720

gcccgaaaca tcggcatgca gcgaggtatc tacgccctgg ctcagaagta ccccaagacc 780

gtccgacgac tgctgctgaa gggcatcgag ctgcagctga agggcaaggt cgatatgaag 840

cacttcaccc cctcctacaa cccctgggac cagcgactgt gcgtggttcc tgacggagac 900

ttgtttaagg ccctgcgaga gggccaggcc aacgttgaga ctgaccagat tgagaagttc 960

accgccaacg gcattcagct caagtccggc aagcacctgg aggctgacat cgtgatttcc 1020

gccaccggac tggagatcca gatcctggga ggtgtgaagg gaaccatcga cggcaagccc 1080

atggacacct cccagcacat gctgtaccag ggcgtgatgg tcagcgatgt tcccaacatg 1140

gccatgatca ttggctacat caacgcctcc tggaccctga aggtcgatat cgccgccgac 1200

tacatctgcc gactcctgaa ccacatggac aagaacggct acgacgaggt catcgcccac 1260

gctgaccctg ctctgcgaga gcaggacacc atcatgggaa agatgtcctc cggttacatc 1320

gcccgagccg ctgacgttat gcccaagcag ggtaagaagg ccccctggaa gattaccaac 1380

aactacctgg ccgaccgaaa ggagctgaag gacgcttcct ttaacgacgt ggtcctgcag 1440

tttcacaagc gaggcgagca ggtcgatcga aagcccaagc tcgtatccta a 1491

<210> 5

<211> 5315

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母ATCC 201249(Yarrowia lipolytica ATCC 201249)

<400> 5

atggcgcact actacccgtc gggcgtgtcg tcggtcggca acttcgactc gctagatgtc 60

gagatcagat cgctggccga gggaatggta cacaaacctc accatcgaga atcgcgatac 120

attttcgacc acacctttga cgacgagttt cgagaagagc atgaggacga atacgactat 180

gatatgctgc ggaagacgtc ttttgagaac cccgacgtca acccttacgt ggaggccagt 240

gcggagccgg agctggatcc ctggtcgggc gagttcaact cgcgaaagtg gatcaagacc 300

gtgctgggtc tcaaggagcg atttggaaac agtaagggaa tcacggccgg cgtgtcgttc 360

aagaacctgg gtgcctacgg gtacggcagt cgcagtgact accagaagac gtttctcaac 420

gtcattgtgg ccactggaga tttgctgcga agtgctattg gcgctaaacg gacaagcaaa 480

atccagattc tgcgcaagtg cgatggactg gtgcttccag gtgaaacctg tgtagttctg 540

ggacgtcccg gatcaggatg cactacattt ctcaagagta ttgcttgcga gacgtacgga 600

tttcatgtgg aggaagagac acaatggaac tatcagggtg agtatttggg attatggggc 660

tatgaggtta tgagggagat ggaaataccg gaatgaacat cttccaggtg gtctattctt 720

tcttgttggc cgttattttg tgtccacctg atttttttta tttttttatt ttttattttt 780

tatttttgtg tgttgcacac attccaatca gtgcagatca ctcccaacac ggccggtatc 840

taatacctag acccgaatag agtgttctgt acgcgataat cataccaggt gggaatcaga 900

acacaagaac aaagaaagca gatttccgcg gagcgcgaaa aacaataacc aataatgacc 960

ctactaacgc aggcgtacca cgagatgtca tgacaaagca ttgccgagga gaaattgtct 1020

acaatgctga acacgatatc catttccctc acttgacggt cggacagacc ctcatgtttg 1080

cggctctagc ccgaactccc cgaaaccgag tgctgggagt gacccgagag cagtatgctc 1140

gtcacacccg agatgttacc atggccactc tcggtctgtc tcacacaatc aacaccaagg 1200

ttggatccga tctagtgcgt ggagtctccg gtggagagag aaaacgagtc tctattgccg 1260

agtccgtcgt ctgcggagcg cctctacagt gctgggataa ctccactcga ggtctggatg 1320

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<211> 7076

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gtatagaatg gtacacttac caaaaagtgt tgatggttgt aactacgata tataaaactg 2700

ttgacgggat ccccgctgat atgcctaagg aacaatcaaa gaggaagatc ttccagtggt 2760

gcatgaacgc atgagaaagc ccccggaaga tcatcttccg ggggcttttt ttttggcgcg 2820

cgatacagac cggttcagac aggataaaga ggaacgcaga atgttagaca acacccgctt 2880

acgcatagct attcagaaat caggccgttt aagcgatgat tcacgagaat tgctggcccg 2940

ctgcggcata aaaattaatt tacacactca gcgcctgatt gcgatggcgg aaaacatgcc 3000

gattgatatc ctgcgcgtgc gtgatgatga cattccgggt ctggtaatgg atggcgtggt 3060

cgatctcggt attatcggcg aaaacgtgct ggaagaagag ctactcaacc gccgcgcaca 3120

gggcgaagat ccacgctatt taaccctgcg ccgtcttgac ttcggcggct gccgtttatc 3180

gctggcaaca ccggttgacg aagcctggga cggcccggcc gcgctggacg gtaaacgtat 3240

cgctacctca tatccgcacc tcctcaaacg ctacctcgac cagaaaggcg actcttttaa 3300

atcgtgtctg ttaaatggtt ctgtcgaagt cgcgccgcgc gcggggctgg ccgacgctat 3360

ctgcgatttg gactctaccg gcgcgacgct tgaagctaac ggcctgcgtg aagtcgaagt 3420

tatctaccgc tctaaagcct gtctgattca gcgcgacggt gagatggcac agagcaagca 3480

agagctgatc gataaattgc tgacccgtat tcagggcgtg attcaggcgc gcgaatcgaa 3540

atacatcatg atgcacgcgc caagtgaacg cctggaagag gttatcgccc tgctgccagg 3600

cgccgaaagg ccgacaattc tgccgctggc aggcgagcaa cagcgcgtgg cgatgcacat 3660

ggtcagcagc gaaacgttgt tctgggaaac catggagaaa ctgaaagcgc ttggcgccag 3720

ctcgattctg gtactgccga tcgagaagat gatggagtga tctgacgcct gatggcgctg 3780

cgcttatcag gcctacgtaa tgcgttgata ttttgggttc tgtaggccgg ataaggcgga 3840

accctgtgat ggagtaaaga ccatgagctt caataccctg attgactgga acagcggtgt 3900

gttctgtgga gcattctcac ttttggtaaa cgacattgct tcaagtgcag cggaatcaaa 3960

aagtataaag tgggcagcga gtatacctgt acagactgta ggcgataact caatccaatt 4020

accccccaca acatgactgg ccaaactgat ctcaagactt tattgaaatc agcaacaccg 4080

attctcaatg aaggcacata cttcttctgc aacattcact tgacgcctaa agttggtgag 4140

aaatggaccg acaagacata ttctgctatc cacggactgt tgcctgtgtc ggtggctaca 4200

atacgtgagt cagaagggct gacggtggtg gttcccaagg aaaaggtcga cgagtatctg 4260

tctgactcgt cattgccgcc tttggagtac gactccaact atgagtgtgc ttggatcact 4320

ttgacgatac attcttcgtt ggaggctgtg ggtctgacag ctgcgttttc ggcgcggttg 4380

gccgacaaca atatcagctg caacgtcatt gctggctttc atcatgatca catttttgtc 4440

ggcaaaggcg acgcccagag agccattgac gttctttcta atttggaccg atagccgtat 4500

agtccagtct atctataagt tcaactaact cgtaactatt accataacat atacttcact 4560

gccccagata aggttccgat aaaaagttct gcagactaaa tttatttcag tctcctcttc 4620

accaccaaaa tgccctccta cgaagctcga gctaacgtcc acaagtccgc ctttgccgct 4680

cgagtgctca agctcgtggc agccaagaaa accaacctgt gtgcttctct ggatgttacc 4740

accaccaagg agctcattga gcttgccgat aaggtcggac cttatgtgtg catgatcaag 4800

acccatatcg acatcattga cgacttcacc tacgccggca ctgtgctccc cctcaaggaa 4860

cttgctctta agcacggttt cttcctgttc gaggacagaa agttcgcaga tattggcaac 4920

actgtcaagc accagtacaa gaacggtgtc taccgaatcg ccgagtggtc cgatatcacc 4980

aacgcccacg gtgtacccgg aaccggaatc attgctggcc tgcgagctgg tgccgaggaa 5040

actgtctctg aacagaagaa ggaggatgtc tctgactacg agaactccca gtacaaggag 5100

ttcctggtcc cctctcccaa cgagaagctg gccagaggtc tgctcatgct ggccgagctg 5160

tcttgcaagg gctctctggc cactggcgag tactccaagc agaccattga gcttgcccga 5220

tccgaccccg agtttgtggt tggcttcatt gcccagaacc gacctaaggg cgactctgag 5280

gactggctta ttctgacccc cggggtgggt cttgacgaca agggtgacgc tctcggacag 5340

cagtaccgaa ctgttgagga tgtcatgtct accggaacgg atatcataat tgtcggccga 5400

ggtctgtacg gccagaaccg agatcctatt gaggaggcca agcgatacca gaaggctggc 5460

tgggaggctt accagaagat taactgttag aggttagact atggatatgt aatttaactg 5520

tgtatataga gagcgtgcaa gtatggagcg cttgttcagc ttgtatgatg gtcagacgac 5580

ctgtctgatc gagtatgtat gatactgcac aacctgtgta tccgcatgat ctgtccaatg 5640

gggcatgttg ttgtgtttct cgatacggag atgctgggta caagtagcta atacgattga 5700

actacttata cttatatgag gcttgaagaa agctgacttg tgtatgactt attctcaact 5760

acatccccag tcacaatacc accactgcac taccactaca ccgatcttcc agtggtgcat 5820

gaacgcatga gaaagccccc ggaagatcat cttccggggg cttttttttt ggcgcgcgat 5880

acagaccggt tcagacagga taaagaggaa cgcagaatgt tagacaacac ccgcttacgc 5940

atagctattc agaaatcagg ccgtttaagc gatgattcac gagaattgct ggcccgctgc 6000

ggcataaaaa ttaatttaca cactcagcgc ctgattgcga tggcggaaaa catgccgatt 6060

gatatcctgc gcgtgcgtga tgatgacatt ccgggtctgg taatggatgg cgtggtcgat 6120

ctcggtatta tcggcgaaaa cgtgctggaa gaagagctac tcaaccgccg cgcacagggc 6180

gaagatccac gctatttaac cctgcgccgt cttgacttcg gcggctgccg tttatcgctg 6240

gcaacaccgg ttgacgaagc ctgggacggc ccggccgcgc tggacggtaa acgtatcgct 6300

acctcatatc cgcacctcct caaacgctac ctcgaccaga aaggcgactc ttttaaatcg 6360

tgtctgttaa atggttctgt cgaagtcgcg ccgcgcgcgg ggctggccga cgctatctgc 6420

gatttggact ctaccggcgc gacgcttgaa gctaacggcc tgcgtgaagt cgaagttatc 6480

taccgctcta aagcctgtct gattcagcgc gacggtgaga tggcacagag caagcaagag 6540

ctgatcgata aattgctgac ccgtattcag ggcgtgattc aggcgcgcga atcgaaatac 6600

atcatgatgc acgcgccaag tgaacgcctg gaagaggtta tcgccctgct gccaggcgcc 6660

gaaaggccga caattctgcc gctggcaggc gagcaacagc gcgtggcgat gcacatggtc 6720

agcagcgaaa cgttgttctg ggaaaccatg gagaaactga aagcgcttgg cgccagctcg 6780

attctggtac tgccgatcga gaagatgatg gagtgatctg acgcctgatg gcgctgcgct 6840

tatcaggcct acgtaatgcg ttgatatttt gggttctgta ggccggataa ggcggaaccc 6900

tgtgatggag taaagaccat gagcttcaat accctgattg actggaacag cttaatatat 6960

atatacagta tatcgaaaac tcaccagaca aatgtttttg tcgtggatac atattggtga 7020

cagttaccgc aatcaaacat caaaataatt tatttcaaac tgcttactgc ttaagttcga 7080

acagtgggct cgtctcgacc aacaagctcc ttgaacttga ggtaggacac aacctcgttg 7140

atgatatcct cgaggtagtc ctgggcagac tcaccaaact tagaggggtc agactcatgt 7200

ttctcgacgt agagtcgaat agtggcgccg gaagaaccag ttccagacag tcggataaca 7260

aatcgagcgc cgttggtgaa cttgacgtac agaccctggt gggaagagac agagccgtcg 7320

agatcggtgt attcaaagtc accggcctcg gcaacctcaa gagagccaat cttggtaccg 7380

acaagagagt tgagcttgtc gttcagacct gcaaccacct tggcagcgcc ttcgctagac 7440

acgttctcat agtcgtatcg ggtaaagaag gttcgtccgt aagtcttcca gaagtcctcc 7500

tggatggcgg cgatggaagc cttcttgggg tcctcctttc cgacgccagc gatgatgttg 7560

agccaagcga tgactgccca ggcggccgcg gtgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 7620

tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 7680

gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 7740

ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 7800

ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 7860

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 7920

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 7980

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 8040

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 8100

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 8160

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 8220

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 8280

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 8340

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 8400

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 8460

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 8520

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 8580

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 8640

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 8700

ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaagc ccaatctgaa taatgttaca accaattaac 8760

caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 8820

attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 8880

gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 8940

aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 9000

agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc 9060

aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 9120

tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 9180

aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 9240

atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgtttttccg gggatcgcag tggtgagtaa 9300

ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 9360

cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 9420

tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaag cgatagattg tcgcacctga 9480

ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 9540

taatcgcggc ctcgacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg tattactgtt 9600

tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca 9660

tcagagattt tgagacacgg gccagagctg ca 9692

Claims (11)

1.核酸组合，其特征在于，包括：编码烷烃羟化酶的核酸和编码烷烃转运蛋白的核酸；

所述编码烷烃羟化酶的核酸包括如下I)～IV中的任意一种：

I)、AlmA1、LadA或AlmA2，其中，AlmA1的来源为Acinetobacter sp.ADP1；LadA的来源为Geobacillus thermodenitrificans NG80；AlmA2的来源为Acinetobacter sp.M-1；

II)、与如I)所示的核酸具有至少80％同源性且与I)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；

III)、如I)所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；

IV)、与如I)所示的核酸互补或部分互补的核酸；

所述编码烷烃转运蛋白的核酸包括如下i)～iv)中的任意一种：

i)、来源于解脂耶式酵母的烷烃转运蛋白ABC1；

ii)、与如i)所示的核酸具有至少80％同源性且与i)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；

iii)、如i)所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；

iv)、与如i)所示的核酸互补或部分互补的核酸。

2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，

AlmA1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

LadA的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；

AlmA2的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；

ABC1的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.表达单元，其特征在于，包括启动子和如权利要求1或2所述核酸中至少一个。

4.根据权利要求3所述的表达单元，其特征在于，所述启动子包括：PFBAin和/或PHp4d中的至少一个。

5.载体，其特征在于，包括载体骨架，和/或如权利要求1或2所述的核酸组合，和/或如权利要求3或4所述的表达单元。

6.菌株，其特征在于，包括如权利要求1或2所示的核酸组合，和/或如权利要求3或4所述的表达单元，和/或如权利要求5所述的载体。

7.根据权利要求6所述的菌株，其特征在于，出发菌株为解脂耶氏酵母。

8.权利要求6或7所述菌株构建方法，包括将如权利要求5所述的载体转化或转染入酵母菌株。

9.权利要求6或7所述的菌株在降解石油烃中的应用。

10.石油烃的降解方法，其特征在于，利用如权利要求6或7所述的菌株对石油烃进行降解。

11.根据权利要求7所述的降解方法，其特征在于，所述降解的基质中包含葡萄糖和正十六烷。

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