CN108779429A - 单加氧酶的功能性表达和使用方法 - Google Patents

单加氧酶的功能性表达和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了用于通过工程微生物氧化短链烷烃的方法和组合物，以及使用方法。

Description

单加氧酶的功能性表达和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求并享有于2015年11月18日提交的美国临时专利申请号62/257,061，2015年12月21日提交的美国临时专利申请号62/270,039，以及2016年4月11日提交的美国临时专利申请号62/320,725的优先权，每个临时申请通过引用其整体并入本文，包括任何附图，就如同它们是所提交原始申请的一部分。
本发明是在政府资助下完成的，其SBIR基金号为1520425，由国家科学基金会授予。政府对本发明享有一定权利。
背景介绍
生物酶是通常在环境温度和/或压力下能够促进化学反应的催化剂。一些化学反应由无机催化剂或某些酶进行催化，而其他化学反应可仅由其中的一种进行催化。对于工业用途，如果替代方法需要昂贵或能量密集的条件，如高温或高压，或者如果整个过程需与其他酶催化步骤整合，则酶是有利的催化剂。酶也可用来控制所需原材料或底物的范围和/或所形成产品的范围。
最近在合成生物学上的技术进步已证明了活细胞中的酶途径将有机分子转化为工业产品的能力和多功能性。目前生成这些工业产品的石油化工过程/方法可被这些生物技术方法取代，所述这些生物技术方法往往可以较低的成本和较低的环境影响提供相同的产品。可在遗传易处理的微生物中操作和设计的新途径和酶的发现将进一步推动合成生物学。
糖(包括单糖类、淀粉类、碳水化合物类和糖醇类)通常是用于生物发酵的原料。但作为严重限制发酵过程的经济可行性的原材料，糖具有相对较高的成本。尽管合成生物学可广泛生成数千种目前石油来源的产品，但由于糖的成本高昂，企业往往必须限制自己生成特定的小型化学品。
短链烷烃类，如甲烷和乙烷，与糖相比，原料价格便宜得多。鉴于天然气供应量巨大以及可再生甲烷生成技术的出现，短链烷烃类预计在未来几十年内仍将保持低价。因此，通过工程化微生物由短链烷烃如甲烷或乙烷制成的工业产品的制造成本比用糖制造的产品要便宜，并且应该会保持数十年。
能够将短链烷烃转化为工业产品的任何生物系统必须包括可活化所述烷烃的酶。天然存在的可活化甲烷的细菌使用分子氧将甲烷转化为甲醇。作为例子，能够进行所述反应的酶属于已知的可溶性二铁单加氧酶类。
但是，可溶性二铁单加氧酶已经很难在工业相关的宿主细胞中进行功能性表达。可溶性二铁单加氧酶在工业相关宿主中的成功功能性表达将是能够使廉价的甲烷或乙烷分别转化为甲醇或乙醇的系统中的关键第一步。甲醇或乙醇可作为工业产品本身进行分离或用作代谢中间体并通过细胞中的酶介导途径进一步转化为其他工业产品。
本发明提供的发明涉及在工业宿主中功能性表达有用的酶的能力。
发明概要
在第一个方面，本发明公开了可在目的微生物中表达的可溶性二铁单加氧酶的单加氧酶合成多核苷酸或其互补物，其包含编码可溶性二铁单加氧酶的至少一个单加氧酶编码区，所述至少一个单加氧酶编码区连接至至少一个启动子，所述启动子将在所述目的微生物中起作用。在一个实施方案，所述单加氧酶合成多核苷酸还包含编码至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白的至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白编码区，所述至少一个蛋白质伴侣蛋白编码区连接至至少一个启动子，所述启动子将在所述目的微生物中起作用。
实施方案提供了单加氧酶合成多核苷酸，所述单加氧酶合成多核苷酸包含合成多核苷酸，所述合成多核苷酸与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：91或SEQID NO：93或SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：147或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：153中所示核苷酸序列的任意一个或多个具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。实施方案提供了单加氧酶合成多核苷酸，所述单加氧酶合成多核苷酸包含合成多核苷酸，所述合成多核苷酸与SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：60中所示的核苷酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。进一步实施方案提供了单加氧酶合成多核苷酸，所述单加氧酶合成多核苷酸包含合成多核苷酸，所述合成多核苷酸与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：89或SEQID NO：91或SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：147或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：153中所示核苷酸序列的任意一个或多个的互补物具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。进一步实施方案提供了单加氧酶合成多核苷酸，所述单加氧酶合成多核苷酸包含合成多核苷酸，所述合成多核苷酸与SEQID NO：7和SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：60中所示的核苷酸序列的互补物具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。
本发明旨在包括本发明公开的单加氧酶，以及以任意组合和任意量的亚基/亚单位。
另一实施方案提供了单加氧酶合成多核苷酸，所述单加氧酶合成多核苷酸包含编码多肽的合成多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQID NO：14或SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114或SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：118或SEQ ID NO：144或SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148或SEQ ID NO：150或SEQ ID NO：152或SEQ ID NO：154所示氨基酸序列的任意一个或多个具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。另一实施方案提供了单加氧酶合成多核苷酸，所述单加氧酶合成多核苷酸包含编码多肽的合成多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO：8和SEQID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。另一实施方案提供了单加氧酶合成多核苷酸的互补物，所述单加氧酶合成多核苷酸包含编码多肽的合成多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO：8或SEQID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：98或SEQID NO：100或SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：106或SEQ ID NO：108或SEQ IDNO：110或SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114或SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：118或SEQ IDNO：144或SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148或SEQ ID NO：150或SEQ ID NO：152或SEQ IDNO：154所示氨基酸序列的任意一个或多个具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。另一实施方案提供了单加氧酶合成多核苷酸的互补物，所述单加氧酶合成多核苷酸包含编码多肽的合成多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：59和SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列类具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。
在第二个方面，本发明公开了可在目的微生物中表达的可溶性二铁单加氧酶的单加氧酶合成多核苷酸或其互补物，其包含编码可溶性二铁单加氧酶的至少一个单加氧酶编码区，所述至少一个单加氧酶编码区连接至至少一个启动子，所述启动子将在所述目的微生物中起作用，其中所述单加氧酶合成多核苷酸在SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：28或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：46中包含至少一个突变，其中所述至少一个突变分别与SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33或SEQID NO：34或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：46相比增加了对单加氧酶底物的特异性和/或增加了化学物质的生成量。在一个实施方案，所述单加氧酶合成多核苷酸在本发明公开的任一序列中包含至少一个突变，其中所述至少一个突变与其各自的野生型序列相比增加了对单加氧酶底物的特异性和/或增加了化学物质的生成量。在一个实施方案，所述至少一个突变包含一个或多个突变，所述一个或多个突变在是在SEQID NO：10中的位置61处的K置换为Y或S，位置240处的E置换为N和/或位置421处的S置换为A或T；在SEQ ID NO：12中的位置67处的L置换为M；在SEQ ID NO：14中的位置167处的P置换为T的一个或多个。
在一个实施方案，所述单加氧酶合成多核苷酸还包含编码至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白的至少一个辅助蛋白或蛋白质折叠伴侣蛋白编码区，所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白编码区连接至至少一个启动子，所述启动子将在所述目的微生物中起作用。
在第三个方面，本发明公开了可在目的微生物中表达的至少一个乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶的脱氢酶合成多核苷酸或其互补物，其包含编码乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶的至少一个乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶编码区，所述至少一个乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶编码区连接至至少一个启动子，所述启动子将在所述目的微生物中起作用。在一个实施方案，所述乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶是来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的mdh(SEQ ID NO：51)、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的mhpF(SEQ ID NO：53)或来自克鲁维氏梭菌(Clostridium kluyveri)的acdH(SEQ ID NO：55)中的至少一种、两种或全部。在一个实施方案，所述脱氢酶合成多核苷酸包含如SEQ ID NO：49所示的大肠杆菌adhE基因的位置267处的A突变为T和位置568处的E突变为K。
另一实施方案提供了脱氢酶合成多核苷酸，所述脱氢酶合成多核苷酸包含合成多核苷酸，所述合成多核苷酸与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：60所示的核苷酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。另一实施方案提供了脱氢酶合成多核苷酸，所述脱氢酶合成多核苷酸包含合成多核苷酸，所述合成多核苷酸与SEQ ID NO：48或SEQ IDNO：50或SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：54所示的核苷酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的互补性。
另一实施方案提供了脱氢酶合成多核苷酸，所述脱氢酶合成多核苷酸包含编码多肽的合成多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53或SEQ IDNO：55所示的氨基酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。另一实施方案提供了脱氢酶合成多核苷酸的互补物，所述脱氢酶合成多核苷酸包含与编码多肽的多核苷酸互补的合成多核苷酸，所述多肽与SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的互补性。
在一个实施方案，所述单加氧酶合成多核苷酸和/或脱氢酶合成多核苷酸是包含本发明所述序列中的任一个的合成多核苷酸。在一个实施方案，所述合成多核苷酸还包含至少一个启动子，所述至少一个启动子可操作地连接至本发明所述合成多核苷酸中的任何一个或多个。在一个实施方案，所述启动子是pBAD、pTrc、ptac、pLac、pT5和/或J23116中的至少一个。在一个实施方案，所述启动子是pADH1、pTEF1、pTEF2、pGAP和/或pGCW14中的至少一个。本发明公开的或本领域技术人员已知的任何启动子也应被认为是本申请公开内容的一部分。在一个实施方案，使用简并引物将随机突变引入所述启动子区域中。在一个实施方案，一种或多种终止子被整合到所述表达构建体中。
在一个实施方案，所述合成多核苷酸包含质粒pBZ13(SEQ ID NO：15)，pBZ15(SEQID NO：16)，pBZ21(SEQ ID NO：17)，pBZ23(SEQ ID NO：18)，pBZ4(SEQ ID NO：19)，pDG5(SEQID NO：21)，pDG6(SEQ ID NO：22)，pLC100(SEQ ID NO：23)，pLC12(SEQ ID NO：24)，pLC3725)，pLC39(SEQ ID NO：26)，pLC99(SEQ ID NO：27)，pNH100(SEQ ID NO：28)，pNH104(SEQ ID NO：29)，pNH132(SEQ ID NO：30)，pNH157 SEQ ID NO：31)，pNH158(SEQ ID NO：32)，pNH160(SEQ ID NO：33)，pNH166(SEQ ID NO：34)，pNH167(SEQ ID NO：35)，pNH172)，pNH173(SEQ ID NO：37)，pNH177(SEQ ID NO：38)，pNH178(SEQ ID NO：39)，pNH180(SEQ IDNO：40)，pNH181(SEQ ID NO：41)，pNH185(SEQ ID NO：42)，pNH187(SEQ ID NO：43)，pNH188(SEQ ID NO：44)，pNH225(SEQ ID NO：45)和/或pNH238(SEQ ID NO：46)中的一个或多个，或本发明公开的任何其他合成多核苷酸或合成多肽。
本发明旨在包括本发明所述序列的任何互补序列。本发明还旨在包括由本发明合成多核苷酸编码的任何多肽或合成多肽。在公开了本发明合成序列的情况下，本发明旨在包括与本发明所述序列具有同一性的任何序列。
本发明还提供了经工程化改造以功能性表达单加氧酶和/或脱氢酶的合成微生物，所述单加氧酶和/或脱氢酶将大范围的有机底物转化成更大范围的产物。本发明提供了经工程化改造以消耗含碳分子(如烷烃或其他分子，此类分子如甲烷或甲醇、乙烷或乙醇等)的合成微生物类。本发明还提供了经工程化改造以将甲烷和/或甲醇或乙烷和/或乙醇转化成多种工业产品的微生物。
在第四个方面，本发明公开了包含至少一种外源性合成多核苷酸的合成微生物，其中所述合成多核苷酸包含至少一种如上所述的合成多核苷酸。在一个实施方案，所述合成多肽是异源性的。所述微生物旨在包括原核细胞或真核细胞，如酵母和真菌，也旨在包括古细菌。在一个实施方案，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)，产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimiasucciniciproducens)，菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)，氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，土曲霉(Aspergillus terreus)，黑曲霉(Aspergillusniger)和产朊假丝酵母(Candida utilis)中的至少一种。在一个实施方案，所述微生物是大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中的至少一种。在一个实施方案，所述微生物是大肠杆菌。在实施例方案中，所述微生物是巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案，所述微生物是酿酒酵母。在一个实施方案，所述微生物是谷氨酸棒杆菌。在一个实施方案，所述微生物是甲醇芽孢杆菌。
在一个实施方案，所述合成微生物在作为唯一或主要碳源的单加氧酶底物、乙醇脱氢酶底物和/或乙醛脱氢酶底物上具有改善的生长或能够生长。在一个实施方案，所述底物是甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、2-甲基丙烷、2,3-二甲基戊烷、丙烯、丁-1-烯、顺式-丁-2-烯、反式-2-丁烯、环己烷、亚甲基环己烷、β-蒎烯、金刚烷、顺式-1,4-二甲基环己烷、顺式-1,3-二甲基环己烷、三氯乙烯、氯乙烯、1,1-二氯乙烯、三氟乙烯、氯三氟乙烯、三溴乙烯、苯、甲苯、乙苯、苯乙烯、吡啶、萘、联苯、2-羟基联苯、2-甲基联苯、2-氯联苯、2-溴联苯、2-碘联苯、氯甲烷、二氯甲烷、溴甲烷、硝基甲烷、甲硫醇、甲醇、乙醇、二乙醚、一氧化碳、环己烯、二甲醚、二氟甲烷、氟苯、氟甲烷、异戊烷、甲胺、甲基氰化物、硝基苯、苯丙氨酸或二甲苯中的至少一种。在一个实施方案，所述单加氧酶底物是甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或萘。在一个实施方案，所述底物是甲醇或乙醇。其他底物可在例如但不限于Vazquez-Duhalt and Quintero-Ramirez,Petroleum Biotechnology,2004；Green and Dalton,Substrate Specificity of Soluble Methane Monooxygenase,J.Biol.Chem.,Vol.264No.30,pp.17698-17703,1989；BRENDA在线数据库http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝1.14.13.25中获悉，其通过引用并入本文，包括任何附图。在一个实施方案，所述底物是乙烷。在一个实施方案，所述底物是乙烷，和所述至少一个突变增加了对乙烷的特异性。
在一个实施方案，所述合成微生物生成化学物质。在一个实施方案，所述化学物质是二羧酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、L-苹果酸、D-苹果酸、马来酸、乳酸、己二酸、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、丁二烯、脂肪酸衍生物类、脂肪醇类、脂肪酸类、脂肪酸酯类、脂肪酸甲酯类、脂肪酸乙酯类、支链脂肪酸类、支链脂肪酸衍生物类、ω-3脂肪酸类、类异戊二烯类、异戊二烯、法呢烯、法呢烷、角鲨烯、角鲨烷、类胡萝卜素类、任何或所有氨基酸类、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、乙醇、丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇(2-甲基丙-1-醇)、醇类、烷烃类、烷烯烃类、烯烃类、动物饲料添加剂类、氨基酸混合物类和蛋白类中的至少一种。化学物质的其他实例包括但不限于乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇类、脂肪酸酯类、乙酯类、蜡酯类；烃类和烷烃类如丙烷、辛烷、柴油、喷气推进剂8(JP8)；对苯二酸、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、丙烯酸酯、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、和所述这些物质的聚合物，以及其他聚合物类，如多元醇类、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚-β-羟基丁酸酯(PHB)、橡胶；商品化学物质如乳酸盐、二十二碳六烯酸(DHA)、3-羟基丙酸盐/酯、γ-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天冬氨酸盐、天冬氨酸、山梨糖醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、ω-3 DHA、番茄红素、衣康酸盐/酯、1,3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、3-羟基丙酸(HPA)、乳酸、THF、γ-丁内酯、吡咯烷酮类、羟基丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸；专用化学物质如类胡萝卜素类、类异戊二烯类、衣康酸；药物和医药中间体如7-氨基脱乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)/头孢菌素、红霉素、聚酮类、他汀类、紫杉醇、多西他赛、萜类、肽类、甾体类、ω脂肪酸类和其他此类合适的目的产物。此类产品在生物燃料、工业化学品和专用化学品方面是有用的，作为中间体用于制造其他产品，例如营养补充剂类、营养品类、聚合物类、石蜡替代品类、个人护理产品类和药品类。化学物质的其他实例包括但不限于，可采用本发明所述方法生成的所有化合物。此类化合物旨在包括可用本发明所述方法构建的所有分子，包括例如但不限于，可采用本发明所述方法制备的所有有机和无机分子。术语化学物质旨在包括天然和非天然化合物。天然分子的实例包括但不限于氨基酸类、核酸类、核苷酸类和多核苷酸类以及所有相关的生物分子类。非天然化合物包括但不限于氨基酸和核苷酸，所述氨基酸和核苷酸以不同于其在生物系统中通常修饰的方式进行修饰(例如但不限于非天然氨基酸)。在一个实施方案，所述化学物质是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或萘酚。在另一实施方案，所述化学物质是琥珀酸盐、苹果酸盐、脂肪酸类、赖氨酸和/或谷氨酸盐。在一个实施方案，所述化学物质是3-羟基丙酸酯或3-羟基丙酸酯的聚合物。
在一个实施方案，所述微生物包含大肠杆菌，和所述合成微生物是大肠杆菌，以及所述单加氧酶合成多核苷酸对可溶性二铁单加氧酶或其一个、一些或任何亚基编码。在一个实施方案，所述可溶性二铁单加氧酶包含甲烷单加氧酶或乙烷单加氧酶。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述合成多核苷酸转化的大肠杆菌，并且所述微生物与没有用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的微生物相比，在乙烷上具有改善的生长或消耗作为唯一碳源或作为主要碳源的乙烷。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述单加氧酶底物是乙烷和所述化学物质是乙醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述araBAD基因已经被删除，所述底物包含乙烷和所述化学物质包含乙醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述单加氧酶底物包含甲烷和所述化学物质包含甲醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述araBAD基因已经被删除，所述底物包含甲烷和所述化学物质包含甲醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述单加氧酶底物包含萘和所述化学物质包含1-萘酚。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述单加氧酶底物包含乙烷和所述化学物质包含脂肪酸。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述单加氧酶底物包含乙烷和所述化学物质包含琥珀酸。
在一个实施方案，所述微生物包含大肠杆菌，和所述合成微生物是大肠杆菌，和所述单加氧酶合成多核苷酸编码可溶性二铁单加氧酶，所述可溶性二铁单加氧酶编码多肽，所述多肽与SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列类具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。在一个实施方案，所述微生物包含大肠杆菌，和所述合成微生物是大肠杆菌，和所述单加氧酶合成多核苷酸编码可溶性二铁单加氧酶，所述可溶性二铁单加氧酶编码多肽，所述多肽具有如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列，和所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白具有如SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列。
在本发明公开的任何内容的一个实施方案中，所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白包含至少一个异源性groES和/或groEL。在一个实施方案，所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白包含至少一个蛋白，所述蛋白与SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：67或SEQ IDNO：69或SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：124或SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：128或SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：132或SEQ ID NO：134或SEQ ID NO：136或SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142所示氨基酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。在一个实施方案，所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白包含至少一个蛋白，所述蛋白与本发明公开的任何序列的氨基酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白包含至少两个蛋白质折叠伴侣蛋白。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白包含来自大肠杆菌、甲基暖菌属(Methylocaldum)175、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)或Solimonas aquatica DSM 25927中的至少一种的GroES和/或GroEL蛋白。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白包含大肠杆菌GroES和/或GroEL，和荚膜甲基球菌GroES和/或GroEL-2。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，蛋白质折叠伴侣蛋白各自选择性地、完全地或以特定组合进行共表达以提高单加氧酶的活性。在一个实施方案，蛋白质折叠伴侣蛋白各自选择性地、完全地或以特定组合进行过表达以提高单加氧酶的活性。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，所述可溶性二铁单加氧酶是甲烷单加氧酶或乙烷单加氧酶。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，所述单加氧酶是来自Solimonas aquatica DSM 25927、星状甲鞭毛虫(Methyloferula stellata)、甲基暖菌属175、荚膜甲基球菌、Methylocella silvestris和/或甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)中的至少一种的单加氧酶。在一个实施方案，所述单加氧酶是来自表16的任何一种或多种单加氧酶。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，单加氧酶(类)是各自选择性地、完全地或以特定组合进行选择和组合以提高总的单加氧酶活性。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，所述单加氧酶和/或蛋白质折叠伴侣蛋白是足以适于本发明内容的任何同源性蛋白，并且可以适于实施本发明的任何量和任何组合进行使用。
在一个实施方案，所述微生物包含大肠杆菌，所述合成微生物包含大肠杆菌，和所述脱氢酶合成多核苷酸编码乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶。在一个实施方案，所述乙醇脱氢酶和/或乙醛脱氢酶是来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的Mdh(SEQID NO：51)，来自大肠杆菌的MhpF(SEQ ID NO：53)或来自克鲁维氏梭菌(Clostridiumkluyveri)的AcdH(SEQ ID NO：55)中的至少一种、两种或全部。在一个实施方案，所述蛋白包含由SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的大肠杆菌adhE基因编码的蛋白的位置267处的A突变为T和位置568处的E突变为K。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述脱氢酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，并且所述微生物与没有用所述脱氢酶合成多核苷酸转化的微生物相比，在乙醇上具有改善的生长或消耗作为唯一碳源或作为主要碳源的乙醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述脱氢酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述底物是乙醇，和所述化学物质是脂肪酸。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述脱氢酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述araBAD基因已被删除，所述合成微生物已经用来自加州月桂(Umbellularia californica)的fatB1基因转化，所述底物包含乙醇，和所述化学物质包含脂肪酸。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述脱氢酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述底物是乙醇，和所述化学物质是琥珀酸。在优选实施方案，所述合成微生物包含已用所述脱氢酶合成多核苷酸转化的大肠杆菌，所述araBAD、iclR、和/或sdhAB基因已被删除和/或其表达已减少，所述底物包含乙醇，和所述化学物质包含琥珀酸。在本发明任何公开内容的一个实施方案中，脱氢酶(类)各自选择性地、完全地或以特定组合进行选择和组合以提高总的脱氢酶活性。
在本发明所述任何公开内容的一个实施方案中，所述微生物谷氨酸棒杆菌。在一个实施方案，所述微生物包含谷氨酸棒杆菌，所述合成微生物包含谷氨酸棒杆菌，以及所述单加氧酶合成多核苷酸编码可溶性二铁单加氧酶。在一个实施方案，所述可溶性二铁单加氧酶包含甲烷单加氧酶或乙烷单加氧酶。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用所述合成多核苷酸转化的谷氨酸棒杆菌，并且所述合成微生物与没有用所述单加氧酶合成多核苷酸转化的微生物相比，在在甲烷或乙烷上具有改善的生长或消耗作为唯一碳源或作为主要碳源的甲烷或乙烷。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的谷氨酸棒杆菌，所述单加氧酶底物包含乙烷，所述化学物质包含乙醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的谷氨酸棒杆菌，所述单加氧酶底物包含甲烷，所述化学物质包含甲醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的谷氨酸棒杆菌，所述单加氧酶底物包含萘，所述化学物质包含1-萘酚。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的谷氨酸棒杆菌，所述单加氧酶底物包含乙烷，和所述化学物质包含氨基酸，例如谷氨酸、赖氨酸或蛋氨酸。
在一个实施方案，所述微生物包含谷氨酸棒杆菌，所述合成微生物是谷氨酸棒杆菌，和所述单加氧酶合成多核苷酸编码可溶性二铁单加氧酶，所述可溶性二铁单加氧酶编码多肽，所述多肽与SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14和SEQID NO：59和SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。在一个实施方案，所述微生物包含谷氨酸棒杆菌，所述合成微生物是谷氨酸棒杆菌，和所述单加氧酶合成多核苷酸编码可溶性二铁单加氧酶，所述可溶性二铁单加氧酶编码多肽，所述多肽具有如SEQID NO：8和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列，和所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白具有如SEQ ID NO：63和SEQ IDNO：65和SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列。
在一个实施方案，合成多核苷酸编码选自由甲醇脱氢酶(EC1.1.1.244或1.1.99.37或1.1.2.7)，乙醇脱氢酶(EC1.1.1.1或1.1.1.2或1.1.2.8或1.1.3.13)，醛脱氢酶(EC1.2.1.3)，乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)，乙酰-CoA合成酶(EC6.2.1.1)，异柠檬酸裂解酶(EC4.1.3.1)，苹果酸合酶(EC2.3.3.9)，异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(EC 2.7.11.5，EC3.1.3)组成的组的酶。在一个实施方案，所述脱氢酶或酶可以是甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244或1.1.99.37或1.1.2.7)，醇脱氢酶(EC 1.1.1.1或1.1.1.2或1.1.2.8或1.1.3.13)，醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)，和/或乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)中的任何一种或多种。
在一个实施例方案，所述微生物包含巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案，所述合成微生物包含巴斯德毕赤酵母，和所述单加氧酶合成多核苷酸编码可溶性二铁单加氧酶。在一个实施方案，所述可溶性二铁单加氧酶包含甲烷单加氧酶、乙烷单加氧酶或甲苯-4-单加氧酶。在一个实施方案中，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的巴斯德毕赤酵母，并且与未用单加氧酶合成多核苷酸转化的微生物相比，所述合成微生物在甲烷、乙烷或萘上具有改善的生长或消耗作为唯一碳源或作为主要碳源的甲烷、乙烷或萘。在一个实施方案，所述合成微生物包含巴斯德毕赤酵母，其已用并入来自甲基孢囊菌属LW5和/或Solimonas aquatica的单加氧酶的单加氧酶合成多核苷酸，以及编码groES和groEL伴侣蛋白亚基的合成多核苷酸转化，所述单加氧酶底物包含甲烷，所述化学物质包含甲醇。在一个实施方案，有两种质粒参与巴斯德毕赤酵母转化。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的巴斯德毕赤酵母，所述单加氧酶底物包含乙烷，化学物质包含乙醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的巴斯德毕赤酵母，所述单加氧酶底物包含乙烷，所述化学物质包含苹果酸。在一个实施方案，所述合成微生物包含巴斯德毕赤酵母，其已经用编码PYC2、MDH3(ΔSKL)和MAE1基因的另外的合成多核苷酸转化，所述单加氧酶底物包含乙烷，所述化学物质包含苹果酸。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的巴斯德毕赤酵母，所述araBAD基因已被删除，所述底物包含甲烷，所述化学物质包含甲醇。在一个实施方案，所述合成微生物包含已用单加氧酶合成多核苷酸转化的巴斯德毕赤酵母，所述单加氧酶底物是萘，所述化学物质是1-萘酚。在一个实施方案，所述单加氧酶是来自门多萨假单胞菌KR1的甲苯-4-单加氧酶，所述单加氧酶底物包含萘，所述化学物质是1-萘酚。在本发明任何公开内容的一个实施方案中，所述单加氧酶和/或蛋白质折叠伴侣蛋白各自选择性地、完全地或以特定组合进行选择和组合以改善总的单加氧酶活性。在本发明所述的任何公开内容的一个实施方案中，所述单加氧酶和/或蛋白质折叠伴侣蛋白是足以适于本发明内容的任何同源性蛋白，并且可以适于实施本发明的任何量和任何组合进行使用。
在一个实施方案，所述微生物包含巴斯德毕赤酵母，所述合成微生物是巴斯德毕赤酵母，和所述单加氧酶合成多核苷酸编码可溶性二铁单加氧酶，所述可溶性二铁单加氧酶编码多肽，所述多肽与SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：146和SEQ ID NO：148和SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：154所示的氨基酸序列具有至少60％，优选约65％，优选约70％，优选约75％，优选约80％，优选约85％，优选约90％或优选约95％的同一性。在一个实施方案，所述微生物包含巴斯德毕赤酵母，所述合成微生物是巴斯德毕赤酵母，和所述单加氧酶合成多核苷酸编码可溶性二铁单加氧酶，所述可溶性二铁单加氧酶编码多肽，所述多肽具有如SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：146和SEQ ID NO：148和SEQ ID NO：150和SEQ IDNO：152和SEQ ID NO：154所示的氨基酸序列，和所述至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白具有如SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列。
在优选实施方案，本发明公开了包含本发明所述的任何一种合成多核苷酸的微生物。在一个实施方案，所述合成多核苷酸是单加氧酶合成多核苷酸和/或脱氢酶合成多核苷酸，其包含一种或多种质粒pBZ13(SEQ ID NO：15)，pBZ15(SEQ ID NO：16)，pBZ21(SEQ IDNO：17)，pBZ23(SEQ ID NO：18)，pBZ4(SEQ ID NO：19)，pDG5(SEQ ID NO：21)，pDG6(SEQ IDNO：22)，pLC100(SEQ ID NO：23)，pLC12(SEQ ID NO：24)，pLC37(SEQ ID NO：25)，pLC39(SEQID NO：26)，pLC99(SEQ ID NO：27)，pNH100(SEQ ID NO：28)，pNH104(SEQ ID NO：29)，pNH132(SEQ ID NO：30)，pNH157(SEQ ID NO：31)，pNH158(SEQ ID NO：32)，pNH160(SEQ IDNO：33)，pNH166(SEQ ID NO：34)，pNH167(SEQ ID NO：35)，pNH172(SEQ ID NO：36)，pNH173(SEQ ID NO：37)，pNH177(SEQ ID NO：38)，pNH178(SEQ ID NO：39)，pNH180(SEQ ID NO：40)，pNH181(SEQ ID NO：41)，pNH185(SEQ ID NO：42)，pNH187(SEQ ID NO：43)，pNH188(SEQID NO：44)，pNH225(SEQ ID NO：45)和/或pNH238(SEQ ID NO：46)中的一种或多种，或本发明公开的任何其他合成多核苷酸或合成多肽。在优选实施方案，所述微生物是已经用质粒pBZ15(SEQ ID NO：16)和pNH225(SEQ ID NO：45)转化的大肠杆菌。
在本发明提供的任何公开内容的一个实施方案中，所述微生物是甲醇芽孢杆菌。在本发明提供的任何公开内容的一个实施方案中，所述微生物是酿酒酵母。
本发明提供的任何实施方案可在单一培养物中进行或在共培养物中进行。在一个实施方案，甲烷同化途径被并入异源性宿主中。在一个实施方案，甲醇同化途径被并入异源性宿主中。
本发明的第四个方面涉及生成化学物质的方法，包括在合适的培养条件下培养本发明提供的任何合成微生物并保持足够的时间以生成所述所述化学物质。在一个实施方案，所述合适的培养条件包括培养基，所述培养基含有作为唯一碳源或作为主要碳源的甲烷、甲醇、乙烷、乙醇、丙烷、丁烷或萘中的至少一种。在一个实施方案，所述的合成微生物是在使所述合成微生物生成化学物质的条件下培养，所述化学物质由第二微生物或第二合成微生物转化为第二化学物质。
附图简要说明
图1示出了从乙烷至乙酰辅酶A的两种代表性途径。已知许多酶或酶类可催化所述这些反应步骤中的每一步。根据特定菌株中存在的确切酶，所述途径可通过乙酸或仅直接从乙醛进行至乙酰-CoA。乙酰-CoA是中枢代谢的主要节点，从其构建了其他关键代谢物。
图2示出了三种菌株中生成的乙醇量的比较：LC165(对照)，BZ11(将乙烷转化为乙醇的可诱导sMMO)和LC168(将乙烷转化为乙醇的可诱导sMMO)。
图3显示了由甲烷原料生成甲醇的量。大肠杆菌菌株BZ11和LC168各自表达功能性单加氧酶。
图4示出了LC160(将甲烷转化为甲醇的可诱导sMMO)中生成的甲醇量。大肠杆菌菌株LC160表达功能性单加氧酶和大肠杆菌groES和groEL基因的过表达。
图5示出了由乙烷原料生成乙醇的改善量。大肠杆菌菌株LC160表达功能性单加氧酶和大肠杆菌groES和groEL基因的过表达。
图6示出了由萘原料生成1-萘酚的量。大肠杆菌菌株LC151和LC168各自表达功能性单加氧酶。通过加入萘酚敏感染料并随后测定540 nm处的光学吸光度来测定1-萘酚的浓度。将对照菌株(不存在任何单加氧酶)的吸光度值减去基线值。
图7示出了NH566在乙烷原料上的生长。将菌株NH566密封在两个血清瓶中，其中一个注入空气，另一个注入乙烷。此图示出了注射后培养物密度随时间的变化，其表明注入乙烷的瓶子的培养物密度增加，注入空气的瓶子的培养物密度降低。
图8示出了由13C标记的乙烷原料生成的13C标记的琥珀酸。将菌株NH606密封在两个血清瓶中，其中一个注入空气，另一个用13C标记的乙烷注入。(a)的曲线图示出了两个瓶子之间检测到的13C-琥珀酸的差异。(b)中的峰是从说明书中其他地方所述的LC/MS/MS方法检测13C-琥珀酸峰的结果。
图9示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pBZ13(SEQ ID NO：15)的编码区。所述质粒能够表达两组分子伴侣蛋白，即来自大肠杆菌和荚膜甲基球菌(M.capsulatus，Bath)的groES/groEL。
图10示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pDG6(SEQ ID NO：22)的编码区。所述质粒能够表达与pBAD启动子连接的荚膜甲基球菌(Bath)sMMO基因mmoXYBZCD。pDG5(SEQ IDNO：21)的质粒图谱与在MMO操纵子的3'末端单独添加荚膜甲基球菌(Bath)mmoG基因几乎相同。
图11示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pLC99(SEQ ID NO：27)的编码区。所述质粒能够在大肠杆菌中表达乙醇同化途径。pLC100(SEQ ID NO：23)的质粒图谱几乎相同，因为唯一的变化是核糖体结合位点周围的核苷酸到两个乙醇同化基因的5'侧。
图12示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pNH014(SEQ ID NO：57)的编码区。所述质粒能够在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达3基因苹果酸生成途径。
图13示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pNH160(SEQ ID NO：33)的编码区。所述质粒能够表达来自大肠杆菌中的Solimonas aquatica的可溶性二铁单加氧酶。质粒pNH157(SEQ ID NO：31)，pNH158(SEQ ID NO：32)和pNH100(SEQ ID NO：28)几乎相同，除了置换S.aquatica单加氧酶的编码序列，所述S.aquatica单加氧酶分别用甲基暖菌属175(Methylocaldum sp.175)，星状甲鞭毛虫(Methyloferula stellata)和假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)TY7单加氧酶替换。
图14示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pNH166(SEQ ID NO：34)的编码区。所述质粒能够表达来自不同启动子的甲基孢囊菌甲烷单加氧酶mmoX、mmoY、mmoZ和mmoC的四个亚基，以在巴斯德毕赤酵母中表达。所述质粒可用BsaI酶进行限制性消化，以生成用于整合到染色体中的线性片段。质粒pNH167(SEQ ID NO：35)几乎相同，除了置换衍生自Solimonas aquatica的MMO亚基的编码序列。
图15示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pNH172(SEQ ID NO：36)的编码区。所述质粒能够表达甲基孢囊菌甲烷单加氧酶mmoB和mmoD的两个亚基，以及来自不同启动子的甲基胞囊菌伴侣蛋白groES和groEL，以在巴斯德毕赤酵母中表达。所述质粒可用BsaI酶进行限制性消化，以生成用于整合到染色体中的线性片段。质粒pNH173(SEQ ID NO：37)几乎相同，除了置换衍生自Solimonas aquatica的MMO亚基和伴侣蛋白的编码序列。
图16示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pNH180(SEQ ID NO：40)的编码区。所述质粒能够表达荚膜甲基球菌(Bath)伴侣蛋白groES和groEL-2，以在大肠杆菌中表达。质粒pNH177(SEQ ID NO：38)、pNH178(SEQ ID NO：39)、pNH181(SEQ ID NO：41)、pNH185(SEQID NO：42)、pNH187(SEQ ID NO：43)和pNH188(SEQ ID NO：44)几乎与质粒pNH180相同，除了置换分别衍生自自养无枝酸菌(Pseudonocardia autotrophica)、butanivora陶厄氏菌、甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)、甲基暖菌属175(Methylocaldum sp.175)、甲基孢囊菌属(Methylocystis sp.)LW5和Solimonas aquatica的groES和groEL基因的编码序列。
图17示出了代表性质粒图谱，其示出了质粒pNH238(SEQ ID NO：46)的编码区。所述质粒能够表达荚膜甲基球菌(Bath)sMMO亚基和groES/groEL-2基因，以及大肠杆菌groES/groEL伴侣基因，以在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)和其他革兰氏阳性菌中表达。质粒pBZ21(SEQ ID NO：17)几乎相同，除了含有谷氨酸棒杆菌复制起点和KanR盒的片段。
图18示出了三种单加氧酶亚基之间的多序列比对：丙烷单加氧酶的prm1a亚基(在pNH100(SEQ ID NO：28)中，来自假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)TY-7)，乙烷单加氧酶的mmoX亚基(在pNH160(SEQ ID NO：33)中，来自Solimonas aquatica)和甲烷单加氧酶的mmoX亚基(在pDG5(SEQ ID NO：21)中，来自荚膜甲基球菌(Bath))。序列下方的星号表示三个序列具有严格保守的氨基酸残基的位置。
发明详述
本发明提供了合成的多肽和蛋白质。本发明还提供了经工程化以功能性表达单加氧酶的微生物，所述单加氧酶可将多种有机底物转化为甚至更宽范围的产物。本发明还提供了经工程化以消耗含有碳例如烷烃或分子如甲烷或甲醇、乙烷或乙醇的分子的微生物。本发明还提供了经工程化以将甲烷和/或甲醇或乙烷和/或乙醇转化为工业产品的微生物。
本发明还提供了包含使用所述微生物来生成化学物质的组合物和方法。与现有的耗糖发酵相比，所述方法提供了优异的低成本生成。
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。从业者可特别关注(M R Green and J Sambrook,eds,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2012)，(F M Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology(Supplement99),John Wiley&Sons,NewYork,2012)，和(Bornscheuer,U.andR.J.Kazlauskas,CurrProtoc Protein Sci,2011)。标准方法也出现在(Bindereif,Schòn,&Westhof,Handbookof RNA Biochemistry,Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2005)中，其描述了RNA操作和分析的详细方法，以及(S L Beaucage et al.,Curr Protoc Nucleic Acid Chem,2009)和(AYKeel et al.,Methods Enzymol469:3-25,2009)，其描述了RNA的化学合成和纯化方法，其均通过引用并入本文。用于生成核酸的合适分子技术的实例和足以指导技术人员通过许多克隆实践的说明可在(MR Green et al.,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Volume 152 Academic Press,Inc.,SanDiego,CA,1987)；和(PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,San Diego,CA,1990)中获悉，其均通过引用并入本文。
本发明使用的术语“辅助蛋白”和“帮助蛋白”旨在表示蛋白，所述蛋白能够实现单独酶、酶的集合、由多于一种蛋白制成的酶复合物或非酶蛋白的功能。辅助蛋白或帮助蛋白功能的一个实例是已知有助于折叠其他蛋白质的蛋白(所谓的“蛋白质折叠伴侣蛋白”或“伴侣蛋白”)。另一个实例是修饰另一种蛋白质的蛋白，包括翻译后修饰，如乙酰化、甲基化、酰化、法尼基化等，以及脱乙酰化、脱甲基化等反向反应，以及去除蛋白的一部分。其他实例是帮助酶或酶复合物正确组装辅基，或加载金属中心，或使酶或复合物能够定位到细胞中适当的物理位置，或使电子或其他化学基团转移至酶的蛋白。在某些情况下，辅助蛋白能够发挥酶的功能，即使尚未知晓确切的作用机制。
本发明使用的术语“生物质/生物量”旨在表示由细胞组成的生物物质的集合，其在适合培养物中生物体生长的条件下由微生物的培养过程产生的。在一些情况下，所述生物质仅包括细胞及其内容物，并在一些情况下，所述生物质还包括在细胞膜边界外分泌到培养物中的任何大分子，例如蛋白质。
本发明使用的术语“碳源”旨在表示输入到工业过程的原料，所述工业过程包含可被培养物中的微生物利用的碳原子。譬如，微生物的工业培养物可使用葡萄糖作为碳原子的来源。如本发明所提供的，除了典型的碳源如糖和氨基酸之外，所述碳源还可以是甲烷、甲醇、乙烷、乙醇或表1的A栏中所示的任何化合物。在一些情况下，培养物在含有单一可用化合物的培养基中生长，所述单一可用化合物含有碳原子。由于碳是生命必需的元素，在此实例中，所述培养物必须具有将含有碳原子的单一化合物转化为生物体存活所必需的许多其他生物分子的代谢途径。
本发明使用的“唯一碳源”旨在表示包含培养基的合适条件，所述培养基含有作为碳源的甲烷、甲醇、乙烷、乙醇或表1的A栏中所示的任何化合物，使得其作为培养基中总可用碳原子的一部分，以上引用的那些化合物分别代表培养基中总可用碳原子的约100％。
本发明使用的“主要碳源”旨在表示包含培养基的合适条件，所述培养基含有作为碳源的甲烷、甲醇、乙烷或乙醇、或表1的A栏中所示的任何化合物作为所述培养基中总碳原子的一部分，以上引用的那些化合物分别代表所述培养基中总可用碳原子的至少约10％或更多，所述培养基中总可用碳原子的约20％或更多，所述培养基中总可用碳原子的约30％或更多，所述培养基中总可用碳原子的约40％或更多，所述培养基中总可用碳原子的约50％或更多，所述培养基中总可用碳原子的约60％或更多，所述培养基中总可用碳原子的至少约70％或更多，所述培养基中总可用碳原子的至少约80％或更多，所述培养基中总可用碳原子的至少约90％或更多。
本发明使用的术语“化学物质/化学品”广义上是指包括在涉及原子或分子变化的反应中或由其产生的任何物质，尤其是根据本发明所述的任何方法衍生的物质。因此，化学物质旨在表示通过化学过程/方法获得的物质或具有化学作用的物质。列入本发明考虑的化学物质的实例有但不限于，二羧酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、L-苹果酸、D-苹果酸、马来酸、乳酸、己二酸、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、丁二烯、脂肪酸衍生物类、脂肪醇类、脂肪酸类、脂肪酸酯类、脂肪酸甲酯类、脂肪酸乙酯类、支链脂肪酸类、支链脂肪酸衍生物类、ω-3脂肪酸类、类异戊二烯类、异戊二烯、法呢烯、法呢烷、角鲨烯、角鲨烷、类胡萝卜素类、任何或所有氨基酸类、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、乙醇、丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇(2-甲基丙-1-醇)、醇类、烷烃类、烷烯烃类、烯烃类、动物饲料添加剂类、氨基酸混合物类、和蛋白类。化学物质的其他实例包括但不限于，乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇类、脂肪酸酯类、乙酯类、蜡酯类；烃类和烷烃类如丙烷、辛烷、柴油、喷气发动机燃料(JetPropellant 8，JP8)；对苯二甲酸酯、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、丙烯酸酯、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、多元醇类、聚羟基链烷酸酯类(PHA)、聚-β-羟基丁酸酯(PHB)、橡胶和由对苯二甲酸酯制成的聚合物类、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、丙烯酸酯、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺；通用化学物质，如乳酸盐、二十二碳六烯酸(DHA)、3-羟基丙酸盐/酯、γ-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天冬氨酸盐、天冬氨酸、山梨糖醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸，异戊烯醇、羊毛甾醇、ω-3 DHA、番茄红素、衣康酸盐、1,3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、3-羟基丙酸(HPA)、乳酸、THF、γ-丁内酯、吡咯烷酮类、羟基丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸酸；特种化学物质，如类胡萝卜素类、类异戊二烯类、衣康酸；药物和医药中间体如7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA/头孢菌素、红霉素、聚酮化合物类、他汀类、紫杉醇、多西紫杉醇、萜烯类、肽类、类固醇类、ω脂肪酸类和其他此类合适的目的产物。此类产品可用于生物燃料、工业和特种化学品，作为用于制备其他产品(例如营养补充剂类、营养品类、聚合物类、石蜡替代品类、个人护理产品类和药品类)的中间体。化学物质的其他实例包括但不限于，可用本发明所述方法生成的所有化合物。此类化合物旨在包括可用本发明所述方法构建的所有分子，包括例如但不限于，可用本发明所述方法制备的所有有机和无机分子。术语化学物质旨在包括天然和非天然化合物。天然分子的实例包括但不限于，氨基酸类、核酸类、核苷酸类和多核苷酸类以及所有相关的生物分子。非天然化合物包括但不限于，以与生物系统中通常修饰的方式不同的方式进行修饰的氨基酸类和核苷酸类，以及通常不存在于自然界中的化合物类。
本发明使用的术语“编码区”或“编码序列”旨在表示DNA或RNA，所述DNA或RNA使用遗传密码来编码例如但不限于多肽类(即蛋白类)的区域。编码区通常在5'末端由起始密码子限定，并在3'末端附近具有终止密码子。起始密码子和终止密码子必须分别位于编码区的起始和末端处。
本发明使用的术语“培养”旨在表示在实验室或工业条件下微生物的生长或维持。微生物的所述培养是微生物学领域的标准实践。可使用液体或固体培养基作为微生物的营养源来培养微生物。此外，一些微生物可在限定的培养基中培养，其中通过使用纯化的化学组分制备生成液体或固体培养基。可调节培养基的组成以适应所述培养物的微生物或工业目的。
本发明使用的术语“内源性多核苷酸”是指衍生自给定生物体中天然存在的多核苷酸的多核苷酸。术语“内源性/内源”是指存在于宿主中的参考分子或活性。类似地，当所述术语用于指编码核酸或多核苷酸的表达时，所述术语是指微生物有机体内包含的编码核酸或多核苷酸的表达。
本发明使用的术语“外源性多核苷酸”旨在表示不衍生自给定生物体中的天然存在的多核苷酸的多核苷酸。外源性多核苷酸可衍生自存在于不同生物体中的多核苷酸。可通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，例如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质如质粒，而将外源性多核苷酸引入所述生物体中。因此，当用于指编码核酸的表达时，所述术语是指将所述编码核酸以可表达的形式引入微生物中。当用于指生物合成活性时，所述术语是指引入宿主参考生物体中的活性。来源可以是，例如，同源性或异源性编码核酸，其在引入所述宿主微生物之后表达所述参考活性。术语“异源性/异源”是指衍生自除参考物种之外的来源的分子或活性，而“同源性/同源”是指衍生自所述宿主微生物的分子或活性。因此，本发明所述编码核酸的外源性表达可利用异源性或同源性编码核酸中的任一种或两种。如本发明所述，核酸不需要在单一聚合物上包括其所有相关或甚至完整的编码区，并且本发明提供的发明预期在不同聚合物上具有完整或部分编码区。
本发明使用的术语“酶”旨在表示加速或催化化学反应的分子。细胞中几乎所有代谢过程均需要酶，以便以足够快的速度发生而维持生命。可用于本发明的一些酶有，但不限于，甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244或1.1.99.37或1.1.2.7)，醇脱氢酶(EC 1.1.1.1或1.1.1.2或1.1.2.8或1.1.3.13)，醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)，乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)，乙酰辅酶A合成酶(EC 6.2.1.1)，异柠檬酸裂解酶(EC 4.1.3.1)，苹果酸合成酶(EC 2.3.3.9)，异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(EC 3.1.3.-)，可溶性甲烷单加氧酶(EC 1.14.13.25)和颗粒型甲烷单加氧酶(EC 1.14.18.3)。
本发明使用的术语“酶特异性”或“酶的特异性”旨在表示酶能够在多于一种底物分子上催化化学反应的程度。可在一个分子底物上催化反应但不能在任何其他底物上催化反应的酶被认为对其底物具有非常高的特异性。可催化许多底物上的化学反应的酶被认为具有低特异性。在一些情况下，相对于一种或多种确定的底物来描述酶的特异性。关于本发明所述的发明，通过比较单加氧酶对甲烷的相对活性与其相对于其他底物例如乙烷的相对活性，可将单加氧酶对甲烷(作为底物)的特异性与另一种单加氧酶对甲烷的特异性进行比较。在一些情况下，单加氧酶的突变可使酶特异性从优选甲烷(即甲烷比乙烷具有更高活性)转变为优选乙烷(即乙烷比甲烷具有更高活性)。
本发明使用的术语“乙醇消耗生物体”、“乙基营养物/菌”、“乙基营养微生物”、“乙基营养生物体”和“乙基营养型”旨在表示能够将乙醇(即“乙基醇”，CH3OH)转化为化学物质或转化为生物质或转化为生物体可在其代谢途径中使用的分子的任何生物体，所述代谢途径产生能量或减少当量，使得生物体可使用乙醇作为唯一碳源或主要碳源和/或能源进行生长。譬如，已知一些天然存在的微生物通过首先将乙醇转化为乙醛，然后随后将乙醛转化为乙酸来消耗乙醇。乙酸通常转化为乙酰辅酶A，这是所有生物体共有的代谢中心节点。一些微生物可在一步中将乙醛直接转化为乙酰-CoA。使生物体同化乙醇进入代谢的其他途径也是可能的，并且此实例并不意味着将本发明限制于上述同化途径。
本发明使用的术语“乙烷营养物/菌”、“乙烷消耗生物体”、“乙烷营养生物体”、“乙烷营养微生物”和“乙烷营养型”旨在表示可消耗作为其主要碳源和/或作为其唯一能源和/或唯一碳源的乙烷的微生物。相反，“非乙烷营养微生物”是不能在作为唯一碳源或主要碳源的乙烷上存活的微生物。
本发明使用的术语“甲烷氧化菌/甲烷营养菌”旨在表示能够使用甲烷作为唯一或主要碳源进行生长的生物体。
本发明使用的术语“合成的乙基营养物”旨在表示已被修饰为能够消耗作为其唯一能源和/或唯一碳源和/或主要碳源的乙醇的非乙醇消耗微生物。一些乙基营养物是天然存在的，而本发明中描述的其他乙基营养物是合成的。由于添加了使乙醇同化的途径，所述合成的乙基营养物是能够在作为唯一碳源或主要碳源的乙醇上存活的生物体。修饰可以是遗传修饰，例如微生物核酸的一个或多个突变、游离质粒的引入、和/或外源性多核苷酸的引入。
本发明使用的术语“合成的乙烷营养物”旨在表示已被修饰为能够消耗作为其唯一能源和/或唯一碳源和/或主要碳源的乙烷的非乙烷消耗微生物。一些乙烷营养物是天然存在的，而本发明所述的其他乙烷营养物是合成的。由于添加了使乙烷同化的途径，所述合成的乙烷营养物是能够在作为唯一碳源或主要碳源的乙烷上存活的生物体。修饰可以是遗传修饰，例如微生物核酸的一个或多个突变、游离质粒的引入、和/或外源性多核苷酸的引入。
本发明使用的术语“乙醇同化途径”和“乙醇利用途径”旨在表示至少一种酶，或一组酶，其使得生物体能够将乙醇转化为生物体可将其用作质量(碳、氧和氢原子)来源和能量的代谢物。
本发明使用的术语“改善/改进生长”旨在表示通常通过遗传修饰以某种方式修饰微生物菌株的情况，使得在规定的条件下并且相对于原始菌株，所述修饰的菌株以更快的速率生长或达到更高的细胞密度。通过在相同条件下使菌株生长并测定细胞生长中不同时间点的光密度(例如600nm处的吸光度，“OD600”)或倍增速率，可直接比较两种菌株。如果一种菌株在数量上更快地生长(即更频繁地倍增)或者可测定地更高的细胞密度，那么相对于另一种菌株，此种菌株将表现出改善生长。在每个时间点的定量测定，例如两个菌株的OD600值的比率或倍增速率的比率，可用于鉴定和跟踪具有改善生长的菌株。
本发明使用的术语“微生物体”、“微生物有机体”和“微生物”旨在表示作为微观细胞存在的任何生物，所述微观细胞包括在古细菌、细菌或真核生物的结构域内。因此，所述术语旨在包括原核或真核细胞或具有微观尺寸的生物体，并包括所有物种的细菌、古细菌和真细菌，以及真核微生物如酵母和真菌。所述术语还包括可培养用于生成生物化学物质的任何物种的细胞培养物。
本发明使用的术语“突变”旨在表示DNA序列或多核苷酸中从一种核苷酸改变为另一种核苷酸或蛋白序列或多肽中从一种氨基酸改变为另一种氨基酸。
本发明使用的术语“天然存在的”旨在表示通常在自然界中发现存在的。
当用于关联本发明的微生物有机体或微生物时，本发明使用的术语“非天然存在的”旨在表示所述微生物具有至少一种遗传改变或添加，所述这些遗传改变或添加通常不在参考物种的天然存在的菌株中发现，包括参考物种的野生型菌株。遗传改变包括，譬如，引入编码代谢多肽的可表达核酸、其他核酸添加、核酸缺失、和/或微生物遗传物质的其他功能性破坏的修饰。此类修饰包括，譬如，编码区和其功能片段，用于所参考物种的异源性、同源性、或异源和同源性多肽。其他修饰包括，譬如，非编码调节区，其中所述修饰改变基因或操纵子的表达。示例性代谢多肽包括能够氧化烃类的酶，例如甲醇消耗或甲烷消耗途径中的烷烃类和芳族类化合物或酶类，或乙醇消耗或乙烷消耗途径中的酶类。
本发明使用的术语“单细胞蛋白”旨在表示从纯的或混合的微生物培养物中提取的混合蛋白的来源。单细胞蛋白用作人和动物饲料中富含蛋白的食物的替代品。
本发明使用的术语“可溶性二铁单加氧酶”旨在表示一类酶和酶复合物，其特征在于具有两个铁原子的催化核和利用分子氧(O2)催化碳氢化合物键的羟基化或环氧化的能力。所述这些酶通常需要NADH或NADPH作为电子供体。可溶性二铁单加氧酶(SDIMO)通常由三种或四种组分组成：羟化酶(本身由多个亚基组成)、氧化还原酶亚基、偶联蛋白、有时还有铁氧化还原蛋白。所述类别至少包含属于亚类的酶：可溶性甲烷单加氧酶类、酚羟化酶类、甲苯单加氧酶类、和烯烃单加氧酶类(Leahy et al.,Evolution of the SolubleDiiron Monoxygenases,FEMS Microbiology Reviews,Vol.27.,p.449-479,2003)。尽管它们的名称不同，但每个SDIMO可能对一系列底物有效。譬如，已表明可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)氧化许多不同的烃底物。
本发明使用的术语“甲烷单加氧酶”旨在表示能够氧化甲烷分子的碳-氢键以生成甲醇分子的一类酶和酶复合物。天然存在的消耗甲烷的微生物已进化出至少两类甲烷单加氧酶：可溶性和颗粒型。所述这些类别的任何酶或酶复合物、任何突变的酶或复合物、或将甲烷转化为甲醇的任何研究人员设计的酶或酶复合物将被认为是甲烷单加氧酶。已知许多这些酶也可氧化各种底物，例如将甲烷转化为甲醇或将乙烷转化为乙醇，因此，其均与本发明的目的相关。
本发明使用的术语“乙烷单加氧酶”旨在表示能够氧化乙烷分子的碳-氢键以生成乙醇分子的一类酶和酶复合物。所述这些类别的任何酶或酶复合物、任何突变的酶或复合物、或将乙烷转化为乙醇的任何研究人员设计的酶或酶复合物将被认为是乙烷单加氧酶。已知许多这些酶也可氧化各种底物，例如将甲烷转化为甲醇或将乙烷转化为乙醇或将丙烷转化为丙醇，因此，其均与本发明的目的相关。
本发明使用的术语“杂合单加氧酶”或“杂合SDIMO”旨在表示由至少两种不同来源的亚基组成的酶复合物。尽管典型的酶复合物可以源自单一微生物，但可在不同微生物的特定亚基中交换并保持催化活性。源微生物可以是或不是密切相关的生物体。如果所述亚基在某种程度上彼此同源，则它们在某种程度上可以互换。这可能会导致有用的发现或酶特性。譬如，来自一个sMMO酶复合物的mmoX可由另一个同源sMMO酶的mmoX替换。
本发明使用的术语“脱氢酶”旨在表示属于氧化还原酶组的酶，其通过还原反应氧化底物，所述还原反应将一个或多个氢原子从底物移除为电子受体。乙醛脱氢酶是催化乙醛转化为乙酸的脱氢酶。醇脱氢酶是一组脱氢酶，所述脱氢酶存在于许多生物体中，并促进醇和醛或酮之间的相互转化，同时还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。如本发明所相关的，醇脱氢酶将甲醇氧化成甲醛和/或将乙醇氧化成乙醛。一些酶，例如来自大肠杆菌的adhE，可催化醇脱氢酶和乙醛脱氢酶反应。
本发明使用的术语“途径”旨在表示一组酶，其使用一个或多个酶促步骤催化底物化学物质转化为产物化学物质。糖酵解是许多活细胞中途径的一个实例。在本发明的上下文中，途径可以是合成途径(由外源性酶组成)或部分合成途径(由外源性和内源性酶组成)。
本发明使用的术语“百分比同一性”，因为其涉及多亚基蛋白复合物，旨在表示在一个复合物中针对第二复合物中的所有亚基测定的一个复合物中的所有亚基之间计算的氨基酸序列的任何成对组合之间的同一性百分比的最大值。可使用公众可获得的计算工具，例如来自NCBI的BLASTp，来计算两个亚基之间的同一性百分比。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸序列”旨在表示一种或多种核酸聚合物，包括但不限于，编码区，其被转录或翻译成多肽或分子伴侣，适当的调节或调控序列，控制序列，譬如翻译起始和终止密码子、启动子序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、转录因子结合位点、终止序列、调节结构域和增强子等。本发明使用的多核苷酸不需要在单一聚合物上包括其所有相关或甚至完整的编码区，并且本发明提供的发明预期在不同聚合物上具有完整或部分编码区。
本发明使用的术语“互补核苷酸”是指此类核苷酸，其中当条件允许核酸链与目的多核苷酸退火或杂交时，则其与所述目的多核苷酸进行退火或杂交。
本发明使用的术语“同源物”或“同源性”用于描述核苷酸或蛋白序列或核苷酸或蛋白序列的一部分，其与本发明公开的相应核苷酸蛋白序列具有高度相似性或同一性。同源性通常表现为核苷酸或氨基酸序列的显着相似性，并且几乎总是表现为三维结构。不同的生物体可具有同源性蛋白，并且相应蛋白中的某些位置可在同源性蛋白中具有等同的位置。可通过使用诸如BLAST、ClustalW或ClustalX等计算机程序来鉴定不同生物体之间的同源性和等同性以及保守残基。如果本发明公开了氨基酸序列中的特定残基，则本发明还旨在包括不同物种中同源性蛋白中的残基，其中确定蛋白在那些不同物种中的所述位置是等同的。
本发明使用的术语“启动子”旨在表示DNA片段，其在与一个或多个基因、编码区、或开放阅读框架功能性连接或可操作地连接时启动所述转录过程。在一些情况下，启动子与一个基因进行功能性连接，而在其他情况下，启动子可与多于一个基因进行功能性连接。
本发明使用的“功能性连接”或“可操作地连接”是指当核酸相对于彼此处于功能性配置时至少两个核酸片段之间的关系。譬如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接，或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则所述核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“功能性连接”或“可操作地连接”是指连接的DNA序列是连续的或处于使一种或另一种功能性连接的配置关系中。然而，序列不必是连续的，以便可操作地连接或功能性连接。
本发明使用的术语“蛋白质折叠伴侣蛋白”和“折叠伴侣蛋白”和“伴侣蛋白”旨在表示一种或多种改善多肽(氨基酸)链折叠成三维结构的蛋白。蛋白质折叠伴侣蛋白帮助它们的底物，即其他蛋白，变得适当折叠并通常更高度可溶。由于大多数蛋白必须以特定形状折叠才能起作用，蛋白质折叠伴侣蛋白的表达可帮助细胞中某些酶进行正确组装，从而可导致底物蛋白的酶活性增加。
本发明使用的术语“亚基”应旨在表示与其他蛋白质分子组装或共组装以形成蛋白复合物或酶的蛋白分子。在本发明的情况下，例如但不限于，单加氧酶可由以下一个或多个亚基组成：mmoB、mmoC、mmoD、mmoX、mmoY和/或mmoZ。如本领域技术人员所确定的，本发明内容旨在包括来自任何微生物或微生物组合的一些或所有亚基。
本发明使用的术语“合适的条件”旨在表示任何一组培养参数，其为微生物提供使培养物能够消耗可利用的营养物的环境。在这样处理时，微生物培养物可以生长和/或生成化学物质或副产物。培养参数可包括但不限于诸如培养基的温度，溶解的氧浓度，溶解的二氧化碳浓度，液体培养基的搅拌速率，容器中的压力等等。
本发明使用的术语“足够的时间/段”旨在表示使培养物中的微生物生成目的化学物质所需的至少最小量的时间。若超过所述最小值，“足够的时间”包括使培养物能够将化学物质生成到所需水平的任何时间量。工业规模的培养物可能只需5分钟便能开始生成可检测量的化学物质，而一些培养物可在数月内产生成效。
本发明使用的术语“合成的/合成”旨在表示分子或微生物，例如但不限于，已被操作成通常不存在于自然界中的形式。譬如，合成微生物应包括但不限于已被操作从而过表达多肽或被转化以包括和/或表达合成的目的多核苷酸的微生物。合成多核苷酸应指已被操作的多核苷酸，例如通过移动片段、引入或重排片段或引入突变。合成多肽应指已被操作的氨基酸序列。
本发明使用的术语“转运蛋白”旨在表示细胞的组分，其调节化学物质、小分子或蛋白穿过生物膜的通道。
本发明使用的“变体”应指已修饰的氨基酸序列或核苷酸序列，其中所得修饰的多肽和/或核苷酸序列仍具有基本相同的功能，以基本相同的方式发挥其功能，和/或达到相同的效果。本发明公开的多肽的变体应指，例如但不限于，本发明公开的多肽与目的多肽之间的一种或多种差异或变化。
酶是用于进行化学反应的有用催化剂。
化学基本上是关于有效地将原子从一个分子重排至另一个分子。可进行化学反应的生物酶是一系列应用(例如化学物质的发酵生成、药物制造和有毒分子的环境生物修复)的有用工具。一些酶能够催化难以(或昂贵、或能量密集、或危险、或使用环境上不利的催化剂等)用于传统大量化学的反应。低成本、低能耗、低影响的催化方法将是一项重大进步。
碳-氢键是高度稳定的。
有机化合物中碳原子和氢原子之间的键是最稳定且难以断裂的键之一。所述键是非极性的，并具有约100 kcal/mol的键解离能，这取决于其周围环境中的其他原子和键。
用于氧化碳-氢键的化学方法是能量密集且浪费的。
为了将有机化合物彼此结合，化学家长期以来寻求一种有效的技术来激活一系列底物的碳-氢键，从简单的烷烃如甲烷、乙烷和丙烷，到芳香族化合物如萘。这些类型的反应中的一些可使用卤化化学来完成，但这些方法是浪费的、能量密集的和非特异性的。对碳氢化合物的其他化学反应，如费-托合成(Fischer-Tropsch)，也是非常耗能的，必须在高温下运行。
自然界已进化出单加氧酶复合物以氧化有机化合物。
碳氢化合物富含能量，并且微生物已进化出消耗它们作为碳源和能量源的途径。可消耗作为唯一碳源的甲烷的细菌被称为甲烷氧化菌。大量科学研究均集中在这些细菌以及它们用于吸收同化甲烷的途径上。激活甲烷的酶复合物属于以下两类中的一种：颗粒型(膜结合的)甲烷单加氧酶(pMMO)或可溶性甲烷单加氧酶(sMMO)。两种酶均将甲烷氧化成甲醇。在研究这些复杂的酶的过程中，研究人员发现pMMO能够氧化其他一些短链烃(如乙烷、丙烷、丁烷、乙烯、丙烯等)，而sMMO能够氧化各种碳氢化合物(Vazquez-Duhalt andQuintero-Ramirez,Petroleum Biotechnology,2004)。
已发现一些微生物不能消耗甲烷，而是可吸收同化其他烃类，例如乙烷、丙烷、丁烷等。虽然存在一些变化，但对短链烷烃类有活性的酶经常在进化上与sMMO相关。因此，一些研究人员将它们的结构分类为可溶性二铁单加氧酶(SDIMO)。它们结构的特征在于羟化酶单元(通常由2或3个多肽亚基组成)、还原酶、有时还有铁氧化还原蛋白和辅助蛋白。
单加氧酶在工业宿主中的功能性异源表达是生物技术的重要工具。
SDIMO是生物技术的重要酶类，因为它们催化困难的化学反应：碳-氢键或碳-碳双键的氧化。大多工业上有用的生物技术方法在遗传易处理的模型生物例如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母等中进行。这些生物中没有一种具有用于氧化短链烷烃类或许多其他烃类的酶。SDIMO在这些生物体中的功能性异源表达将实现一系列应用。特别是，SDIMO的广泛底物接受范围将为这些有价值的生物体的代谢工程提供新的连接。譬如，迄今为止，来自甲烷氧化菌的sMMO已显示出可接受至少50种独特底物，其总结在表1中。鉴于已发现通过所述酶进行羟基化的多种底物，列表可能不完整。当测试其他底物时，所述列表可能会继续发展，因此，表1并不意味着限制，而是示例性地说明这类酶的许多底物。
表1.已被确定为由sMMO催化的底物和产物的列表(Vazquez-Duhalt andQuintero-Ramirez,Petroleum Biotechnology,2004；Green and Dalton,SubstrateSpecificity of Soluble Methane Monooxygenase,J.Biol.Chem.,Vol.264 No.30,pp.17698-17703,1989；BRENDA线上数据库http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝1.14.13.25)。
单加氧酶将使工业生物技术使用较便宜的原料来制造许多商业上可获得的化学物质。
SDIMO表达在工业生物技术中的一个特别有价值的应用是利用低成本原料来生成商品和特种化学品。天然气开采技术的最新进展使低成本的短链气态烷烃充斥市场。这些气体(甲烷、乙烷等)可用作各种发酵衍生化学品的原料。SDIMO在工业宿主(如大肠杆菌和酵母)中的功能性表达，提供了关键催化步骤，其可实现从廉价原料(即甲烷、乙烷等)至中枢代谢的完整途径，从中无数的工业化学品可以较低的成本生成。另一种应用可以是重新利用低价值的石油馏分。SDIMO可能能够执行困难的第一步，即将有用的化学手柄添加到碳氢化合物上，所述碳氢化合物可用于后续酶，或者可将其传递到化学反应器中，或者可以是产品本身。
可溶性甲烷单加氧酶和其他SDIMO是高度混杂的酶，其可催化许多化学反应。
研究最多的SDIMO之一是来自荚膜甲基球菌(Bath)的sMMO。对体外sMMO的研究已经确定了其结构、生化机制和底物特异性等许多关键方面。值得注意的是，此种酶能够使大量底物羟基化。正如Vazquez-Duhalt和Quintero-Romero在2004年的石油生物技术(Petroleum Biotechnology)中所总结的那样，当在体外测定时，sMMO能够将数十种底物羟基化成更多数量的产物。其他SDIMO已经发展出不同的底物特异性。譬如，butanivorans陶厄氏菌的丁烷单加氧酶在丁烷上最活跃，并对较短链的烷烃保持一些活性。另一个实例是来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)KR1的甲苯-4-单加氧酶。所述酶与sMMO在进化上相关，但对芳烃底物具有显着更高的活性。
单加氧酶的异源性表达受到限制。
在过去的25年中，在大肠杆菌中表达完整sMMO的几次尝试，主要是为了简化酶的纯化过程，但并未成功。虽然蛋白质B和C已从大肠杆菌中纯化得到并显示出功能性(Westet al.,Functional Expression in Escherichia coli of Proteins B and C fromSoluble Methane Monooxygenase of Methylococcus capsulatus(Bath),J.GeneralMicrobiology,Vol.138,p.1301-1307,1992)，其余亚基众所周知难以表达(Lloyd et al.,Heterologous expression of soluble methane monooxygenase genes inmethanotrophs containing on particulate methane monooxygenase,Arch.Microbiol.,Vol.171,p.364-370,1999；Smith et al.,Improved system forprotein engineering of the hydroxylase component of soluble methanemonooxygenase,Appl.Env.Micro.,Vol.68 No.11,p.5265-73,2002；Nichol et al.,Controlling the activities of the diiron centre in bacterial monooxygenases:lessons from mutagenesis and biodiversity,Eur.J.Inorg.Chem.,p.3419-31,2015)。事实上，希望在体外或机械研究中分离sMMO酶的研究人员已设计出复杂的方法在天然宿主中表达突变体，以便特异性地避免异源性宿主中功能性酶的问题表达(Ali and Murrell,Development and validation of promoter-probe vectors for the study of methanemonooxygenase gene expression in Methylococcus capsulatus Bath,Microbiology,vol.155,p.761-71,2009；Smith et al.,Improved system for protein engineering ofthe hydroxylase component of soluble methane monooxygenase,Appl.Env.Micro.,Vol.68 No.11,p.5265-73,2002；Nichol et al.,Controlling the activities of thediiron centre in bacterial monooxygenases:lessons from mutagenesis andbiodiversity,Eur.J.Inorg.Chem.,p.3419-31,2015)。
以下描述的本发明是可溶性甲烷单加氧酶在工业相关微生物中的首次报道的功能性异源表达。
以下实施例描述了在工业生物技术常用微生物中表达的sMMO的首次成功演示。本发明涉及SDIMO酶在异源性宿主微生物中的表达。在其中一个实施方案，所述宿主微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)，肠沙门氏菌(Salmonella enterica)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)，产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)，菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)，氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)，运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，土曲霉(Aspergillus terreus)，黑曲霉(Aspergillusniger)和产朊假丝酵母(Candida utilis)中的至少一种。在一个实施方案，所述微生物是大肠杆菌。在一个实施方案，所述微生物是巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案，所述微生物是酿酒酵母。在一个实施方案，所述微生物是谷氨酸棒杆菌。在一个实施方案，所述微生物是甲醇芽孢杆菌。在另一实施方案，所述SDIMO酶是与微生物门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)KR1、甲烷氧化菌OB3b、甲烷甲基单胞菌(Methylomonas methanica)、荚膜甲基球菌(Bath)、Methylocella silvestris、甲基暖菌属175、星状甲鞭毛虫(Methyloferulastellata)、甲基孢囊菌LW5、Solimonas aquatica(DSM 25927)、Methylovulummiyakonense、楚布分支杆菌(Mycobacterium chubuense)NBB4、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)mc2-155、butanivorans陶厄氏菌、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)TY-7、自养无枝酸菌(Pseudonocardia autotrophica)、嗜甲基拟无枝酸菌(Amycolatopsis methanolica)、赤红球菌(Rhodococcus ruber)IGEM 231、和Conexibacter woesei中发现的SDIMO的同源性(以氨基酸序列水平)超过约80％。在一个实施方案，所述SDIMO是可溶性甲烷单加氧酶。在一个实施方案，所述SDIMO是乙烷、丙烷或丁烷单加氧酶。在一个实施方案，所述SDIMO是在微生物中表达的可溶性甲烷单加氧酶，所述微生物是大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中的至少一种。在一个实施方案，所述SDIMO既非来自耻垢分枝杆菌mc2-155的mimABCD，也非在微生物大肠杆菌中表达的来自门多萨假单胞菌KR1的甲苯-4-单加氧酶。在一个实施方案，所述SDIMO是在微生物大肠杆菌中表达的来自荚膜甲基球菌(Bath)的sMMO。在一个实施方案，所述SDIMO在微生物中表达，同时表达至少一种蛋白，所述蛋白改善SDIMO亚基或SDIMO复合物的折叠或溶解度。在一个实施方案，所述SDIMO是杂合酶，其中每个多肽亚基可以不衍生自来自单个微生物的单个SDIMO酶复合物。
这是生物技术的重大进步，因为它为由廉价原料以环境友好方式生成化学物质/品的另外的代谢工程打开了大门。
乙烷是用于化学生成的理想原料
消耗乙烷的工业微生物可生成使用糖不可能有利地生成的燃料和商品化学品/物质。由于其低成本、高能量密度、美国储存丰富以及全年可用性，乙烷是燃料和化学品生成的理想原料。以每碳为基础，乙烷比糖便宜得多。乙烷在化学工业中已是有用的原料，因此，乙烷作为原料已有现成的基础设施和工业经验。
乙烷相对于甲烷作为原料的优点
由于许多与上述相同的原因，甲烷也是用于工业发酵的优异原料。近来，它们的成本大致相同。然而，在许多情况下，乙烷相对于甲烷具有显着的优点。首先，乙烷直接同化为乙酰辅酶A的中枢代谢，而甲烷通过戊糖-磷酸途径同化，最终为每3分子甲烷生成一分子糖酵解中间体(例如DHAP)。因此，譬如，由DHAP制成的一些产品可能更有效地由甲烷制成；然而，许多产品是通过乙酰辅酶A节点制成的，而这些产品均是乙烷进料发酵的完美候选。此举也避免了丙酮酸和乙酰-CoA之间的CO2分子的损失，保留了碳原子并改善了发酵的碳排放特征。其次，碳以2-碳单位而非1-碳单位进行同化更有效，因为建立碳-碳键是困难的并且是能源密集型的。第三，工业生物技术的更多标准微生物已经(没有进一步修饰)可以有氧地消耗乙醇，而仅有一部分生物体，例如巴斯德毕赤酵母和较少使用的甲醇芽孢杆菌，可以消耗甲醇。
开发合成的乙烷营养微生物的优点
在过去的几十年中，微生物学家和代谢工程师已经接受了几种微生物的大部分研究。这些模型生物，大肠杆菌、酿酒酵母、丙酮丁醇梭菌、谷氨酸棒杆菌、巴斯德毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)，是为进一步工程化提供最灵活、易于理解、具有遗传易处理性起点的宿主细胞。已开发了一系列工具和技术来迭代地构建和评估这些菌株的修饰衍生物。在任何这些菌株中发明任何新的核心功能，例如消耗乙烷的能力，是一项重大成就。消耗乙烷的模块化遗传组分或一组组分可与现有的工程化菌株组合以生成一系列工业产品。正如我们自己观察到的，这些菌株中的一些天然能够消耗作为唯一或主要碳源和能源的乙醇。此类微生物已在工业上用作工程化生物催化剂，将碳水化合物转化为一系列生物产品和化学产品。进一步设计这些菌株以扩大其原料选择从而包括乙烷的能力，本身将是有价值的产品。由于乙烷是最便宜的碳基原料之一，譬如，化学品生产商更愿意将乙烷加入其发酵中。
乙烷同化的途径
乙烷可被一些天然存在的微生物用作唯一的碳源和能源。迄今为止，所有已知的乙烷营养微生物首先将乙烷氧化成乙醇。进行此化学反应的酶属于几类单加氧酶(本发明所述)中的一种。因此，对于大多数生物体(可吸收同化乙醇)，使乙烷同化的工程化任务主要(但并非唯一地)集中于实现至少一种单加氧酶的功能性异源表达。
转化乙烷的酶
在需氧条件下，乙烷营养物通过首先将乙烷氧化成乙醇，然后通过乙醛将乙醇转化为乙酰-CoA，从而将乙烷固定到中枢代谢中。第一步的生物化学反应(乙烷到乙醇)通过一组单加氧酶之一进行。一些利用可溶性酶复合物，而另一些利用膜结合的“颗粒型”单加氧酶(N V Coleman et al.,Hydrocarbon monooxygenase in Mycobacterium:recombinant expression of a member of the ammonia monooxygenase superfamily,6The ISME Journal 171–182,2012)。对于天然甲烷氧化菌，科学家们已表明(J Green&HDalton,Substratespecificity of soluble methane monooxygenase.Mechanisticimplications.,264 Journal of Biological Chemistry 17698–17703,1989)他们的甲烷单加氧酶(MMO)也会氧化乙烷(除甲烷外)。同时，一些非甲烷营养微生物能够在乙烷、丙烷和丁烷上生长，但不能在甲烷上生长(M C Redmond et al.,Identification of novelmethane-,ethane-,and propane-oxidizing bacteria at marine hydrocarbon seepsby stable isotopeprobing,76 Applied and Environmental Microbiology 6412–6422,2010)。尽管它们在底物特异性方面存在差异，但这两种酶通常与进化密切相关。已发现一些此类丙烷氧化或丁烷氧化细菌，例如耻垢分枝杆菌mc2-155，戈登氏菌(Gordonia)TY-7和butanivorans陶厄氏菌(Thauera butanivorans)。另一类单加氧酶是P450酶。其中一些已使用定向进化来设计以氧化乙烷，尽管所述天然底物特异性是完全不同的(F Xu et al.,The Heme Monooxygenase Cytochrome P450,4029–4032,2005)；(P Meinhold et al.,Direct Conversion of Ethane to Ethanol by Engineered Cytochrome,00171765–1768,2005)。
在大肠杆菌和酿酒酵母中表达单加氧酶的先前工作
在模型生物大肠杆菌和酿酒酵母中没有关于体内乙烷氧化成功的报道。尽管一些MMO组分已在大肠杆菌中表达，但这些组分未组装成功能性MMO酶复合物(C A West etal.,Functional expression in Escherichia coli of proteins B and C fromsoluble methane monooxygenase of Methylococcus capsulatus(Bath),138 Journalof general microbiology 1301–1307,1992)。具有较长链的特异性烷烃单加氧酶的异源性表达大多失败，少数例外，其中所述源生物与表达宿主密切相关。据报道，甲苯4-单加氧酶(T4MO)已在大肠杆菌中进行功能性表达。(K Canada et al.,Directed Evolution ofTo luene ortho-Monooxygenase for Enhanced 1-Naphthol Synthesis andChlorinated Ethene Degradation Directed Evolution of Toluene ortho-Monooxygenase for Enhanced 1-Naphthol Synthesis and Chlorinated EtheneDegradation,184344–349,2002)。甲苯是与乙烷截然不同的底物，但T4MO操纵子的基因组结构表明T4MO和sMMO之间存在进化保守性，因此值得注意。在新宿主中表达的单加氧酶的第二个目的报告子来自于一项实验，其中pMMO酶于2006年在红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)中明显表达并且以非常慢的速率起作用(Z Gou et al.,Functionalexpression of the particulate methane mono-oxygenase gene in recombinantRhodococcus erythropolis,263 FEMS Microbiology Letters 136–141,2006)。红串红球菌是非常著名的菌株，具有非常广泛的内源性单加氧酶(C de Carvalho,The remarkableRhodococcus erythropolis,715–726,2005)。尚未有其他报道证实此原始出版物。酚羟化酶及其伴侣蛋白被重构并在大肠杆菌中成功表达(T Furuya et al.,Reconstitution ofactive mycobacterial binuclear iron monooxygenase complex in escherichiacoli,79 Applied and Environmental Microbiology 6033–6039,2013)。尽管所有这些工作，但没有一组报道过标准工业微生物已被设计成消耗甲烷或乙烷或将甲烷、乙烷或乙醇转化为商业产品。
许多工业化学物质类别是可能的商业产品
在过去的几十年中，几家公司已成功地商业化或开发了能够从糖原料生成工业化学品/物质的微生物。这些项目将受益于原料成本的降低，例如能够使用乙烷代替糖。目前开发的产品包括但不限于，苹果酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、L-苹果酸、D-苹果酸、马来酸、乳酸、己二酸、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、1,4-丁二醇、丁二烯、脂肪酸衍生物类、脂肪醇类、脂肪酸类、脂肪酸酯类、脂肪酸甲酯类、脂肪酸乙酯类、支链脂肪酸类、支链脂肪酸衍生物类、ω-3脂肪酸类、类异戊二烯类、法呢烯、法呢烷、角鲨烯、角鲨烷、类胡萝卜素类、氨基酸类、氨基酸类、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、乙醇、丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇(2-甲基丙-1-醇)、醇类、烷烃类、烷烯烃类、烯烃类、动物饲料添加剂类、氨基酸混合物类等。
在一个实施方案，当所述微生物是大肠杆菌时，所述单加氧酶不是甲苯4-单加氧酶。在一个实施方案，当所述微生物是大肠杆菌时，所述甲烷单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌。在一个实施方案，当MMOC、MMOB、MMOX、MMOY和MMOZ亚基在大肠杆菌中表达时，所述单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌的甲烷单加氧酶。在一个实施方案，当来自大肠杆菌的伴侣蛋白GroEL和GroES过表达时，MMOC、MMOB、MMOX、MMOY和MMOZ亚基在大肠杆菌中表达时，所述单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌的甲烷单加氧酶。在一个实施方案，当来自大肠杆菌的伴侣蛋白GroEL和GroES由质粒过表达时，MMOC、MMOB、MMOX、MMOY和MMOZ亚基在大肠杆菌中表达时，所述单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌的甲烷单加氧酶。在一个实施方案，当来自大肠杆菌的伴侣蛋白GroEL和GroES由用于厌氧气氛的质粒过表达时，MMOC、MMOB、MMOX、MMOY和MMOZ亚基在大肠杆菌中表达时，所述单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌的甲烷单加氧酶。在一个实施方案，当来自大肠杆菌的伴侣蛋白GroEL和GroES由用于牛的瘤胃的质粒过表达时，MMOC、MMOB、MMOX、MMOY和MMOZ亚基在大肠杆菌中表达时，所述单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌的甲烷单加氧酶。在一个实施方案，当转移至pSBA1A3载体中时，所述单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌的单加氧酶基因。
在一个实施方案，当在帕武斯甲基孢囊菌(Methylocystis Parvus)OBBP或album甲基微菌(Methylomicrobium album)BG8中表达时，所述单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌或甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)OB3b的甲烷单加氧酶。在一个实施方案，当在帕武斯甲基孢囊菌(Methylocystis Parvus)OBBP中表达时，所述单加氧酶不是来自甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)OB3b的可溶性甲烷单加氧酶。在一个实施方案，当以低铜与生物质比率在album甲基微菌BG8中表达时，所述单加氧酶不是来自荚膜甲基球菌或甲烷氧化菌OB3b的单加氧酶。
在一个实施方案，所述合成微生物不是如SEQ ID NO：49所示的在adhE基因的位置267处具有突变的大肠杆菌。在一个实施方案，所述合成微生物不是大肠杆菌，所述大肠杆菌具有如SEQ ID NO：49所示的在adhE基因的位置267处A突变为T和位置568处E突变为K。
在一个实施方案，当在大肠杆菌中表达时，尤其是当用GroEL样蛋白MimG表达时，所述单加氧酶不是放线菌单加氧酶。在一个实施方案，当在大肠杆菌中用GroEL样蛋白MimG表达时，所述单加氧酶不是来自耻垢分枝杆菌或古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)的甲烷单加氧酶。在一个实施方案，当在大肠杆菌中用GroEL样蛋白MimG表达时，所述单加氧酶不是来自耻垢分枝杆菌或古地分枝杆菌的甲烷单加氧酶；其中所述mimB和/或mimD基因已经或已被优化用于在大肠杆菌中表达。
实施例
实施例1活性可溶性二铁单加氧酶将乙烷转化为乙醇
本实施例描述了用于培养菌株以从乙烷原料生成乙醇的菌株和方法。
酵母菌株用于糖发酵生成乙醇，已有数千年。因此，经鉴定，许多酵母菌菌株能够耐受高水平的乙醇。乙醇是一种商业上广泛应用于各领域的产品，包括清洁产品和运输燃料。
本发明描述了用于构建表达异源酶、酶复合物、或多种酶或酶复合物的酵母菌株的技术。简而言之，每个基因都是由一个独特的启动子表达的。所述基因可以从质粒或染色体位点表达。在一些情况下，额外的蛋白质可以帮助酶或酶复合物的折叠或组装。
乙烷单加氧酶可选自表16。如本发明所述，任何附加的遗传因子可识别并以相似的方式表达。表达功能性乙烷单加氧酶的酵母菌株能够将乙烷转化为乙醇。在某些条件下，酵母菌株可消耗作为碳源或能量源的乙醇；在其他条件下，酵母菌株可产生过量的乙醇，并将其分泌到培养基中。
所述菌株可在含有葡萄糖(或其他糖或淀粉)、甘油、乙醇或乙烷作为碳源和能源的基本培养基中培养。当菌株在培养物中达到足够的细胞密度后，培养物可转换成不含碳源的基本培养基，并通过在顶部空间中提供乙烷，这些细胞可用于实现将乙烷到乙醇的生物转化。另外，菌株可在将乙烷(和其他气体，例如氧气)进行连续起泡或鼓泡的生物反应器中培养。
一旦乙醇以足够的量生成，可通过诸如蒸馏或蒸发的方法进行批量或连续地分离。
尽管所述实施例描述了在酵母菌株(例如酿酒酵母或毕赤酵母)中将乙烷转化为乙醇的实例，但原则上与使用另一种菌株(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等细菌菌株)生成乙醇没有很大差异。在任何情况下，一个重要的因素是菌株的乙醇耐受性。各种菌株，如大肠杆菌，已被设计为或适应更高水平的乙醇耐受性(H Chong et al.,Improving EthanolTolerance of Escherichia coli by Rewiring Its Global Regulator cAMP ReceptorProtein(CRP),8 PLoS ONE 1–9,2013)；(L H Luo et al.,Improved ethanol tolerancein Escherichia coli by changing the cellular fatty acids composition throughgenetic manipulation.,31 Biotechnology letters 1867–1871,2009)，所述一般程序/方法也可应用于其他微生物菌株。
所述实施例的这部分描述了实际进行的工作，其描述了用于培养菌株以从乙烷原料生成乙醇的菌株和方法。
以上和其他地方描述了构建表达异源酶、酶复合物、或多种酶或酶复合物的大肠杆菌菌株的技术。在此实施例中，能够将乙烷氧化成乙醇的酶，在大肠杆菌菌株的质粒上由诱导启动子表达，并显示将乙烷转化为乙醇。
利用达特森科(Datsenko)和万纳(Wanner)的方法，从含有araBAD基因的大肠杆菌基因组中缺失DNA区域构建NH283菌株(K.Datsenko and B.Wanner,One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRProducts,Proceedings of the National Academy of Sciences,Vol 97,Issue 12,p.6640-5,2000)。利用引物LC95/LC96(SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4)和LC97/LC98(SEQ IDNO:5，SEQ ID NO:6)，从大肠杆菌基因组DNA中扩增同源序列。利用LC93/LC94(SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2)，从PKD3中扩增抗生素耐药基因cat。利用重叠延伸PCR(“SOEing”)与外部引物LC96/LC98，将这些片段在单管中进行合并和组装。在含有17μg/ml氯霉素的琼脂平板上对转化体进行分离，并用菌落PCR进行确证。选择NH283作为这些克隆中的一种，用于后续实验。
制备了两种质粒，每种质粒含有来自荚膜甲基球菌(M.capsulatus，Bath)的sMMO基因。含有表达为MMOX、MMOY、MMOB、MMOZ、MMOD、MMOC、假定蛋白、MMOG操纵子的基因组区域，可通过PCR从荚膜甲基球菌(M.capsulatus，Bath)基因组DNA中进行扩增。在具有p15A原基的质粒和卡那霉素抗性基因中，所述区域被吉布森克隆到阿拉伯糖诱导型pBAD启动子或IPTG诱导型pTRC启动子后面(D.Gibson et al.,Enzymatic assembly of DNA moleculesup to several hundred kilobases,NATURE METHODS Vol 6,Issue 5,p.343-345,2009)。通过Sanger测序对质粒进行序列确证，以包含预期的DNA序列(如以下SEQ ID NO：19和SEQID NO：26中所列)。将质粒分别转化到NH283菌株中(表2)。
表2：菌株和质粒
以下描述了用于培养菌株和测定乙烷生物转化为乙醇的方法。将所有菌株接种于1mL含卡那霉素(50μg/ml)的LB米勒(Miller)培养基中，以280rpm转速振荡，37℃下生长18小时。将培养物生长至静止期，然后将0.1毫升培养物用于接种两个含有无菌10mL LB+卡那霉素(50μg/ml)+1mM IPTG或1mM阿拉伯糖的烧瓶。使培养物在37℃下，振荡生长至OD600～1.2(约4～4.5小时)。将细胞以4000rpm旋转5分钟，并重悬于10mL磷酸盐缓冲液(PBS)中。将这10毫升等分成两个玻璃血清瓶，每瓶5毫升。然后用丁基橡胶塞密封玻璃瓶。将测量体积为60mL的乙烷或空气抽入注射器中，并通过塞子，注入两个玻璃瓶中的每一个中。玻璃瓶在37℃下振荡7天，然后抽取上清液，以测定乙醇浓度。
使用比色测定法(细胞生物标记目录号STA-620)测定乙醇。简言之，其使用产生过氧化氢的酶促反应测定乙醇，所生成的过氧化氢与比色探针发生反应。将90μL的反应混合物与10μL的样品进行混合，在37℃下孵育30分钟。测定混合物的组成描述于表3中。将570nm处的吸光度与标准曲线进行比较，并对每个样品中的乙醇进行定量。图2比较了三种大肠杆菌中乙烷转化为乙醇的转化率。对照菌株(左)不含乙烷氧化酶，并且所述菌株不能将乙烷转化为乙醇。另外两个菌株具有乙烷氧化酶，可将乙烷转化为乙醇。
去离子水(mL) 2.175
10x分析缓冲溶液(mL) 0.25
100x酶混合物(μL) 25
50x比色探针(μL) 50
总反应体积(mL) 2.5
表3用于乙醇分析的反应混合物组成
收集原始吸光度数据后，如下处理数据：从所有样品中减去背景吸光度(仅介质)，包括校准样品。每种菌株均已注入空气或注入乙烷进行了测试。从注入乙烷的样品的吸光度中减去空气注入样品的吸光度。将所述吸光度值与校准曲线进行比较，以确定乙醇的量。图2中显示的数据阐述了在菌株表达单加氧酶的条件下乙醇的生成量。
实施例2在大肠杆菌中活性可溶性二铁单加氧酶将甲烷转化为甲醇
本实施例描述了用于培养菌株以从甲烷原料中生成甲醇的菌株和方法。
在本实施例中，阐述了在实施例1中能将乙烷氧化成乙醇的可溶性二铁单加氧酶同时可将甲烷转化为甲醇。菌株和质粒及其构建方法，与实施例1相同。分析方法也几乎相同，具有如下修改。
使用甲烷代替乙烷，注入带瓶塞的玻璃血清瓶中培养物的顶部空间。随后，用比色法测定从血清瓶中抽取样品中甲醇的浓度，使用相同的方法首先确定标准曲线，将样品调整至注入空气的相应对照样品，然后将其吸光度(注入甲烷减去注入空气吸光度的差值)与所述标准曲线进行比较。扣除对照菌株的背景值，并对图3中的菌株BZ11和LC168所得值进行作图。
实施例3改善菌株以增加甲烷和乙烷通过工程化大肠杆菌转化为甲醇和乙醇
本实施例描述了用于培养菌株以从甲烷原料生成甲醇或从乙烷原料生成乙醇的改良菌株和方法。
可使用本领域技术人员公知的各种技术进行构建改良的菌株。一些的这些技术包括：改变质粒繁殖数量、改变启动子强度、改变诱导剂浓度、改变培养温度、将基因整合入染色体中、整合多个基因至一个质粒上、将基因分离到多个质粒上。
除了复制源(CLDDF13取代P15A)外，菌株LC160类似于菌株LC168，LC160也具有第二操纵子，所述第二操纵子组成型表达所述大肠杆菌基因groES和groEL。groES/groEL操纵子的DNA序列，可从大肠杆菌基因组DNA(表2)中进行扩增。LC160中的质粒序列如SEQ IDNO：25所示。
如本发明所述，进行细胞培养和甲醇测定。图4阐明了大肠杆菌中甲烷转化为甲醇的过程。对照菌株LC165不含甲烷氧化酶，所述菌株不会将甲烷转化为甲醇。菌株LC160(图4)表达来自荚膜甲基球菌中的sMMO和大肠杆菌中的groESL。由于LC160中甲烷转化为甲醇的微生物转化过程，测得超过400μM的甲醇。
如本发明所述，进行细胞培养和乙醇测定。图5比较了两株大肠杆菌中乙烷向乙醇的转化率。对照菌株LC165(图5，左侧)不含乙烷氧化酶，所述菌株不能将乙烷转化为乙醇。菌株LC160(图5，右)表达来自荚膜甲基球菌中的sMMO和大肠杆菌中的groESL。
实施例4在大肠杆菌中将萘生物转化为1-萘酚
以下描述了用于培养菌株和测定多孔微孔板中sMMO将萘生物转化为1-萘酚的高通量方法。通过扩增含有基因mmoXYBZCDGMMO操纵子的荚膜甲基球菌(Bath)基因组DNA的相关部分，构建质粒pDG5(SEQ ID NO：21)，并将所述DNA片段克隆到含有p15a复制源、卡那霉素抗性基因和pBAD启动子的pACYC载体中。除了在操纵子的3'末端存在的mmoG(groEL-2)，所述质粒pDG5与质粒pDG6(SEQ ID NO：22，图10)几乎相同。通过用质粒pDG5转化菌株NH283并在补充有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上选择转化体，进行菌株LC151构建。将所有菌株接种于2mL 96孔板中，每孔含有0.4mL补充有适当抗生素的LB培养基(50μg/mL的卡那霉素和100μg/mL的壮观霉素)，并在37℃下振荡培养过夜。为了诱导sMMO，将40μL/孔的过夜种子培养物的等分试样，接种在新鲜的96孔板中，每孔含有400μL补充有抗生素和1.0mM L-阿拉伯糖的LB培养基。使培养物在37℃下振荡生长4至5小时。将细胞以3700xg旋转10分钟，并通过连接到真空泵的96针吸气器除去用过的LB培养基。将细胞重悬于1.0mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并再次以3700xg离心10分钟，再次通过抽吸除去PBS清洗缓冲液。将清洗的细胞沉淀重悬于0.25mL含有0.4％甘油(v/v)，1mM L-阿拉伯糖和80μM FeSO4的PBS测定缓冲液中。
通过加入溶于纯乙醇中10μL/孔0.5 M的萘，制备萘测定板。在所有醇蒸发后，蒸发时间大约2小时，在每个孔的底部形成细小萘晶体。将200μL/孔测定缓冲溶液悬浮细胞等分试样转移到萘板中，并与萘晶体混合。然后将萘测定板密封并在37℃孵育，并振荡培养过夜。通过以3700xg转速旋转10分钟，将含有1-萘酚的上清液与细胞沉淀物分离，并将150μL/孔的上清液转移到96孔透明平底微量滴定板中。
用比色法测量1-萘酚。将150μL上清液中的1-萘酚，与50μL 0.2％(w/w)溶于去离子水的固蓝B(四氮化O-邻茴香胺)新鲜溶液反应。540Nm下，在平板读取器上检测有色重氮络合物。重氮络合物的浓度与1-萘酚产物的浓度成正比。
扣除空白对照菌株LC165的吸光度和缓冲液空白后，sMMO活性表达为相对吸光度(A540)。如图6所示，表达荚膜甲基球菌sMMO操纵子的两个菌株(LC151和LC168)显示出比表达空载体对照的LC165高得多的活性。
这是在工程化大肠杆菌菌株中成功表达活性荚膜甲基球菌sMMOs的第一个实例，其可通过萘比色测定法进行检测。通过优化和平衡sMMO及其在大肠杆菌和其他异源宿主中的同源物，可将本发明所述的高通量方法用于菌株改良。
实施例5伴侣蛋白表达改善MMO活性：萘转化为萘酚
在一个实施例中，我们示出了荚膜甲基球菌MMOG(groEL-2伴侣同源物)，对于单一质粒(pDG5(SEQ ID NO：21)、pLC39(SEQ ID NO：26))上表达的天然荚膜甲基球菌MMO操纵子的大肠杆菌菌株中的MMO活性是至关重要的。在另一个实施例中，我们进一步证明了在相容质粒(pNH180(SEQ ID NO：40))上重构荚膜甲基球菌groES-EL2操纵子，极大地改善了携带mmoG-minus质粒大肠杆菌菌株中的MMO活性(pDG6(SEQ ID NO：22))。
所述实施例描述了将MMO活性提高了一个数量级以上的方法。此种新方法涉及pNH180中大肠杆菌groES-groEL和荚膜甲基球菌groES-EL2的过表达。从大肠杆菌BW25113基因组DNA中对大肠杆菌groES-groEL片段进行PCR扩增，凝胶纯化，并克隆到终止子序列前的载体中。在序列验证后，使用引物BZ111(SEQ ID NO：70)和LC166(SEQ ID NO：71)，通过PCR对groES-groEL-终止子片段进行扩增，凝胶纯化，并通过超级引发方法(Ulrich etal.,Exponential MegaprimingPCR(EMP)Cloning—Seamless DNA Insertion into AnyTarget Plasmid without Sequence Constraints,PLoS One,7(12),e53360,2012)将其克隆到pNH180中的荚膜甲基球菌groES-EL2后方。在DpnI消化除去pNH180质粒DNA后，将反应混合物转化到携带MMO质粒pDG6的NH283中。转化体生长于辅以含选型pDG6卡那霉素50μg/mL、所需的重组质粒选型(pBZ13(SEQ ID NO：15))壮观霉素100μg/mL的LB琼脂平板上。通过萘测定筛选多种菌落，产生携带pDG6和pBZ13质粒的新MMO菌株(BZ25)。如表4所示，BZ25中的MMO活性比之于DG80有着显着改善。然后将pBZ13质粒与pDG6分离，纯化，并进行序列验证。通过将pBZ13质粒转化为NH283，制备碱基菌株(BZ26)。然后将pDG6质粒导入BZ26，以确证所得菌株等同于原始BZ25。
表4通过荚膜甲基球菌和大肠杆菌伴侣蛋白共表达来改善MMO活性
实施例6.伴侣蛋白表达改善MMO活性：甲烷转化为甲醇
本实施例描述了通过实施例3中详述的生物转化方法直接氧化甲烷来对改良MMO菌株(BZ25)进行评估。两种菌株在补充有50μg/mL的卡那霉素和100μg/mL的壮观霉素的LB液体培养基中生长。如本发明其他地方所述，实施MMO诱导和甲烷生物转化为甲醇的方法。在注入甲烷气体后20小时测定甲醇效价。DG80和BZ25的MMO活性如表5所示。
菌株 MMO质粒 伴侣蛋白质粒 甲醇(mM)/OD600
DG80 pDG6 pNH180 4.16
BZ25 pDG6 pBZ13 6.33
表5通过DG80和BZ25氧化甲烷
实施例7.大肠杆菌中甲烷单加氧酶的同源物
来自荚膜甲基球菌(Bath)的sMMO的同源物，可使用公众可获得的数据库和搜索算法来确定，例如NCBI的BLASTp。通过这种方式可发现多种序列，且所述序列可使用本发明所述的方法进行测试。编码所述同源物的DNA序列可从基因组DNA分离物中进行提取，从相关菌株的裂解物中进行PCR扩增，或者可进行设计、密码子优化，以在所需宿主微生物中进行表达，且可通过使用市售DNA合成服务进行合成。
在一个实例中，来自甲烷氧化菌，诸如Methylocella silvestris和甲烷氧化菌(甲基弯曲菌，Methylosinus trichosporium)的sMMO同源物的DNA序列可由商业供应商合成编码而得。使用标准技术，例如限制性消化和等温组装(D.Gibson et al.,Enzymaticassembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,NATURE METHODS Vol6,Issue 5,p.343-345,2009)，将序列克隆到与本发明所述相同的载体中。将组装的DNA转化到菌株NH283中，并通过菌落PCR和桑格(Sanger)测序法进行验证。
可使用与本发明所述相同的方法测试这些菌株。
经鉴定，微生物体含有荚膜甲基球菌sMMO的同源物。来自所述微生物体的mmoXYBZDC基因序列在操纵子中进行密码子优化和合成，所述操纵子利用了含有基因间强核糖体结合位点的合成连接体。在操纵子中，这些相同微生物的groESL基因进行了类似地密码子优化和合成。合成DNA可由商业供应商(Gen9,Inc.)提供。将每个操纵子克隆到不同的质粒中。将mmoXYBZDC操纵子克隆到质粒pDG6(SEQID NO：22)骨架中，所述骨架含有pACYC源、卡那霉素抗性基因、araC阻遏物基因和驱动操纵子表达的pBAD启动子。将groESL操纵子转化到质粒pDG11骨架中，所述骨架含有cloDF13源，壮观霉素抗性基因和驱动操纵子表达的合成J23116启动子。
对于每种生物体，将两种质粒连续转化到菌株NH283中，并在合适的抗生素上进行选择。表6中列出了sMMO和groESL酶的来源微生物、以及菌株和质粒名称。
质粒pNH157(SEQ ID NO：31)、pNH160(SEQ ID NO：33)和pDG6(SEQ ID NO：22)各自含有6个来自不同生物体的sMMO酶复合物编码的基因(mmoX,mmoY、mmoZ、mmoB、mmoC、mmoD)。质粒pNH185(SEQ ID NO：42)、pNH188(SEQ ID NO：44)和pNH180(SEQ ID NO：40)各自含有2个来自不同生物体的groESL酶复合物编码的基因(groES、groEL)。
以下描述了培养菌株和测定甲烷生物转化成甲醇或乙烷生物转化成乙醇的方法。所有菌株接种于1mL补充有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(100μg/mL)的LB米勒(Miller)中，并在37℃下振荡培育18小时。培养物培养至稳定期，然后使用0.2mL培养物接种到含有无菌20mL LB米勒、卡那霉素(50μg/mL)、壮观霉素(100μg/mL)、1mM阿拉伯糖和80μMFeSO4的烧瓶上。在37℃下振荡培养物中，培养5小时。将细胞以4000rpm旋转10分钟，并在等体积pH7.5磷酸盐缓冲溶液(PBS)中进行清洗。再次旋转细胞，并重悬于等体积的含有1mM阿拉伯糖、80μM FeSO4和0.4％甘油的PBS中。将每份5mL的三份等分试样转移到相同玻璃血清瓶中。然后用丁基橡胶塞密封玻璃瓶。抽取60mL甲烷、乙烷或空气，并经注射器穿过胶塞注入每个玻璃瓶中。在37℃下，将玻璃瓶振荡43小时，此时将细胞悬浮液进行离心，抽取上清液，测定甲醇和乙醇浓度。
使用本发明其他地方所述的比色测定法(细胞生物标记STA-620)测定醇类。
表6示出了醇测定结果。这些数据表明含有不同sMMO/groESL基因的菌株DG68、DG72和DG80均具有将甲烷氧化成甲醇的活性，以及将乙烷氧化成乙醇的活性。酶之间的百分比同源性列于表8中。
表6.含有sMMO的各种同源物及其同源groESL酶菌株的甲烷和乙烷氧化活性
实施例8.当与异源性伴侣蛋白共表达时，MMO酶同源物是有活性的
经鉴定，微生物体含有荚膜甲基球菌sMMO同源物。对mmoXYBZDC和groESL基因进行鉴定、密码子优化、合成、克隆到载体中，并如本发明其他地方所述，转化到菌株NH283中。
表7中列出了Smmo、groESL酶的来源微生物、菌株和质粒名称。表8列出了同源物之间的同源性百分比。质粒pNH157(SEQ ID NO：31)，pNH158(SEQ ID NO：32)，pNH160(SEQ IDNO：33)和pDG6(SEQ ID NO：22)各自含有6个来自不同生物体sMMO酶复合物编码的基因(mmoX、mmoY、mmoZ、mmoB、mmoC、mmoD)。质粒pNH185(SEQ ID NO：42)，pNH188(SEQ ID NO：44)和pNH180(SEQ ID NO：40)各自含有2个来自不同微生物的groESL酶复合物编码的基因(groES、groEL)。
如本发明所述，实施培养菌株方法和测定甲烷到甲醇或乙烷到乙醇的生物转化的方法。如上所述，醇浓度的测定，包括使用空气控制和数据处理技术。
表7示出了所述醇的测定值。这些数据表明含有sMMO和groESL基因的各种组合的菌株DG68、DG69、DG71、DG72、DG73和DG80，均具有将甲烷氧化成甲醇和将乙烷氧化成乙醇的活性。
表7.含有多种sMMO酶菌株的甲烷和乙烷氧化活性，所述sMMO酶与来自荚膜甲基球菌(Bath)的伴侣蛋白groES/groEL进行共表达。
表8.来自不同微生物的sMMO酶之间的百分比同一性。使用Clustal Omega对使用mmoX序列、使用多基因酶的百分比同一性的定义、以及groEL和groES的sMMO酶计算所得值。
使用在线软件Clustal Omega，将所述酶的氨基酸序列进行相互比较，结果如下表8中所示。表7中所示的功能酶显示mmoXYZCBD同源物之间或groESL组件之间序列同一性的低严格性。
本发明的范围旨在涵盖本发明公开的合成核苷酸和/或氨基酸序列的变体。如科学文献中所公开的，在数据库中，在本发明公开或在本领域技术人员公知的本申请提交日期情况下，多肽序列的某些位置通常是保守残基，其可根据多肽的极性，电子-物理特性，疏水和空间特性进行测定。本领域技术人员将能够修饰本发明公开的氨基酸序列，维持保守残基和/或在那些保守残基中应用保守取代，并确定那些变体是否仍保持功能。图18显示三种不同微生物中单加氧酶羟化酶的α亚基的多序列比对，并说明单加氧酶氨基酸序列可改变并保持观察到的功能的程度。可使用这种序列比对，将赋予改善的酶特性(例如活性和/或特异性)的一个序列的任何突变，替换成另一个同源序列，如BLASTp的软件系统所公开的，以识别同源物的等同位置。本领域技术人员清楚如何鉴定和构建同源序列中的等同突变。
可溶性二铁单加氧酶的特性已在学术界研究了多年，以了解其结构、功能和机理。Coufal等人的论文，在2000年(Coufal et al.,Sequencing and analysis of theMethylococcus capsulatus(Bath)soluble methane monooxygenase genes，Eur.J.Biochem，vol.267，p.2174-2185,2000，其通过引用其全文并入本发明，包括其所有附图)描述了MMO亚基的保守残基。
在MMOH酶的MMOX亚基中，铁配体残基序列模式E...EX2H已被注意为含有羧酸盐桥联的非血红素二铁中心的蛋白质的标志，并且是跨越sMMO，R2和硬脂酰基-ACP去饱和酶家族的唯一保守序列。因此，在SEQ ID NO：10的以下位置中通常存在保守残基：E114，E144，H147，E209，E243和H246。此外，活性位点的下半部分具有一组参与C和F螺旋(D143，R146，S238，D242和R245)之间的氢键的残基，并且在蛋白质中是绝对保守的。这些残留物可能是将铁中心保持在适当位置或可能将质子传递到活性位点的框架的一部分。由于空间原因，两个残基是保守的；A117和G250均位于填料排列非常紧的位置。最后，存在三个表面可接近的残基，包括A224，G228和D229，位于螺旋E和F之间的转角处。
α亚基的其他部分中的保守残基显示在Coufal的图6中。W371在吲哚环的一个边缘上溶剂暴露。两个Tyr残基埋在蛋白质内部。此外，脯氨酸残基P377是绝对保守的并且在结构上可能是重要的。羟化酶-还原酶结合相互作用的模型将还原酶结合位点置于所述区域，表明这整个残基簇可作为另一种蛋白的对接位点或作为电子传递途径的一部分。此外，T213、N214可能有助于质子转移。另一组保守残基包含P424，G443，P461和Y464，并且位于羟化酶α亚基的第二结构域中。这些氨基酸位于γ-亚基界面附近蛋白表面的稍下方。
最后，在活性位点上方的“峡谷”区域中的蛋白质表面上发现的一组残基通常是保守的。这些残基是Y67，K74，L321，G325和P329，它们在Coufal的图6中以黄色表示。已经假设峡谷可能是蛋白质B或可能是还原酶的停靠位点。因此，这些保守残基在介导两种蛋白质之间的相互作用中可能是重要的。特别是，K74和Y67非常靠近地表并位于峡谷中。结合上述E/F螺旋“手柄”，这些残基可能是偶联蛋白B和羟化酶MMOH之间的关键相互作用点。
另外，在β-亚基mmoY(SEQ ID NO：12)中，包含D100，P101和D185的α和β亚基之间的界面是保守的，如图7中的Coufal所示。尽管在α亚基中没有保守的氢键或盐桥配偶体，但这些残基可能参与亚基间相互作用。第二组残基W218，R228和A331可在β亚基的表面下找到，第三组主要含有极性残基的氨基酸(D240，E243，Q313和W320)非常接近蛋白质表面。此外，已经在β-亚基类似物的比对中鉴定了24个高度保守的残基，如Coufal的图4A所示。最值得注意的是，两个带电荷的氨基酸K44和E48在羟化酶峡谷中是保守的，在那里它们可参与蛋白质-蛋白质相互作用。八个保守的芳香族残基可是从β亚基上的推定的还原酶结合位点到二铁活性位点的电子转移途径的一部分。应该注意的是，β-β界面附近没有残基在这组酶中高度保守。蛋白质B(SEQ ID NO：8)也具有某些保守残基。偶联蛋白的序列比对(参见Coufal，图4B)揭示了5个绝对保守的残基(V38，E53，I79，G97和G114)，8个高度保守的残基(I52，V70，I85，E94，R98，V107，D108和S111)，和8个中等保守残基(V41，I55，V68，G83，V87，I92，L96和F100)。蛋白质B的表面很大程度上是疏水性的，使其非常适合于将疏水性峡谷与羟化酶结合。来自NMR结合研究的MMOH-蛋白B对接模型与疏水相互作用主导羟化酶-蛋白B结合以及甲烷氧化菌OB3bsMMO系统的交联研究的建议一致，其中蛋白B显示结合羟化酶的α-亚基。许多这些保守残基(包括L96，G97，F100，V107，D108和G114)受羟化酶结合影响的发现表明羟化酶-偶联蛋白结合模式对于所有检测的酶系统是相似的。因此，使用序列同源性比对来鉴定蛋白质-蛋白质结合位点似乎对这组蛋白质有效。羟化酶上的互补残基(可能位于峡谷区域)也可能是保守的。蛋白质C(SEQ ID NO：59)也具有保守残基。sMMO还原酶是FNR氧化还原酶家族的成员，其含有充分表征的[2Fe-2S]和FAD辅因子位点和NADH结合口袋。先前已经讨论了还原酶组分中的保守残基。
如果残基不是保守的，则可将其缺失、修饰和/或用另一种氨基酸置换，所述另一种氨基酸的掺入基本上不影响所公开的蛋白质的功能。因此，本发明公开的原始肽可通过在肽内不同的、可能是选择性的位点取代一个或多个残基来修饰。这种取代可以是保守取代，例如用另一种疏水残基取代疏水残基，或者在特定残基不是保守残基的情况下可以少于保守取代。基于残基的位置，一些取代比其他取代更好。然而，基于残基的位置，甚至可容忍非保守或甚至基团取代，如本领域技术人员可以证明的。
取代也意味着包括除常见L-氨基酸之外的那些，例如D-氨基酸或具有非标准R基团的其他氨基酸。这些置换中的每一个旨在落入本申请的公开内容中。
实施例9.几种异源性伴侣蛋白通过sMMO改善甲烷转化为甲醇的转化率。
本实施例描述了来自荚膜甲基球菌(M.capsulatus，Bath)的sMMO具有改善的对甲烷作为底物的活性的能力，其中共同表达一组groES/groEL伴侣蛋白。
本发明其他地方描述的菌株NH283同时用两种质粒转化：pDG6(SEQ ID NO：22，含有对应于荚膜甲基球菌(M.capsulatus，Bath)mmoX，mmoY，mmoZ，mmoC，mmoB和mmoD基因的编码区)，和质粒，所述质粒选自含有pNH178(SEQ ID NO：39)、pNH180(SEQ ID NO：40)、pNH181(SEQ ID NO：41)、pNH185(SEQ ID NO：42)、pNH187(SEQ ID NO：1)的质粒组。(SEQ ID NO：43)和pCDF1b(SEQ ID NO：20)(分别含有来自微生物butanivorans陶厄氏菌(T.butanivorans)、荚膜甲基球菌、毛孢子菌、甲基暖菌属175、甲基孢囊菌LW5的密码子优化的groES/groEL基因，和对照载体pCDF1b)。在补充有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上选择这些转化体。
选择这些转化中的每一个的一个菌落用于在补充有抗生素的2mL液体LB培养基中生长，如上所述，并在37℃下、280rpm下振荡培养。16小时后，将1mL培养物加入10mL补充有卡那霉素(50μg/mL)、壮观霉素(100μg/mL)、阿拉伯糖(1mM)和FeSO4(80μM)的LB中以诱导单加氧酶表达。将每10mL培养物在37℃下、280rpm振荡孵育。4小时后，将每种培养物离心并重悬于10mL PBS中以清洗细胞。将它们各自再次离心并重悬浮于补充有阿拉伯糖(1mM)，FeSO4(80μM)和甘油(0.4％终浓度)的10mL PBS中。将此10mL体积在两个血清瓶之间平均分配并用丁基橡胶塞密封。通过一个血清瓶的塞子注入60mL空气，同时通过另一个血清瓶的塞子注入60mL甲烷。将所有血清瓶置于37℃，以280rpm振荡。44小时后，打开瓶子并使用本发明所述的技术对存在的甲醇进行取样。通过与标准曲线比较，菌株产生以下浓度的甲醇，如下表所示。
sMM微生物 sMM质粒 groESL微生物 groES质粒 甲醇(mM)
荚膜甲基球菌 pDG6 butanivorans陶厄氏菌 pNH178 0.10
荚膜甲基球菌 pDG6 荚膜甲基球菌 pNH180 2.67
荚膜甲基球菌 pDG6 毛孢子菌 pNH181 1.49
荚膜甲基球菌 pDG6 甲基暖菌属175 pNH185 2.65
荚膜甲基球菌 pDG6 甲基孢囊菌属LW5 pNH187 1.09
荚膜甲基球菌 pDG6 无 pCDF1b 0.00
表9：当与许多groES/groEL伴侣蛋白同源物共表达时，荚膜甲基球菌sMMO在大肠杆菌是功能性的。
实施例10.几种异源性伴侣蛋白通过sMMO改善乙烷转化为乙醇的转化率
本实施例描述了来自Solimonas aquatica的sMMO具有改善的对乙烷作为底物的活性的能力，其中共同表达一组groES/groEL伴侣。
本发明其他地方描述的菌株NH283同时用两种质粒转化：pNH160(SEQ ID NO：33，含有对应于Solimonas aquatica mmoX、mmoY、mmoZ、mmoB、mmoC和mmoD基因的编码区)和质粒，所述质粒选自含有pNH188(SEQ ID NO：44)、pNH180(SEQ ID NO：40)、pNH185(SEQ IDNO：42)、pNH187(SEQ ID NO：43)和pCDF1b(SEQ ID NO：20)的质粒组。(含有来自微生物Solimonas aquatica、荚膜甲基球菌、甲基暖菌属175、甲基孢囊菌LW5的密码子优化的groES/groEL基因和对照载体pCDF1b)。在补充有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上选择这些转化体。
如上所述，选择这些转化中的每一个的一个菌落用于在补充有抗生素的2mL液体LB培养基中生长，并在37℃、280rpm振荡孵育。16小时后，将1mL培养物加入10mL补充有卡那霉素(50μg/mL)、壮观霉素(100μg/mL)、阿拉伯糖(1mM)和FeSO4(80μM)的LB中，以诱导单加氧酶的表达。将每个10mL培养物在37℃、280rpm振荡孵育。4小时后，将每种培养物离心并重悬于10mL PBS中以清洗细胞。将它们各自再次离心并重悬浮于补充有阿拉伯糖(1mM)、FeSO4(80μM)和甘油(0.4％终浓度)的10mL PBS中。将10mL体积在两个血清瓶之间平均分配并用丁基橡胶塞密封。通过一个血清瓶的塞子注入60mL空气，同时通过另一个血清瓶的塞子注入60mL乙烷。将所有血清瓶置于37℃、280rpm振荡孵育。24小时后，打开瓶子并使用本发明所述的技术对乙醇的存在进行取样。通过与标准曲线比较，菌株产生以下浓度的乙醇，如下表所示。
表10：Solimonas aquatica乙烷单加氧酶在大肠杆菌中具有许多groES/groEL对的功能
这些结果证明了即使aMMO和groES/groEL微生物为远亲关系，groES/groEL序列能够广泛改善aMMO的功能。
实施例11.远亲关系的二铁单加氧酶能够将乙烷转化为乙醇
本实施例描述了在大肠杆菌中表达的功能性二铁单加氧酶，其将乙烷转化为乙醇。假诺卡氏菌(Pseudonocardia)TY-7 prm1A和Solimonas aquatica mmoX在氨基酸水平上具有31％的同源性。
如本发明其他地方所述，菌株NH283同时与两种质粒发生转化：pNH100(SEQ IDNO：28，含有对应于假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)TY-7丙烷单加氧酶基因的编码区)和pNH177(SEQ ID NO：38，含有微生物假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)的密码子优化的groES/groEL基因)。如本发明其他地方所述，构建含有S.aquatica单加氧酶和S.aquatica groES/groEL的菌株。在补充有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上选择这些转化体。
在先前的实施例中描述了这些菌株的培养方法和乙醇浓度的测定方法。所述测定结果如表11所示。
表11：乙烷转化为乙醇与远亲关系的乙烷单加氧酶的比较
实施例12.改善大肠杆菌功能的可溶性甲烷单加氧酶的突变
本实施例描述了改善大肠杆菌中sMMO的功能的突变发现。改进sMMO的过程包括三个步骤：遗传多样性的产生，筛选多样化克隆文库以鉴定有益或中性突变，以及在新文库中这些突变的重组。此过程是迭代的，且可开始于以筛选存在的任何功能性酶序列。
遗传多样性可通过公知的技术产生，例如易错PCR和位点饱和诱变。使用例如上述实施例中描述的筛选步骤，筛选这些突变克隆以改善功能，分离具有改善或中性功能的克隆。(其他筛选也可使用，以鉴定、或间接鉴定改善的酶。)可对这些克隆进行测序，以鉴定与改进的功能相关的突变。重组突变可使用几种可能的方法中的一种进行处理，例如T-PCR、SOEingPCR、基因改组和商业上可获得的试剂盒，如快速更换多位点突变。这些重组文库可使用与试图改变的酶的特征相关的一系列筛选或选择来测试改良变体，例如活性或底物特异性。
实施例13.MMO突变改善大肠杆菌中的活性和特异性
本实施例描述了MMO的定向进化以及对MMO活性和乙烷和甲烷的底物特异性重要的位点和突变的鉴定。通过使用定点或随机诱变改变蛋白质的结构，可改善酶的特异性、溶解性、折叠和活性。通过随机易错PCR和定点诱变构建各种MMO文库。首先使用替代底物在96孔板中筛选文库以鉴定主要命中率。来自每个平板的最高命中率用于验证125mL玻璃瓶中乙烷到乙醇的转化。验证期间，初步筛选的约三分之一的命中显示乙烷到乙醇的氧化改进。一种赋予乙烷特异性的mmoX突变得到鉴定；在此质粒中，在mmoX(SEQ ID NO：10)的氨基酸位点240处存在氨基酸的N置换E，其随后命名为pBZ15(SEQ ID NO：16)。如本发明其他地方所述，测定突变菌株(BZ27)和野生型菌株(BZ25)的乙烷和甲烷氧化特性。
菌株 mmoX突变 甲醇(mM)/OD600 乙醇(mM)/OD600
BZ25 野生型 5.45 0.94
BZ27 E240N 2.67 1.61
表12：通过BZ25和BZ27氧化甲烷和乙烷。与野生型相比，突变mmoX(E240N)改善了对乙烷的活性。
本实施例还通过迭代轮次中产生和筛选酶多样性来证明定向进化，类似于自然选择在进化中如何运作。进一步诱变和组合mmoX中氨基酸位置61和421处的有益突变。表13中示出了已识别的mmoX变体表现出超过E240N(BZ27)的乙烷氧化活性改善。在pNH180(SEQ IDNO：40)存在下，pBZ13(SEQ ID NO：15)和mmoX中的E240N突变的组合导致相对于表达DG80的野生型mmoX超过几乎一个数量级的改善。
菌株 mmoX突变 乙醇(mM)/OD600
DG80 野生型 0.04
BZ27 E240N 0.32
BZ45 K61Y，E240N，S421A 0.47
BZ46 K61S，E240N，S421T 0.45
表13：mmoX中的突变改善了乙烷向乙醇的转化
携带在mmoX(K61S、E240N、S421T)中的三个突变的BZ46中的MMO质粒进行另一轮诱变和选择，导致MMO活性(表14)的进一步改善。mmoY(L67M)和mmoC(P167T)的突变被证明是有益的，这表明两个位置的重要性。BZ67中的MMO质粒，随后命名为pBZ23(SEQ ID NO：18)，用作更多次迭代轮诱变和选择的模板。
表14：MMO的多个亚基中的突变改善乙烷向乙醇的转化
实施例14.大肠杆菌中的杂合单加氧酶
与可溶性二铁单加氧酶(SDIMO)密切相关的序列可以是遗传多样性的来源，其可以重组，以鉴定改良的酶。在多亚基酶存在的情况下，例如SDIMO，改善酶复合物的一种方法是将来自一个SDIMO的亚基与来自另一个SDIMO的亚基组合。在最简单的例子中，来自一个SDIMO的单个亚基，将替换来自第二个亚基的同源亚基。一个更复杂的方案将交换多于一个亚基。甚至更复杂的方案将以允许所有可能组合的方式将来自多个同源SDIMO的所有亚基克隆到单个文库中，在此方式中允许所有刚好带一个亚基的组合。用于克隆此种文库的方法已描述在文献中，例如Golden Gate组装(Engler和Marillonnet，Combinatorial DNAassembly using Golden Gate cloning，Methods Molecular Biology，vol 1073，p.141-156,2013)和Gibson组装(D.Gibson et al.,Enzymatic assembly of DNA molecules upto several hundred kilobases,NATURE METHODS Vol 6,Issue 5,p.343-345,2009)。然后可使用例如本发明所述的测定法，对这些构建体进行筛选。
实施例15.将单加氧酶的产物连接到其他代谢途径：在单一细胞中
本实施例描述了单加氧酶在细胞中的表达，所述细胞另外包含消耗单加氧酶反应产物的代谢途径和/或产生单加氧酶反应的底物，从而将单加氧酶连接到细胞中的代谢途径。
本发明已经描述了用于构建含有单加氧酶的那些细胞的细胞和方法。这些单加氧酶和表达它们的核酸是模块化组分，其可添加到具有代谢途径的细胞中，例如，消耗单加氧酶反应的产物。这些代谢途径对于天然存在的菌株可以是内源性的，或者它们可从已经添加到细胞中的工程化核酸进行异源表达。
在一个实施例中，sMMO酶在巴斯德毕赤酵母中进行表达。此菌株在基本培养基中培养，甲烷作为其唯一的碳源。单加氧酶可将甲烷氧化成甲醇。巴斯德毕赤酵母内源性地含有消耗甲醇的途径。最终结果是能够通过异源表达的sMMO将甲烷转化为甲醇，随后利用内源于巴斯德毕赤酵母的酶途径，将甲醇转化为其他代谢物的菌株。
在类似的实施例中，sMMO酶在工程化的大肠杆菌菌株中进行表达。大肠杆菌不会自然地消耗甲醇，但如果这种工程化的大肠杆菌菌株表达消耗甲醇的途径，那么类似的代谢途径将起作用。所述菌株在含有甲烷的基本培养基中培养，并且在此大肠杆菌菌株中可使用类似的途径。
鉴于sMMO的许多底物和产物(表1中)，不难想到许多其他可与sMMO酶连接或通过sMMO酶进行连接的代谢途径。鉴定所有可能将sMMO用作可能的化学反应进行构建的代谢途径(即代谢物的“节点之间的连接”)，是适合于计算机化的任务。
实施例16.将单加氧酶的产物连接到其他代谢途径：多于一种细胞
本实施例描述了在多种细胞类型生物系统中单加氧酶的表达，另外多种细胞类型包含消耗单加氧酶反应产物的代谢途径和/或产生单加氧酶反应底物，从而将单加氧酶接入生物系统中的代谢途径。
本发明已经描述了细胞和构建含有单加氧酶细胞的方法。在概念上类似于阐述单一细胞中代谢途径的连接的实例的方式，代谢途径中涉及的代谢物可通过单一细胞中的酶或培养物中的多个细胞类型(即“共培养”)或在共培养物中进行转化，其中一些酶促步骤发生在发酵液中的任何细胞外，在发酵液体培养基中。
在单次发酵中多种菌株共培养的方法是明确的。菌株在单个发酵容器中可单独培养和组合培养。在一个实施例中，表达sMMO的大肠杆菌菌株与甲基营养型菌株如巴斯德毕赤酵母进行共培养。所述发酵可在缺乏碳源的基本培养基中进行。当菌株密封在发酵容器中时，可将甲烷加入容器中。大肠杆菌中的sMMO将甲烷转化为甲醇，这可扩散到大肠杆菌细胞之外，进入巴斯德毕赤酵母细胞，在其中可被消耗并转化到细胞内代谢物和/或用作生长的碳源。如果将巴斯德毕赤酵母菌株工程化以生成化学品，则大肠杆菌菌株可简单地将甲烷生物转化为甲醇，用作共培养酵母菌株内的代谢途径中的底物。
本实施例并不意味着限制甲烷进料发酵，因为此概念可延伸至许多底物(例如表1中所示的那些)到许多产品的生物转化，所述产品可用于类似或不同物种天然或工程化微生物中。原则上，只要交换的代谢物可从一个细胞扩散到另一个细胞，从原料到产物的整个代谢途径必须存在于单一细胞中，是没有理由的。如果代谢物不能自然地扩散到细胞内或细胞外，则转运蛋白或孔蛋白的表达可使代谢物主动或被动地转运到细胞内或细胞外。许多关于代谢物特异性或一般转运蛋白或孔蛋白的实例是公知的。
实施例17.大肠杆菌中改善作为主要或唯一碳源的乙醇上的有氧生长
之前已公开了能在乙醇上有氧生长的大肠杆菌菌株(D Clark&J E Cronan,Escherichia coli mutants with dehydrogenase and nitrate Escherichia coliMutants with Altered Control of Alcohol Dehydrogenase and Nitrate Reductase,141177–183,1980)；(J Membrillo-Hernández et al.,Evolution of the adhE geneproduct of Escherichia coli from a functional reductase to a dehydrogenase:Genetic and biochemical studies of the mutant proteins,275 Journal ofBiological Chemistry 33869–33875,2000)。
大肠杆菌在最小乙醇培养基上的生长速率取决于乙醇的同化速率(图1)。因此，可对菌株进行工程化或进化，以增加在基本乙醇培养基上的菌株生长速率。许多策略可用于改善乙醇的生长速率，例如(但不限于)化学诱变、途径中靶基因的过表达(例如醇-醛脱氢酶、乙醛酸分流酶)，过表达文库/转导来自在乙醇或乙酸上更快生长的菌株。
为了提高大肠杆菌在作为主要或唯一碳源的乙醇上的生长速率，构建了adhE(A267T，E568K)(SEQ ID NO：49)突变体的表达文库。
通过使用标准分子生物学方法，首先产生pNH045(SEQ ID NO：73)，构建adhE(A267T，E568K)突变体的质粒的表达文库。adhE基因可通过菌落PCR进行扩增，所述菌落PCR可由大肠杆菌NEB Turbo中制备的基因组DNA。设计引物，引入两种所需突变，通过Gibson组装技术(D G Gibson et al.,Enzymatic assembly of DNA molecules up to severalhundred kilobases.,6 Nature methods 343–345,2009)，将这些部分组装到来自新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)的质粒pMAL-c5x中。所述质粒含有IPTG诱导型Ptac启动子。通过菌落PCR筛选成功的转化体，并使用Sanger测序法进行测序。一个克隆，具有通过启动子、开放阅读框和终止子的正确序列，被命名为pNH045。
为了改变启动子强度，使用pNH045作为模板进行PCR。简并引物与简并碱基和非标准碱基一同使用(参考示例：https://www.idtdna.com/pages/docs/quick-looks/quick-look---degenerate-sequences-and-non-standard-bases.pdf？sfvrsn＝1)。用于在序列中的关键启动子核苷酸处引入变异的两个引物如下所示：
Ptac文库fwd＝gctgttSaMaattaatcatcggctcgKaHRatgtgtggaattgtgagcggataac
Ptac文库rev＝catYDtMcgagccgatgattaattKtSaacagctcatttcagaatatttgccagaacc。
利用Gibson方案进行自我连接，实施此PCR反应生成DNA片段。纯化此反应物并转化到所需的大肠杆菌菌株NEB Turbo中。这些克隆中的几个被证实在启动子区域含有可变序列。从琼脂平板上刮下菌落，通过微量制备提取组合在单个DNA文库中，并命名为pNH069L。
乙醇作为主要或唯一碳源和能源，用于培育adhE(A267T，E568K)，其最佳表达水平的辨别是一个直接的生长竞争。通过电穿孔，将质粒文库pNH069L转化到目的大肠杆菌菌株(例如BL21)中。次日从琼脂平板上刮下这些细胞，并在诱导条件下(例如用IPTG，饱和终浓度为1mM)，所需温度(例如37℃)下，在用乙醇作为唯一碳源的基本培养基中对其进行培育。基本乙醇培养基可含有标准M9盐配方以及硫胺素和乙醇，最终浓度为1％，尽管其他基本培养基配方也已描述在(J Tamarit,Identification of the Major Oxidatively DamagedProteins in Escherichia coli Cells Exposed to Oxidative Stress,273 Journal ofBiological Chemistry 3027–3032,1998)中。通过此种培养基对这些细胞进行传递，可使生长最快的菌株达到培养物种群中占支配地位。然后将所述培养物在富含培养基(LB+羧苄青霉素抗生素，100μg/mL)上进行划线，以分离单个克隆。然后将这些中的每一种在基本乙醇培养基中进行培育，以与生长于基本葡萄糖培养基的菌株和对照菌株(例如DC272)的生长速率进行比较(J Membrillo-Hernández et al.,Evolution of the adhE geneproduct of Escherichia coli from a functional reductase to a dehydrogenase:Genetic and biochemical studies of the mutant proteins,275 Journal ofBiological Chemistry 33869–33875,2000)。
实施例18.改善大肠杆菌在乙醇上的生长
本实施例描述了一系列基因过表达，其允许大肠杆菌在许多浓度的乙醇中强健生长。这些基因来自异源生物或来自大肠杆菌。
先前的工作已经表明，在大肠杆菌adhE-A267T和E568K(SEQ ID NO：49)中引入两个点突变足以使大肠杆菌在乙醇上生长。AdhE是一种双功能酶，其可作为醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ACDH)。基于我们自己的工作和还公布了此酶的特征，我们确定adhE(A267T、E568K)的ADH活性可能限制低浓度的乙醇的应用，因为它具有高的乙醇KM。
我们寻找在低乙醇浓度下具有高活性的新酶途径。我们从天然在乙醇上生长的生物体中鉴定了一组ADH和ACDH酶，并合成了相关基因的密码子优化版本。我们还包括来自大肠杆菌的基因，这些基因已被证明进行所需的化学反应。使用Gibson组装将所有可能的双基因组合的操纵子构建到Ptac启动子控制下的pBR322起源质粒中，并且使用核糖体结合位点中的简并碱基同时改变这些基因的表达水平。一些菌株将从基因组表达的adhE(A267T，E568K)与由质粒过表达的单个ADH基因组合。筛选得到的菌落在宽范围的乙醇浓度下生长。在将细胞接种到基本乙醇培养基中20小时后测定光密度。表15示出了结果。野生型大肠杆菌不在任何浓度的乙醇上生长，并且ADH和ACDH的不同组合赋予不同大小的生长益处。
以下描述了培养菌株和测定菌株在乙醇上生长的方法。将菌株在补充有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中培养，在37℃下过夜生长，然后通过旋转培养物来清洗，并在磷酸盐缓冲盐水培养基(PBS)中清洗两次。基本培养基BEM0配制如下。首先，将1000x金属溶液混合，其中含有下列化合物，其浓度为：0.1M FeCl3*6H2O，1M CaCl2，1M MnCl2*4H2O，1MZnSO4*7H2O，0.2M CoCl2*6H2O，0.2M NiCl2*H2O，0.1M NaMoO4*2H2O，0.1M Na2SeO3*5H2O，0.1MH3BO3。称为BEM0的基本培养基含有(在ddH2O中)：25mM(NH4)2SO4，60mM KH2PO4，50mMNa2HPO4，1mM MgSO4，0.15％LB，1mMIPTG和0.1％1000x金属溶液，加上所需浓度的乙醇。然后将细胞重悬于含有不同浓度乙醇的基本BEM0培养基中，起始OD600为0.1。将这些培养物等分到96孔板中，密封，并在37℃下振荡培养过夜20小时。取样100μL培养基，在600 nm测定吸光度。
表15：改进的乙醇同化途径使得在宽范围的乙醇浓度下更快的生长。数据来自两种独立培养物的平均测定值。
通过小量制备从LC292分离的质粒pLC99(SEQ ID NO：27)。分离出具有相似生长表型的另一个克隆，其质粒命名为pLC100(SEQ ID NO：23)。随后将两种质粒用于后续实验，以赋予大肠杆菌菌株改善的乙醇同化特性。
实施例19.大肠杆菌中合成乙烷营养物
本实施例提供了在作为主要或唯一碳源的乙烷上能够生长的大肠杆菌菌株的描述。
由于本发明和其他地方已经描述了大肠杆菌菌株(D Clark&JE Cronan，Escherichia coli mutants with dehydrogenase and nitrate Escherichia coliMutants with Altered Control of Alcohol Dehydrogenase and Nitrate reductase，141177-183,1980)和(J Membrillo-Hernández et al.,Evolution of the adhE geneproduct of Escherichia coli from a functional reductase to a dehydrogenase:Genetic and biochemical studies of the mutant proteins,275 Journal ofBiological Chemistry 33869–33875,2000)，其能够在作为主要或唯一的碳源和能源的乙醇上生长，这些菌株可以是能够在乙烷上生长的基础菌株，提供了可以表达能够将乙烷转化为乙醇的功能性酶或酶复合物。
存在能够将烃或烷烃转化为醇的酶。这些酶类包括可溶性甲烷单加氧酶(sMMOs)、颗粒型甲烷单加氧酶、混合型甲烷单加氧酶、烷烃/烯烃单加氧酶、甲苯单加氧酶、一些铵单加氧酶和一些P450单加氧酶。然而，迄今为止，没有任何团队的报道描述了在大肠杆菌中能够将乙烷氧化成乙醇的单加氧酶的成功、功能性表达。
使用标准分子生物学技术，这些酶可与任何辅助蛋白、蛋白质折叠伴侣和/或电子工体介质/还原酶一同表达。可从天然生物中提取的DNA表达基因，并将其克隆到适合大肠杆菌的表达载体中。可使用标准技术将这些载体转化到大肠杆菌中，例如电穿孔。或者，可设计和构建DNA以允许基因整合到大肠杆菌染色体中，使得基因的表达将产生所需的蛋白质组分。另一种选择是使用诸如IDT或DNA2.0等供应商合成基因，并由质粒或染色体基因座表达基因。合成的DNA允许研究人员在基因的每个位置选择所需的密码子，并可用于优化核酸序列的表达。合成的DNA还允许选择多顺反子操纵子中基因之间的核酸序列。这些基因或操纵子可由在大肠杆菌中起作用的任何启动子表达，包括最充分研究的启动子，例如Ptac、Plac、Ptrc、Pbad(其是诱导型的)和PT5(其是组成型的)。
所述这些单加氧酶复合物可在大肠杆菌中表达。表1中给出了可将乙烷氧化成乙醇的单加氧酶的实例。这组单加氧酶并不意味着限制，而是仅作为能够将乙烷氧化成乙醇的一组实例。很明显，通过简单的BLAST搜索(S Altschul等，Basic Local AlignmentSearch Tool，215 J Mol Biol.403-410,1990)，人们可识别与表16中列出的组密切相关的替代单加氧酶。
表16.可氧化乙烷的单加氧酶的实例
融合单加氧酶spmoB(R Balasubramanian etal.,Oxidation of methane by abiological dicopper centre.,465 Nature 115–119,2010)包含来自荚膜甲基球菌(Bath)的pMMO复合物的两个融合结构域。已经证明spmoB在大肠杆菌中表达时不可溶，但它可在体外提取并重新溶解，其方法证明在氧化甲烷时具有一些功能。所述spmoB酶可在同时表达蛋白质折叠伴侣蛋白的大肠杆菌菌株中表达，例如来自大肠杆菌的groES/groEL或来自天然生物体荚膜甲基球菌。spmoB也可从在大肠杆菌的内部和外部质膜之间靶向所述酶到周质空间的构建体表达。由于spmoB酶是从pmoB蛋白的周质部分取得的结构域的融合，因此spmoB可在周质中正常发挥作用。先前已描述了周质靶向序列。
颗粒甲烷单加氧酶(pMMO)还可在大肠杆菌中将乙烷氧化成乙醇。所述蛋白质复合物由三个亚基组成，且位于天然生物的内膜中。为了在大肠杆菌中成功表达pMMO，必须将正确的N-末端前导序列与三个亚基中的每一个正确融合。
用于将乙烷转化为乙醇的单加氧酶的成功表达的测定可以是在作为主要或唯一碳源的乙烷上的大肠杆菌菌株的生长。大肠杆菌宿主菌株可选择能够在作为主要或唯一碳源的乙醇上生长的菌株，因此任何将乙烷转化为乙醇的功能性乙烷单加氧酶均能够为细菌的生长和繁殖提供碳基底物。最小盐介质提供除碳源之外的必需营养素来维持细菌。用于大肠杆菌的最小盐培养基可基于微生物学中广泛使用的M9配方，以及单加氧酶功能可能需要的必需矿物质，例如铁或铜。可将培养基和含有单加氧酶的菌株或单加氧酶库接种到无菌瓶中，并使用例如丁基橡胶塞密封。然后，使用注射器和针头，可将乙烷气体注入培养物上方的顶部空间。此密封的瓶子可长时间培养以使乙烷溶解到培养基中并使细胞消耗乙烷并生长。相对于未注入乙烷的对照，可通过增加培养物的光密度，或通过实验和对照计算菌落形成单位来测定生长。
在一些情况下，通过乙烷氧化生成乙醇的量的速率对于菌株生长来说太慢。然后可在含有有限浓度乙醇的培养基中培养菌株，使其具有适度的生长速率-仍然受到可用碳量的限制。任何细胞，其含有制造甚至少量乙醇的功能性单加氧酶，均具有生长优势，因为碳是此实验设计中生长的限制因素。这些培养物可连续生长，如在生物反应器、浊流抑制器或恒化器中，或者它们可从一个瓶子连续传代到下一个瓶子，以便允许在更长的时间段内生长。微生物细胞生长的指数速率是此策略的关键优势。
以下描述了为证明大肠杆菌中的合成乙醇营养素而进行的实际工作。具体地，所述实施例的此部分描述了含有功能性sMMO和乙醇同化途径的菌株的构建和测试，所述菌株能够在作为主要或唯一碳源的乙烷上生长。
NH566的菌株构建
以下列步骤构建菌株NH566。如本发明其他地方所述，构建质粒pBZ15(SEQ ID NO：16)。通过将编码lacI-Ptrc-adh(嗜热脂肪芽孢杆菌)-acdH(克鲁维氏梭菌)乙醇同化途径的来自pLC99(SEQ ID NO：27)的DNA片段加入到pBZ13中来克隆质粒pNH225(SEQ ID NO：45)，其含有来自大肠杆菌的groES/groEL的表达盒和来自荚膜杆菌的groES/groEL的表达盒。如上所述构建菌株NH283。NH566选自采用质粒pBZ15(SEQ ID NO：16)和pNH225(SEQ IDNO：45)进行转化的NH283的转化体。
采用乙烷相对于空气来培养NH566
将NH566划线到补充有壮观霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上，并在室温下温育3天。将单个菌落挑选到补充有壮观霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的1mL液体LB液体培养基中，并在37℃下，以280rpm振荡生长。4小时后，将上述1mL培养物加入到9mL相同的培养基中，并在37℃、280rpm下再生长2小时。将上述10mL培养物离心并在10mL PBS中清洗一次。由此，将1mL PBS再次离心并重悬于10mL补充有乙醇的BEM4培养基中至终浓度为0.5％(v/v)。将此培养物置于37℃，以280rpm振荡23小时。5mL所述培养物离心，弃去上清液。将沉淀重悬于10mLPBS中以清洗。所述悬浮液再次离心，弃去上清液，将沉淀重悬于不含任何乙醇的10mL BEM4基础培养基中。(称为BEM4的基本培养基含有(在ddH2O中)：50mM KH2PO4、50mM Na2HPO4*7H2O、1mMMgSO4、0.15％LB、6.25mM谷氨酰胺、80μM FeSO4、0.1mM CaCl2、1mM IPTG、0.1％1000x金属溶液和1mM阿拉伯糖(需要诱导启动子pBAD)，以及所需浓度的乙醇。)将4.5mL所述培养物移液到两个血清瓶，每一个均用丁基橡胶塞密封。根据需要，初始细胞密度通过OD600测定，并且发现其约为0.5。在一个血清瓶中，使用注射器注射60mL空气，而在另一个血清瓶中，使用注射器注射60mL乙烷。将血清瓶在37℃温育，以280rpm振荡。孵育20小时、46小时和64小时后，使用小注射器通过橡胶塞对两个血清瓶取样。通过OD600测定两种样品的细胞密度，并通过在LB琼脂平板上铺板过夜进行菌落计数。图7示出了两个血清瓶的OD600测定的时间进程，其表明乙烷进料的培养物生长至比其起始密度更高的OD600，而空气进料的培养物由于细胞活力的丧失而密度下降。由于血清瓶中存在乙烷而导致的细胞密度增加证实了细胞能够代谢乙烷。通过从46小时和64小时时间点计数琼脂平板上的菌落形成单位来确认乙烷引起的细胞活力增加。在46小时时，相比空气进料的培养物中的菌落，来自乙烷进料的培养物中的菌落多1.44倍。直至64小时，这个比例增加到1.75倍。
实施例20.在大肠杆菌中将乙醇生物转化为游离脂肪酸
本实施例描述了由乙醇作为原料增加大肠杆菌中脂肪酸生成量的潜在途径。本实施例还描述了由乙醇增加大肠杆菌中脂肪酸生成量的工作。
先前的工作已证明使用葡萄糖或其他糖混合物作为原料从大肠杆菌中过量生成脂肪酸和衍生物的能力(H Cho&J.E.Cronan,Defective Export Of A PeriplasmicEnzyme Disrupts Regulation Of Fatty Acid Synthesis,Journal of BiologicalChemistry 2704216–4219)。糖被代谢成作为代谢的中心节点的乙酰辅酶A，并且细胞使用乙酰辅酶A通过脂肪酸生物合成途径产生脂肪酸。
先前的工作还表明，可在有氧条件下分离具有消耗作为主要或唯一碳源和能源的乙醇的能力的大肠杆菌突变体(D Clark&J E Cronan,Escherichia coli mutants withdehydrogenase and nitrate Escherichia coli Mutants with Altered Control ofAlcohol Dehydrogenase and Nitrate Reductase,141177–183,1980)。在某些情况下，此种能力可追溯到天然大肠杆菌基因adhE的过表达，而在其他情况下，在adhE基因中发现了突变，似乎进一步提高了大肠杆菌在乙醇上的生长速率(J Membrillo-Hernández et al.,Evolution of the adhE gene product of Escherichia coli from a functionalreductase to a dehydrogenase:Genetic and biochemical studies of the mutantproteins,275 Journal of Biological Chemistry 33869–33875,2000)。所述adhE基因编码醛-醇脱氢酶，其具有醇脱氢酶和辅酶A依赖性乙醛脱氢酶活性。
为了生成可在有氧培养条件下将乙醇转化为脂肪酸的大肠杆菌菌株，adhE基因(或其突变体，如adhE(A267T、E568K))可由质粒或染色体基因座过表达。已描述了用于在大肠杆菌中表达文库的标准方法，其涉及用简并寡核苷酸克隆所述基因以在关键位置，例如核糖体结合位点或启动子的内部使所述碱基对随机化。此文库可用于生成一组不同的大肠杆菌菌株，所述大肠杆菌菌株在adhE的表达水平不同。由于目的是鉴定可在作为主要或唯一碳源的乙醇上生长最快的菌株，因此可在此条件下，在单一培养物中测试所述大肠杆菌文库。增长最快的菌株将胜过其他菌株，成为混合群体中最常见的基因型，并且可通过标准微生物学方法进行分离，并作为克隆群相互重新测试。使用此技术，已在大肠杆菌菌株如NEB Turbo、BL21(DE3)和EPI300中鉴定出最佳水平的adhE(A267T、E568K)表达。
在大肠杆菌中由葡萄糖或其他糖混合物生成脂肪酸已在别处示出(H Cho&J ECronan,Defective Export Of A Periplasmic Enzyme Disrupts Regulation Of FattyAcid Synthesis,Journal of Biological Chemistry2704216–4219)。硫酯酶，例如大肠杆菌'tesA或加州月桂(U.californica)'fatB1(L Yuan et al.,Modification of thesubstrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by proteinengineering.,92Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 10639–10643,1995)，由质粒或染色体基因座在大肠杆菌中表达。所述硫酯酶水解酰基-ACP键并释放脂肪酸。类似于前一段所述，表达文库可用于在所需培养条件下将硫酯酶的表达调节至最佳水平。
为了生成能够由乙醇生成脂肪酸的大肠杆菌菌株，乙醇消耗菌株可用作表达所述硫酯酶文库的质粒的宿主。筛选中等数量的克隆，例如小于100，在给定培养条件下，足以找到具有最佳水平的硫酯酶表达的克隆。
先前已描述了用于从培养液中鉴定脂肪酸的分析方法(S Del Cardayre,USpatent no.20100257778,2010)。简言之，将培养物与等体积的有机溶剂(例如乙酸丁酯)混合，并搅拌以使脂肪酸分离成有机层。离心样品以将有机层与水层分离。可在气相色谱仪上检测少量有机层以鉴定脂肪酸峰。
本实施例的此部分描述了实际进行的工作，其增加了在大肠杆菌中由乙醇生成脂肪酸的量。菌株DC272来自耶鲁大学的大肠杆菌遗传库中心(E.coli Genetic StockCenter)。使用Datsenko和Wanner的方法缺失araBAD操纵子以生成菌株LC55(DC272araBAD::cat)。将编码来自加州月桂(Umbellularia californica)的fatB1的合成DNA经密码子优化，购自商业供应商(Integrated DNA Technologies)，并在含有复制p15a起源的标准克隆载体中克隆到bla基因后面的操纵子中的质粒(赋予对氨苄青霉素的抗性)中。在验证DNA序列之后，将所述质粒(命名为pBZ22，SEQ ID NO：56)转化到LC55中，从而生成菌株NH671。作为对照，用含有相同抗生素抗性(bla)的不同质粒转化LC55。
荧光尼罗红(Nile Red)测定法用于如下测定NH671的游离脂肪酸生成量。将两种菌株(NH671和对照)接种于补充有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃、280rpm下过夜。16小时后，将10μL过夜培养物转移到2mL BEM0培养基(本发明别处描述的组合物加上0.5％终浓度的乙醇)中并盖紧。两天后，对培养物进行采样并将细胞密度标准化。从每种培养物中取出100μL样品并与0.5μL尼罗红储备溶液(250mg/mL的DMSO溶液)混合，如Hoovers所述(Hoovers et al.,Bacterial production of free fatty acids fromfreshwater magroalgal cellulose,Appl.Microbiol.Biotechnology,Vol.91(2),2011)。使用485 nm的激发波长和590 nm的发射波长测定荧光。
空白培养基对照用于测定背景荧光并测定296计数。菌株NH671测定5950计数，而所述对照菌株(不含fatB1基因)测定2151。这对应于由于样品中的游离脂肪酸导致的高2.77倍的荧光。
实施例21.在大肠杆菌中将乙醇生物转化为琥珀酸
为了构建能够将乙醇转化为琥珀酸的菌株，通过缺失iclR和通过减少或去除编码琥珀酸脱氢酶的sdhAB的表达来修饰大肠杆菌菌株。本实施例描述了具有将乙醇转化为琥珀酸的能力的两种菌株的构建，以及用所述菌株进行转化的方法。
NH533和NH610的菌株构建
通过缺失大肠杆菌菌株NEB Express(New England Biolabs，BL21-衍生物)中的三个遗传基因座来产生能够生成琥珀酸的菌株。使用Datsenko和Wanner(2000)的方法依次删除三个基因座(araBAD、iclR和sdhAB)。简言之，使用与靶基因座具有同源性的引物从质粒pKD3或pKD13扩增缺失盒。使所述菌株为电转化感受态并用缺失盒进行转化。通过菌落PCR验证具有缺失的菌株，并使用pCP20除去标记，如其他地方所述，从而留下FRT瘢痕。所得菌株(NEBExpressΔaraBAD::FRTΔiclR::FRTΔsdhAB::FRT)命名为LC344。然后用质粒转化所述菌株，所述质粒赋予乙醇、pLC100(SEQ ID NO：23)改善的同化作用，并命名为NH533。
如上所述，通过从NEB Express依次删除araBAD和iclR来构建菌株NH610。为了减少sdhAB基因的表达，在不完全删除它们的情况下，构建了与sdhAB操纵子的3'末端同源的DNA片段以及Ptrc启动子和氯霉素抗性标记，从而以与sdhAB基因(SEQ ID NO：47)转录相反的方向指导Ptrc启动子。如上以及其他地方所述，使用pKD46作为λ红系统将所述DNA盒整合到菌株中。在补充有氯霉素(17μg/mL)的LB琼脂平板上挑选转化体。然后用pLC100(SEQ IDNO：23)转化所得菌株，以提高将乙醇吸收同化为中心代谢的能力。从所述转化中选择NH610作为单个克隆。
用NH533将乙醇生物转化为琥珀酸
将NH533直接从甘油原液接种到1mL补充有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，并置于37℃、280rpm的振荡培养箱中过夜。次日清晨，将所述菌株以1：100稀释到2mL补充有羧苄青霉素的LB液体培养基中，并在37℃、280rpm下生长4小时。4小时后，将所述菌株在2mL PBS中洗一次，并重悬于1mL PBS+甘油(0.8％终浓度)+FeSO4(80μM)+IPTG(1mM)+乙醇(0.5％v/v)中。将管盖紧并置于37℃、280rpm下48小时。
当生物转化在48小时完成时，将培养物以16krpm离心2分钟，并将上清液取样到单独的管中。使用配备有Phenomenex Synergy HydroRP 5μm柱、20mM KH2PO4(pH 3)流动相的Shimadzu 10AVP，以等度梯度，将所述样品用于琥珀酸的HPLC分析。使用UV检测器在200 nm处检测琥珀酸。用不同已知浓度的琥珀酸水溶液校准HPLC。使用这些读数作为标准曲线，确定NH533将乙醇转化为0.5mg/mL琥珀酸。
用NH610将乙醇转化为琥珀酸
将菌株NH610直接从甘油原液接种到2mL补充有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，并置于37℃、280rpm的振荡培养箱中过夜。次日清晨，将所述菌株以1：100稀释到2mL补充有羧苄青霉素的LB液体培养基中，并在37℃、280rpm下生长4小时。4小时后，将所述菌株在2mL PBS中洗一次，并用25μL接种到含有0.5％终浓度乙醇的1mL BEM0培养基(本发明其他地方所述)中。将管盖紧并置于37℃、280rpm下48小时。48小时后，将培养物以16krpm离心2分钟，并将上清液取样到单独的管中。使用上述方法将所述样品用于琥珀酸的HPLC分析。使用标准曲线，确定NH610将乙醇转化为0.41mg/mL琥珀酸。
实施例22.使用单一培养物在大肠杆菌中将乙烷生物转化为琥珀酸
本实施例描述了在大肠杆菌工程化菌株的培养物中将乙烷转化为琥珀酸。为了最终证明所生成的琥珀酸来自乙烷，实验用13C标记的乙烷进行，并且观察到测定的琥珀酸中很大一部分是13C标记的。
NH606的菌株构建
通过以下步骤构建菌株NH606。首先，使用Datsenko和Wanner(2000)的方法，使用提供对卡那霉素耐药的FRT侧翼盒，从大肠杆菌菌株NEB表达(NEB Express)中依次删除基因iclR、sdhAB和araBAD。如其他地方所述，使用pCP20去除抗生素抗性盒，在三个基因座中仅留下FRT瘢痕。然后使所述菌株NH558为电转化感受态并用质粒pBZ15(SEQ ID NO：16)和pBZ13(SEQ ID NO：15)进行转化，如本发明所述，并在补充有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上挑选转化体。在补充有抗生素的LB中培养NH558的单个菌落，使其为电转化感受态，并用pLC99(SEQ ID NO：27)进行转化，所述质粒赋予了改善的乙醇同化作用，如本发明所述。在补充有卡那霉素(25μg/mL)、壮观霉素(50μg/mL)和羧苄青霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上选择这些转化体。选择其中一个菌落用于进一步研究并命名为NH606。
将13C-乙烷生物转化为琥珀酸
将菌株NH606接种到1mL补充有羧苄青霉素(50μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的LB中16小时。将体积为0.2mL的培养物转移到1.8mL补充有上述抗生素以及1mM L-阿拉伯糖、1mM IPTG、50μM柠檬酸铁和200μML-半胱氨酸的LB培养基中。4小时后，将所述培养物以4000rpm离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬浮于等体积的PBS中。将样品再次离心并重悬于BEM6培养基中至OD600为2.0。(称为BEM6的基本培养基含有(以ddH2O计)：50mM KH2PO4、50mM Na2HPO4*7 H2O、1mM MgSO4、0.15％LB、1.5625mM谷氨酰胺、80μMFeSO4、0.1mM CaCl2、1mM IPTG、0.1％1000x金属溶液和1mM L-阿拉伯糖(需要诱导启动子pBAD)，加上所需浓度的乙醇)。从所述培养物，将500μL移液到两个无菌玻璃小瓶中的每一个中，每个小瓶包含单个玻璃珠以防止细胞聚集。用橡胶塞密封这些小瓶。使用注射器，将1mL 13C标记的乙烷注入其中一个小瓶中的液体上方的顶部空间中，同时将1mL空气注入另一小瓶中。将所有小瓶置于37℃、280rpm下。在37℃下孵育46小时后，将样品以16.1krpm离心2分钟。通过LC/MS/MS分析每个样品的13C标记的琥珀酸，并与分析标准进行比较。将60μL甲醇与20μL样品混合并离心。将20μL上清液用12.5％甲醇0.1％甲酸稀释5倍。通过在12.5％甲醇0.1％甲酸中连续稀释琥珀酸储备溶液来制备校准标准品。在注入LC/MS/MS之前，将60μL上述样品与60μL内标溶液(2-HG-d3的12.5％甲醇0.1％甲酸溶液)混合。HPLC是Shimadzu LC-20AD，具有Agilent Zorbax SB-C18柱(3×100 mm，3.5μm)。流动相为0.005％甲酸、0.5mM乙酸铵水溶液以及甲醇：水(95：5)与0.5mM乙酸铵的混合物。流速为0.5mL/min，柱保持在室温。使用具有涡轮离子喷涂和负电离的AB Sciex API4000系统进行质谱分析。通过测定m/z值为117.0(对于12C琥珀酸)、118.0(对于单一标记的13C琥珀酸)和119.0(对于双标记的13C2-琥珀酸)的峰高来检测琥珀酸。
此次分析的结果如图8所示。接受空气注入的小瓶不产生可检测的13C-琥珀酸，而接受13C-乙烷注入的小瓶产生1.14mg/L的13C-琥珀酸。此结果最终显示了从乙烷到琥珀酸的整个途径的功能。其是在大肠杆菌中用于由烃原料生成工业产品的途径中的功能性可溶性二铁单加氧酶的首次报道。
实施例23.在大肠杆菌共培养物中将乙烷转化为琥珀酸
本实施例描述了在含有两种工程微生物的培养物中将乙烷转化为琥珀酸。一种微生物是设计用于将乙烷转化为乙醇的大肠杆菌菌株。另一种微生物是设计用于将乙醇转化为琥珀酸的大肠杆菌菌株。
BZ55和NH585的菌株构建
以下列步骤构建菌株BZ55。首先，如本发明其他地方所述构建菌株NH283。接下来，通过电穿孔将质粒pBZ13(SEQ ID NO：15)转化到NH283中。质粒pBZ23(SEQ ID NO：18)含有来自荚膜甲基球菌(Bath)的sMMO以及对以下基因的突变：mmoX(K61S，E240N，S421T)，mmoY(L67M)。随后用所述第二质粒pBZ23通过电穿孔转化具有质粒pBZ13的菌株NH283，并在补充有卡那霉素(50μg/mL)和壮观霉素(100μg/mL)的LB培养基上选择。
13C-乙烷生物转化为琥珀酸
将BZ55接种到2mL补充有壮观霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，并将NH585接种到2mL补充有羧苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中。将两种培养物在37℃、280rpm下孵育过夜。16小时后，将1mL BZ55培养物转移至9mL LB+壮观霉素+卡那霉素+柠檬酸铁(III)(50μM)+L-半胱氨酸(200μM)+L-阿拉伯糖(1mM)中，而将200μLNH585培养物转移至10mL LB+IPTG(1mM)中。将两种10mL培养物均在37℃、280rpm下温育4小时。4小时后，将两种培养物以3krpm离心5分钟。将沉淀悬浮于30mL PBS中清洗并再次离心。然后将NH585沉淀悬浮于5mL PBS+甘油(0.4％)+IPTG+阿拉伯糖+柠檬酸铁(III)+L-半胱氨酸中。将所述悬浮液再次用于悬浮BZ55沉淀，得到5mL两种菌株的混合物。从此混合物中，移液1mL到两个小瓶中的每一个中，并用橡皮塞密封。使用注射器将1.5mL空气注入其中一个培养物上方的顶部空间，而另一个注射器用于将1.5mL 13C标记的乙烷(Cambridge IsotopeLaboratories)注入另一培养物的顶部空间。将两个小瓶在37℃、280rpm下孵育。48小时后，将样品以16.1krpm离心3分钟，除去上清液并过滤。如上述实施例22中所述，通过LC/MS/MS分析这些滤液。表17中比较了注入空气样品和注入乙烷样品中琥珀酸的浓度(mg/L)。
条件 12C-琥珀酸 13C-琥珀酸
空气 52.1 1.05
13C-乙烷 56.6 1.85
表17：由13 C-乙烷进料引起的共培养物中琥珀酸生成量的比较
13C-琥珀酸的增加量证明了13C-乙烷通过细胞的代谢途径转化为13C-琥珀酸。值得注意的是，琥珀酸衍生物的较高背景水平来自甘油(其在实施例22中不存在)，并且可以看出相对于12C-琥珀酸生成量的微小变化，在13C-乙烷-进料条件下，13C-琥珀酸的百分比显著增加。13C-琥珀酸的这种大的百分比增加不可能由背景波动引起，而是必须来自13C-乙烷进料。
实施例24.在大肠杆菌中将乙烷转化为化学物质：乙烷转化为脂肪酸
本实施例描述了能够将乙烷转化为化学产品的大肠杆菌菌株。
可以将本发明所述的大肠杆菌菌株组合以生成能够将乙烷转化为脂肪酸的单一大肠杆菌菌株。原则上，可采用类似的策略来构建能够将乙烷转化为其他化学产品的菌株，从已经能够制造化学产品的菌株开始，并添加负责将乙烷转化为乙醇并最终转化为乙酰辅酶A的酶。
组合两种菌株的方法是本领域技术人员周知的。在最简单的情况下，负责关键功能(例如乙烷同化)的基因，定位于质粒，所述质粒可转化到已包含脂肪酸产物途径的大肠杆菌菌株中。或者，所述产物途径基因可定位于质粒，所述质粒可转化到消耗乙烷的大肠杆菌菌株中。
另一个可能的实施方案可包含两种大肠杆菌菌株，每种菌株具有整合到染色体中的遗传元件。在此种情况下，可通过PCR扩增单个遗传元件并转化到另一菌株中。另一种选择是利用转导在菌株之间使遗传元件移动。再有一种选择是通过偶联来利用可移动的遗传元件。再有一种选择是合成含有来自两种菌株的适当遗传元件的部分或全部合成染色体，并将DNA引入供体菌株。
如本发明所述，用于培养可消耗乙烷并生成脂肪酸的菌株的方法是直截了当的。简言之，大肠杆菌菌株可在富含培养基或基本乙醇培养基中生长，然后转移至不含碳源的基本培养基中。可将所述培养物转移至带塞的瓶中并用乙烷注入顶部空间。或者，所述培养物可在生物反应器中生长，并通过喷射连续进料乙烷。可通过有机溶剂萃取或离心或沉降或这些方法的组合来收集脂肪酸。
实施例25.鉴定改善单加氧酶功能的遗传元件
本实施例描述了遗传工程改造的宿主细胞的构建，其中编码工程化宿主细胞中未知功能的蛋白质或RNA的外源性基因表达的结果是工程化细胞在乙烷上的生长得到改善。本实施例进一步描述了天然的消耗碳氢化合物的生物体，其被修饰为以不同速率消耗乙烷，以鉴定乙烷消耗所必需的基因或酶。
可在互补文库中搜索宿主菌株缺失的蛋白质配偶体或伴侣蛋白，并且其表达增加了乙烷上的生长速率。本发明通过克隆含有来自具有单加氧酶或碳氢化合物氧化活性的天然微生物的随机基因组DNA片段的质粒来构建文库。从一种或多种此类菌株中分离DNA，消化或剪切成片段，并克隆到适合宿主菌株的质粒中。在某些情况下，为了在酵母宿主菌株中表达，酵母人工染色体可能是合适的。在一些情况下，为了在细菌宿主菌株中表达，粘粒或细菌人工染色体可能是合适的。在某些情况下，所述消化的基因组DNA与选择标记连接，并直接整合到宿主细胞染色体中。如本发明所述，可以测定生长速率或产物形成的改善程度。基因组规模分析可减少此类文库的大小，基因组交叉技术可鉴定与表达单加氧酶的生物体共有的、且不存在于工程化宿主中的基因(M G Kalyuzhnaya et al.,Functionalmetagenomics of methylotrophs,495 Methods in Enzymology 81-98,2011)。
功能丧失的菌株文库可用于鉴定将乙烷氧化成乙醇所必需的基因。本发明可在可以消耗碳氢化合物的天然微生物中产生具有随机遗传变化的菌株集合(“文库”)，并且其在乙烷上生长能力的降低(或丧失)可用于鉴定关键基因。然后可在工程化宿主细胞中表达这些基因，并使用乙烷作为碳源测试宿主细胞生长的改善程度。
此种类型的文库的一个实例是转座子文库。可在消耗天然碳氢化合物的生物体中生成大型文库。将此文库接种到含乙醇的琼脂平板上，然后复制到不含乙醇的琼脂平板上，但在气态乙烷存在下生长。乙烷氧化活性降低的突变体将能够在乙醇上生长，但乙烷上的生长速率会降低。可使用任意引物PCR方法或使用与转座子DNA共有的引物通过DNA测序鉴定突变。所述方法鉴定了在我们的合成乙烷营养物中测试的遗传元件，用于在乙烷进料的发酵中改善生长。转座子诱变的此实例是示例性的，并不意味着限制。筛选突变的消耗碳氢化合物的生物体的方法同样适用于其他诱变方法，例如但不限于化学诱变、紫外光诱导的诱变、定向诱变等。在这些情况下，通过全基因组测序鉴定相关突变可能是最有帮助的。
用于改善单加氧酶功能的另一种方法是蛋白质工程。有许多技术用于进行蛋白质工程。在其中一种方法中，通过易错PCR发现突变并筛选改善的功能。通过DNA测序鉴定这些突变，并且可构建重组文库，其中突变(有益的或中性的)可随机组合。构建重组文库的方法可选自一系列先前描述的方法，例如tPCR(A Erijman et al.,Transfer-PCR(TPCR):Ahighway for DNA cloning and protein engineering,175 Journal of StructuralBiology 171–177,2011)。可筛选所述重组文库以改善功能。改善最多的酶可进行测序，也可用作进一步工程的模板。
所有上述方法同样可以很好地应用于甲烷氧化菌。可由天然甲烷氧化菌的基因组DNA构建互补和过表达文库，用于在异源性宿主中表达。可以在甲烷氧化细菌中构建功能丧失的诱变文库和转座子文库以寻找关键的遗传元件。如上所述，蛋白质工程单加氧酶可改善对一系列底物(例如甲烷、乙烷、丙烷、萘等)的活性，条件是合适的测定技术(如本发明其他地方所述的比色测定法或醇测定法)可以适中的吞吐量使用。
实施例26.筛选eDNA文库用于乙烷单加氧酶功能或改善的单加氧酶功能
本实施例描述了环境DNA样品文库的构建和筛选，以便找到功能性乙烷单加氧酶或找到改善单加氧酶功能的组分。
如上述实施例中所述，可构建基因组DNA文库并筛选所述文库以获得所需功能。以类似的方式，可构建和筛选环境DNA文库。用于构建此类文库的方法描述于学术文献和其他地方(A Henne et al.,Construction of environmental DNA libraries inEscherichia coli and screening for the presence of genes conferringutilization of 4-hydroxybutyrate,65 Applied and Environmental Microbiology3901–3907,1999)；(S F Brady,Construction of soil environmental DNA cosmidlibraries and screening for clones that produce biologically activesmallmolecules.,2Nature protocols 1297–1305,2007)。简言之，从目的位置获取环境样品。在一个相关情况下，所述位置可以是已知使能够氧化碳氢化合物的微生物生长的区域。然后将整个样品的DNA与其他所有物质分离并纯化。所述DNA含有来自许多不同生物体的DNA的混合物。可以将此种提取的环境DNA克隆到质粒(有时称为粘粒或福斯质粒)中，使其适合插入可转化的微生物如大肠杆菌中。文库构建方案的最新研究进展使得能够构建极其庞大和多样化的文库。可在无数条件下筛选这些文库以鉴定有趣的特征，之后可提取并进一步研究可靠的基因。在此特定情况下，可使用上述选择方法来测试这些文库的乙烷单加氧酶活性。此外，可向所述筛选菌株添加表达已知乙烷氧化酶复合物的质粒或染色体遗传元件或一系列遗传元件。然后，可在所述菌株中筛选环境DNA文库，以鉴定可以实现或改善所需活性的遗传元件，在此情况下，实现或改善乙烷单加氧酶的活性。可改善功能的遗传编码元件的实例可以是蛋白质折叠分子伴侣蛋白(T Furuya et al.,The mycobacterialbinuclear iron monooxygenases require a specific chaperonin-likeprotein forfunctional expression in a heterologous host,280 FEBS Journal 817–826,2013)或有助于将金属中心正确组装在金属酶中的蛋白质。
实施例27.甲烷单加氧酶在谷氨酸棒杆菌中的功能性表达
本实施例描述了谷氨酸棒杆菌中功能性单加氧酶的表达。
质粒pNH238的构建
以下列方式构建质粒pBZ21(SEQ ID NO：17)。使用PCR生成两个片段，用引物oBZ095(SEQ ID NO：74)和oBZ096(SEQ ID NO：75)来扩增来自pBZ13(SEQ ID NO：15)的6.4kb片段，并用引物oBZ090(SEQ ID NO：76)和oBZ094(SEQ ID NO：77)来扩增来自pDG6(SEQID NO：22)的第二个片段(6.8 kb)。使用吉布森(Gibson)组装来分离和组合这些片段。将所得DNA转化到电转化感受态大肠杆菌中，并在补充有壮观霉素(100μg/mL)的LB琼脂上选择转化体。通过菌落PCR来鉴定正确的菌落并进行测试以确认单加氧酶活性。分离所述质粒并用作采用引物oNH600b(SEQ ID NO：78)和oNH601s(SEQ ID NO：79)的PCR扩增模板。用DpnI限制酶处理所得反应以除去质粒模板。PCR扩增用于生成第二DNA片段，其中pDG6(SEQ IDNO：22)作为模板，并使用引物oNH602b(SEQ ID NO：80)和oNH603(SEQ ID NO：81)。分离此两个片段，用吉布森组装进行组装，并转化到电转化感受态大肠杆菌中。在补充有壮观霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上选择转化体。通过菌落PCR鉴定正确的菌落。分离质粒并转化到大肠杆菌菌株ER2925(dam-dcm-菌株)中。所述这些菌落用于分离pNH238 DNA(SEQ ID NO：46)而没有dam或dcm甲基化从而有效转化成谷氨酸棒杆菌。根据van der Rest的方法使谷氨酸棒杆菌菌株NRRL B-3330为电转化感受态(van der Rest etal.,A heat shock following electroporation induces highly efficienttransformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA,Appl.Microbiol.Biotechnol.,Vol 52(4),1999)。在补充有卡那霉素(20μg/mL)的LBHIS琼脂平板上选择转化体。
将单个菌落(命名为NH686)接种到补充有山梨糖醇(20mM)和卡那霉素(20μg/mL)的LB中。将对照菌株谷氨酸棒杆菌NRRL B-3330接种到补充有山梨糖醇(20mM)的LB中。将两种菌株置于30℃下，以220rpm振荡。16小时后，将1mL培养物加至9mL补充有山梨糖醇(20mM)、L-阿拉伯糖(1M)和FeSO4(80μM)的LB中。含有pNH238质粒的菌株NH687也补充有卡那霉素。将所述这些菌株置于30℃、220rpm下6小时。然后将培养物以4krpm离心5分钟。将培养物在10mL PBS中洗一次，并将800μL移液到微量离心管中并沉淀。将这些沉淀重悬浮于250μL补充有香豆素(11mM)、山梨糖醇(0.1 M)、L-阿拉伯糖(1 M)和FeSO4(80μM)的PBS中。将所有离心管在30℃下孵育，以220rpm振荡。功能性单加氧酶将香豆素羟基化为伞形酮，其可通过荧光法测定。42小时后，取出管并离心。将150μL上清液移液至透明底板中，并在读板器上读取荧光。激发波长为360 nm，发射波长为460 nm。从对照菌株和NH687中减去培养基(缺少任何细胞)的背景荧光。发现NRRL B-3330的荧光为151，而表达单加氧酶的菌株NH687的荧光为664。荧光的这种显著增加证明了NH687中活性单加氧酶对底物的羟基化。
实施例28.在谷氨酸棒杆菌中将乙醇生物转化为氨基酸
已证明谷氨酸棒杆菌菌株过量生成谷氨酸(NRRL B-2784)或赖氨酸(NRRL B-3330)。所述这些菌株已在我们实验室进行了测试，并证明它们消耗作为唯一的碳源和能源的乙醇。在用乙醇作为唯一碳源的经修饰的基本培养基上生长可导致来自这些菌株的谷氨酸和/或赖氨酸的积累。细胞可在标准富含培养基，例如BHIS(AVertes et al.,MINIREVIEWManipulating Corynebacteria,from Individual Genes to Chromosomes,717633–7642,2005)中培养，然后转移至基本培养基配方(例如CGXII)中，但用乙醇代替葡萄糖作为碳源(AVertes et al.,MINIREVIEWManipulating Corynebacteria,fromIndividual Genes to Chromosomes,717633–7642,2005)。在另一种培养基配方中，谷氨酸棒杆菌菌株在含有M9盐类、2mM MgSO4、0.2mM CaCl2、10μM FeSO4、R5微量元素、4mg/L生物素和1％(v/v)乙醇的改良M9培养基中生长。将所述菌株接种到此培养基中，在30℃下孵育，以200rpm振荡。24小时后，菌株生长至OD600为1.5。可通过离心将细胞与液体培养基分离，并且可使用本领域技术人员已知的标准方法分析液体培养基中生成的谷氨酸或赖氨酸的量。
实施例29.在谷氨酸棒杆菌中将乙烷生物转化为氨基酸
本实施例描述了用于培养菌株以在谷氨酸棒杆菌中将乙烷原料生成氨基酸的菌株和方法。
来自上述的菌株能够在作为主要或唯一碳源的乙醇上生长。通过在此菌株中表达乙烷-氧化酶，可以构建能够将乙烷转化为氨基酸(例如谷氨酸或赖氨酸)的菌株。可以从表1中选择可在谷氨酸棒杆菌中氧化乙烷的酶，并且可从质粒或从染色体基因座进行表达。
此菌株可在富含培养基如BHIS中培养，然后转移至含有不含碳源的基本培养基(例如缺乏葡萄糖的CGXII)的密封血清瓶中。密封的瓶子可用乙烷注入到培养基上方的顶部空间，以提供碳源。或者，可在基本培养基中包括有限量的乙醇以通过乙醇同化途径调节细胞生长，或者为乙烷氧化起作用但不足以支持生长的情况提供一些碳。另外，可在生物反应器、恒化器或恒浊器中连续培养所述菌株以维持恒定的生长条件。
如上所述，可如上采用乙烷作为原料，并将其注入密封血清瓶中的培养物上方的顶部空间中来测试菌株NH686和NH687。
实施例30.甲苯-4-单加氧酶在巴斯德毕赤酵母中的功能性表达
上述单加氧酶可在酵母中从质粒或通过染色体整合来表达。可使用标准启动子和终止子来组装遗传构建体以驱动所需多肽的转录和翻译。通常使用的一些示例性启动子包括启动子PADH1、PTEF1、PTEF2、PGAP。一些示例性终止子包括TCYC1、TTEF1、TILV5、TGAP、TAOX1。这些遗传构建体可使用标准方法(例如电穿孔和化学转化)转化到酵母细胞中，如其他地方所述(J M Cregg et al.,Recombinant protein expression in Pichiapastoris.,16 MOLECULAR BIOTECHNOLOGY 23–52,2000)。可使用菌落PCR方法检查菌落的正确遗传特征。
用于测试功能性单加氧酶的酵母菌株的方法类似于上述大肠杆菌的方法。简言之，将酵母细胞在富含培养基(例如YPD)中培养，直至培养物达到等于约1.5的OD600，然后在基本培养基或PBS中洗。为了测试以萘作为底物的菌株活性，作为实例，将酵母细胞重悬浮于1mL含有萘的PBS中。然后将培养物在30℃孵育，以220rpm振荡16小时。然后，离心培养物以分离细胞，并用溶解在水中的固蓝(Fast Blue)B盐测定上清液和细胞沉淀物。如果培养物改变颜色，则生成1-萘酚。可以使用分光光度计在540 nm处读取颜色变化，并与不氧化萘的对照菌株进行比较。测试甲烷或乙烷氧化的方法是类似的，除了省略萘，将培养物接种到无菌密封的血清瓶中，并将甲烷或乙烷气体注入培养物上方的顶部空间。甲醇或乙醇的测定类似于本发明所述的测定方法。
在一个具体实例中，以下列方式构建巴斯德毕赤酵母菌株NH393，并观察到当进行如上测定时，将萘氧化成1-萘酚。设计两种质粒以含有来自门多萨假单胞菌KR1的甲苯-4-单加氧酶的六种基因，每种基因由其自身的启动子和终止子对进行表达。通过克隆标准载体和通过标准DNA合成技术(由外部供应商提供)合成的片段来构建这两种质粒(表达tmoA、tmoB、tmoC的pNH104是SEQ ID NO：29，和表达tmoD、tmoE、tmoF的pNH132是SEQ ID NO：30)。用限制酶BsaI消化这些质粒，并使用标准电穿孔技术转化到巴斯德毕赤酵母(NRRL Y-11430)中(J.Lin-Cereghino et al.,Condensed protocol for competentcellpreparation and transformation of the methylotrophic yeast Pichia pastoris,Biotechniques,vol.38.1,p.44-48,2005)。在补充有抗生素的YPD(250μg/mL的G418(遗传霉素)，25μg/mL的诺尔丝菌素)上选择转化体。将它们在相同的YPD+抗生素培养基上划线单个菌落，并通过菌落PCR检查所需DNA在适当的基因座处的正确整合。以此种方式分离菌株NH393，证实了表达甲苯-4-单加氧酶的DNA的整合。如上所述，测试所述菌株的萘氧化。当将固蓝B试剂与细胞沉淀混合并搅拌时，颜色变为紫色并仅伴随表达单加氧酶(NH393)的菌株，而不伴随对照菌株(Y-11430)。这表明所述可溶性二铁单加氧酶在巴斯德毕赤酵母中的功能性表达。据我们所知，这是在酵母细胞中功能性表达的异源可溶性二铁单加氧酶的第一个例子。
实施例31.甲烷单加氧酶在巴斯德毕赤酵母中的功能性表达
本实施例描述了甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母(也称为Komagataellaphaffii)中两种单加氧酶的功能性表达。
质粒构建
以下列方式构建质粒pNH166(SEQ ID NO：34)、pNH167(SEQ ID NO：35)、pNH172(SEQ ID NO：36)、pNH173(SEQ ID NO：37)。设计合成DNA以表达单加氧酶以及groES和groEL伴侣蛋白亚基的六个亚基。质粒pNH166和pNH172编码来自细菌菌株甲基孢囊菌属LW5的单加氧酶，质粒pNH167和pNH173编码来自细菌菌株Solimonas aquatica(DSM 25927)的单加氧酶。DNA由商业供应商(Gen9)合成。用限制酶XhoI消化所述这些序列。通过PCR扩增克隆载体，以在线性扩增子的末端提供序列，所述序列对应于待插入的所需DNA末端的同源序列。用限制酶DpnI处理所得反应混合物以除去背景质粒，仅留下扩增的DNA。使用DNA柱(ZymoResearch)纯化所述克隆载体和用于插入的XhoI消化的DNA。使用吉布森组装(New EnglandBiolabs)将插入物连接至所述克隆载体上。用DNA柱纯化使所述吉布森(Gibson)反应物并转化到电转化感受态大肠杆菌细胞中。分离转化的单菌落，并通过菌落PCR确认其正确性。所得质粒含有所需的插入物，其侧翼是与宿主中的染色体区域同源的序列(通过同源重组整合)。此外，所述质粒含有抗生素选择标记，其可用于分离已在预期位置成功整合所需DNA片段的宿主菌株的克隆。
菌株构建
将菌株MC100-3(其中两种醇氧化酶基因均缺失，防止甲醇降解)在5mL YPD培养基中生长，在220rpm和30℃下振荡至OD为约1.5。用限制性酶BsaI消化质粒以生成用于整合的线性片段。如上所述，通过DNA柱纯化所得反应，并以10μL进行洗脱。使用标准技术转化所述菌株(J.Lin-Cereghino et al.,Condensed protocol for competent cell preparationand transformation of the methylotrophic yeast Pichia pastoris,Biotechniques,vol.38.1,p.44-48,2005)。简言之，将培养物离心并在山梨糖醇(1 M)中洗两次并浓缩至100μL。从纯化的DNA洗脱中，将3μL与经清洗的细胞一同用于电穿孔试管中。将培养物在30℃和220rpm下回收并进行2小时，然后在YPD+抗生素琼脂平板上铺板。对于含有诺尔丝菌素抗性基因的整合盒，YPD平板含有浓度为25μg/mL的诺尔丝菌素。对于含有对遗传霉素具有抗性的基因(G418)的盒，YPD平板中G418的浓度为500μg/mL。
具体地，菌株NH461是MC100-3，其是具有使醇氧化酶Aox1p和Aox2p两者失活的突变的Komagataella phaffii，使得所述菌株不能降解或消耗甲醇。通过依次整合来自pNH172和pNH166的DNA盒来构建菌株NH509。将所述菌株作为单菌落进行分离，并通过菌落PCR进行确认，以将所需的DNA盒整合到预期的染色体位置。使用类似的方法由pNH173和pNH167生成菌株NH510。
甲烷氧化测定法
如本发明所述，进行测定菌株NH461、NH509和NH510的甲烷氧化。简言之，将菌株分别接种到1mL YPD中，并在30℃和220rpm下放置过夜。次日，使用500μL培养物将每种菌株在30℃和220rpm下传代培养到25mL YPD+FeSO4(80μM)中，进行6小时。将培养物以4krpm离心5分钟，并重悬浮于10mL磷酸盐缓冲盐水以及0.8％甘油和FeSO4(80μM)中。将所述这些细胞移液至血清瓶中，每瓶5mL，塞住并用丁基橡胶塞密封。使用注射器将一瓶顶部空间注入60mL空气，而另一瓶注入60mL甲烷气体。将这些密封的瓶子在30℃、220rpm下直立孵育。孵育72小时后，将瓶子从培养箱中取出并取样用于甲醇。甲醇的检测方法如本发明其他地方所述。使用酶测定法的市售试剂盒生成比色读数，其可使用已知甲醇浓度的标准曲线校准。此测定根据制造商的说明书进行。使用注入空气的样品作为对照，如上所述计算样品中甲醇的浓度。使用此方法，观察到所述菌株生成以下浓度的甲醇。菌株NH509生成20μM甲醇，NH510生成55μM甲醇，而对照菌株NH461几乎不生成甲醇(小于3μM，在测定的噪音内)。
表18：在巴斯德毕赤酵母中甲烷生物转化为甲醇
通过在这些菌株中将甲烷转化为甲醇证明了单加氧酶的功能性表达。
实施例32.蛋白质折叠伴侣蛋白改善巴斯德毕赤酵母中sMMO的功能
本实施例描述了由于蛋白质折叠伴侣蛋白的共表达而对巴斯德毕赤酵母中单加氧酶活性的改善程度。
本发明已描述了单加氧酶复合物的表达。简言之，不同的酶亚基分别从启动子进行表达，然后是从终止子进行表达。此外，可以相同的方式表达来自启动子和终止子的其他开放阅读框。一种此类其他蛋白复合物是细菌groES/groEL蛋白质折叠伴侣蛋白。以与所述伴侣蛋白有助于细菌中单加氧酶复合物活性的相同方式，将groES/groEL开放阅读框添加到酵母菌株中也将改善酵母细胞中单加氧酶的功能。
实施例33.在巴斯德毕赤酵母中将乙醇转化为苹果酸
本实施例描述了在巴斯德毕赤酵母的工程化菌株中将乙醇转化为苹果酸。
构建菌株NH038以组成型表达从丙酮酸至苹果酸的途径以及苹果酸转运蛋白，从而从细胞输出苹果酸。构建质粒pNH001(SEQ ID NO：82)，其与位于KanMX基因盒两侧的HSP82基因座具有750bp同源性，所述KanMX基因盒提供对G418/遗传霉素抗生素的抗性。由其各自菌株制备的基因组DNA来扩增含有编码来自巴斯德毕赤酵母的启动子PTEF2的序列、来自粟酒裂殖酵母的苹果酸转运蛋白的编码序列和来自酿酒酵母的终止子TCYC1的DNA片段。使用吉布森(Gibson)克隆将这三个片段添加至pNH001骨架以生成pNH010(SEQ ID NO：85)。另外，通过PCR扩增这三个DNA片段以构建含有来自巴斯德毕赤酵母的启动子PGAP、来自酿酒酵母的苹果酸脱氢酶(缺少作为过氧化物酶体靶向序列的最后三个氨基酸)和来自毕赤酵母的终止子TGCW14的盒(cassette)。使用Gibson克隆将这三个片段添加至pNH001骨架以生成pNH009(SEQ ID NO：84)。类似地，通过PCR扩增这三个DNA片段以构建含有来自巴斯德毕赤酵母的启动子PGCW14、来自酿酒酵母的PYC2的编码序列和来自巴斯德毕赤酵母的终止子TAOX1的盒。使用Gibson克隆将这三个片段从pNH001组合到所述骨架中并命名为pNH003(SEQ ID NO：83)。还使用Gibson克隆进行这些盒的组合。扩增来自pNH010(SEQ IDNO：85)的质粒骨架，并通过扩增pNH009(含有所需的PGAP-MDH3(ΔSKL)-TGCW14片段)来制备插入物。然后用NotI限制性酶消化随后的质粒pNH011(SEQ ID NO：86)。由pNH003扩增编码PGCW14-PYC2-TAOX1的DNA片段，并将Gibson克隆到pNH011 NotI消化的骨架中。所得质粒pNH014(SEQ ID NO：57)含有表达毕赤酵母中三种基因的所有三个盒：PYC2、MDH3(ΔSKL)和MAE1。这三种基因将丙酮酸转化为草酰乙酸，然后在从细胞输出之前转化为苹果酸。用BsaI消化所述质粒，以使含有750bp同源性的片段线性化为围绕所述三个基因表达盒和KanMX标记的HSP82基因座。使用标准方法转化菌株Y-11430(巴斯德毕赤酵母)，并将回收的细胞接种在YPD+遗传霉素(250μg/mL)上2天。通过PCR验证菌落以在所预期的基因座处含有所需的DNA。选择来自转化体的单个菌落用于发酵并命名为NH038。
使用含有乙醇作为唯一碳源的基本培养基来发酵菌株NH038。首先，将所述菌株在1mL YPD培养基中在30℃下以200rpm振荡培养生长至静止期过夜。从所述过夜培养物中，将20μL传代培养至1mL含有乙醇(13.4g/L YNB+金属(Biobasic)，100mM KH2PO4pH 6.0,0.00004％生物素，2％乙醇)的缓冲基本培养基中。将培养物置于30℃、200rpm下振荡。44小时后，将培养物以16.1krpm离心2分钟，取上清液进行HPLC分析。如上所述进行HPLC分析(实施例21)，不同之处在于从市售的纯化苹果酸(Sigma Aldrich)生成标准曲线的苹果酸(而非琥珀酸)样品。HPLC分析在样品中检测到90mg/L的苹果酸。在含有葡萄糖的缓冲基本培养基中培养相同的菌株，HPLC分析检测到440mg/L，而在不含添加碳源的培养基中，培养物不能生长。
实施例34.在巴斯德毕赤酵母中将乙醇转化为分泌蛋白
巴斯德毕赤酵母长期以来一直是用于生成分泌蛋白的模型生物体，用于包括治疗在内的一系列应用。如我们实验室所证明，巴斯德毕赤酵母具有在乙醇上生长的能力。能够生成蛋白的巴斯德毕赤酵母菌株可在作为唯一碳源的乙醇上生长，并且所述蛋白可与细胞和培养基分离以用于相关应用。用于分泌蛋白的遗传构建体是很好理解的，其中将编码目的蛋白的DNA序列附加到分泌信号上。一种常见的分泌信号是α-因子肽的信号。可通过首先克隆与另一目的基因(待分泌的蛋白)融合的α-因子基因来构建巴斯德毕赤酵母菌株。所述构建体可用于通过其他地方描述的电转化感受态转化技术来修饰巴斯德毕赤酵母的基因组(J L Cereghino&J M Cregg,Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris.,24 FEMS microbiology reviews 45–66,2000)。使用抗生素选择集合(例如博莱霉素、诺尔丝菌素或G418)，来选择转化体。通过在含有抗生素的富含培养基琼脂平板上划线来纯化菌落，并通过菌落PCR扩增和测序来确认正确的遗传构建体。所述这些菌株可在含有作为主要或唯一碳和能源的乙醇的基本培养基中培养。一种此类培养基配方含有酵母氮源(可从许多来源商购得到，例如Difco或SigmaAldrich)、生物素(终浓度0.4mg/L)和乙醇(终浓度1％v/v)。在另一种配方中，可加入缓冲液以稳定pH，例如100mM终浓度的KH2PO4(pH 6.0)。将菌株Y-11430接种到YPD培养基中并在30℃下孵育，以200rpm振荡。16小时后，将10μL所述培养物转移至2mL含有1％乙醇的缓冲基本培养基中，如上所述。24小时后，所述培养物的OD600为2.0。
实施例35.在酿酒酵母中改善在作为主要或唯一碳源的乙醇上的有氧生长
使用通过乙醛将乙醇转化为乙酰-CoA的酶途径，酿酒酵母在作为唯一碳源的乙醇上的生长也是可能的。以与上述大肠杆菌方法类似的方式，可使用靶向或随机策略合成地改变此途径中酶的表达和调节。可使用适当的培养基和酵母酿酒酵母的生长条件，以相同的方式在生长竞争中测定遗传变体的文库。譬如，可改变酵母基因ADH2的表达和调节，以增加作为主要或唯一碳源的乙醇上的生长速率。ADH2是编码乙醇脱氢酶的基因，所述乙醇脱氢酶负责将乙醇转化为乙醛。同样地，基因ALD4和ALD6均是乙醛转化为乙酸所必需的，并且在乙醇上生长期间被激活。改变任何或所有这些的表达可改善基本乙醇培养基上的生长。此外，如上所述，诸如化学诱变的随机策略也可改善乙醇培养基上的生长，并可用于鉴定基因以进一步改进。
实施例36.酵母中合成乙烷营养物
几种酵母菌株，包括最常用的酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母，能够在有氧条件下在乙醇上生长。
将这些菌株转化为合成的乙烷营养物的方法在概念上类似于转化细菌菌株的方法，尽管它在一些细节上有所不同，如下所述。表1中所示的单加氧酶可在酵母中通过质粒或通过染色体整合来表达。可使用标准启动子和终止子来组装遗传构建体以驱动所需多肽的转录和翻译。通常使用的一些示例性启动子包括启动子PADH1、PTEF1、PTEF2、PGAP。一些示例性终止子包括TCYC1、TTEF1、TILV5、TGAP、TAOX1。可使用标准方法(例如电穿孔和化学转化)将这些遗传构建体转化到酵母细胞中，如其他地方所述(J M Cregg et al.,Recombinant protein expression in Pichia pastoris.,16 Molecularbiotechnology23–52,2000)。可以使用菌落PCR方法检查菌落的正确遗传特征。
用于测试酵母菌株成功的功能性乙烷氧化酶的方法类似于上述大肠杆菌的方法。简言之，酵母细胞在富含培养基(例如YPD)中培养，然后在基本培养基中用作为主要或唯一碳源的乙醇清洗。细胞可在基本乙醇培养基中生长或传代，以使它们适应此种生长模式。所述基本乙醇培养基含有酵母细胞生长所需的一切，乙醇是唯一的碳源。下一步是用至少一次缺少任何碳源的基本培养基来清洗细胞，然后将细胞重新悬浮在血清瓶中的此基本无碳培养基中，用塞子插入顶部并将乙烷注入液体上方的顶部空间。如果细胞能够通过表达的单加氧酶复合物将乙烷转化为乙醇，则此乙烷为细胞提供主要或唯一的碳源。可将此密封瓶孵育较长时间以使乙烷溶解于所述培养基中并使细胞消耗乙烷并生长。可通过增加培养物的光密度，相对于未注入乙烷的对照，或通过计数所述实验和对照的菌落形成单位来测定生长情况。
相关实验涉及将单加氧酶亚基靶向酵母细胞的各种亚室，例如过氧化物酶体、内质网和线粒体。已研究并在文献中公布了针对每种的靶向标签。为了靶向所述过氧化物酶体，丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸三肽(SKL)在每个多肽亚基的C-末端进行遗传编码。为了靶向所述内质网，赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸四肽(KDEL)在每个多肽亚基的C末端进行遗传编码。为了靶向所述线粒体基质，有许多公开的标签(F Hartl et al.,Mitochondrialprotein inport,988 Biochimica et biophysica acta 1–45,1989)，但最常见的是来自Su9 F0 ATP酶亚基的标签。
如本发明所述，可优选在与作为主要或唯一碳源的乙烷的竞争中使菌株生长，或者它可以产生更可靠的结果以供给有限量的乙醇以及过量乙烷。在任何一种情况下，具有功能性单加氧酶的细胞均会实现生长优势，这种情况最终会导致所述这些细胞占据培养物种群的最大部分。
实施例37.在酵母中将乙烷转化为蛋白
本实施例描述了能够将乙烷转化为商业产品的酵母菌株。
可组合上述巴斯德毕赤酵母菌株以生成能够将乙烷转化为分泌蛋白的单一巴斯德毕赤酵母菌株。
将这两种遗传元件组合成单一菌株的方法是本领域技术人员周知的。可使用标准技术来设计和组装DNA，并通过转化和抗生素选择整合到宿主基因组中，如上所述。类似的方法也可用于酿酒酵母或其他研究良好的酵母。
能够在乙烷上生长的任何酵母菌株本身是单细胞蛋白质的来源，并可以原样出售。单细胞蛋白质被用作鱼粉的营养源，甚至可作为人类食物中的蛋白质来源。
本发明引用的所有参考文献均以引用的方式并入本文，如同每篇参考文献均单独通过引用其整体并入本文。在描述本申请的实施方案时，为了清楚起见，使用了特定术语。然而，本发明不限于所选择的特定术语。本说明书中的任何内容均不应被视为限制本发明的范围。所呈现的所有实施例均具有代表性且是非限制性的。在不脱离本发明的情况下，可修改/修饰或改变上述实施方案，如同本领域技术人员根据上述教导所理解的那样。因此，应理解，在权利要求及其等同物的范围内，本发明可不同于具体描述的方式进行实施。

Claims (21)

1.可在目的微生物中表达的可溶性二铁单加氧酶的合成多核苷酸，其包含编码二铁单加氧酶的至少一个单加氧酶编码区，所述至少一个单加氧酶编码区连接至至少一个启动子，所述启动子将在所述目的微生物中起作用。
2.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其还包含编码至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白的至少一个蛋白质折叠伴侣蛋白编码区，所述至少一个蛋白质伴侣编码区连接至至少一个启动子，所述启动子将在所述目的微生物中起作用。
3.根据权利要求1所述的合成多核苷酸，其进一步包含至少一个突变，其中所述至少一个突变增加了对单加氧酶底物的特异性和/或增加了化学物质的生成量。
4.根据权利要求2所述的合成多核苷酸，其进一步包含至少一个突变，其中所述至少一个突变增加了对单加氧酶底物的特异性和/或增加了化学物质的生成量。
5.根据权利要求1或2所述的合成多核苷酸，其中所述可溶性二铁单加氧酶与SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：95或SEQ IDNO：97或SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：103或SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：143或SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：147或SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：151或SEQ ID NO：153具有至少60％的同一性。
6.根据权利要求3或权利要求4所述的合成多核苷酸，其中所述至少一个突变是SEQ IDNO：10中位置240处的E至N。
7.合成微生物，其包含至少一种权利要求1、2、3或4所述的外源性合成多核苷酸和微生物。
8.根据权利要求7所述的合成微生物，其中，所述微生物选自由大肠杆菌(Escherichiacoli)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)组成的组。
9.根据权利要求7所述的合成微生物，其中所述可溶性二铁单加氧酶是甲烷单加氧酶或乙烷单加氧酶。
10.合成微生物，其包含权利要求2所述的合成多核苷酸和微生物，其中所述至少一种蛋白质折叠伴侣蛋白包含groES/groEL。
11.根据权利要求7所述的合成微生物，其中所述合成微生物能够在作为唯一或主要碳源的单加氧酶底物上生长。
12.根据权利要求11所述的合成微生物，其中所述单加氧酶底物是甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、或萘。
13.根据权利要求11所述的合成微生物，其中所述单加氧酶底物是乙烷，和所述微生物是大肠杆菌。
14.根据权利要求7所述的合成微生物，其中所述微生物生成化学物质。
15.根据权利要求14所述的合成微生物，其中所述化学物质是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、或萘酚。
16.根据权利要求7所述的合成微生物，其中所述单加氧酶底物是乙烷，和所述至少一个突变增加了对乙烷的特异性。
17.合成微生物，其包含乙醇消耗微生物和一种或多种遗传修饰，所述一种或多种遗传修饰在含有作为唯一或主要碳源的乙醇的培养基中培养时提高化学物质的生成量。
18.根据权利要求17所述的合成微生物，其进一步包含外源性多核苷酸类，所述外源性多核苷酸类编码选自由甲醇脱氢酶(EC1.1.1.244或1.1.99.37或1.1.2.7)，乙醇脱氢酶(EC1.1.1.1或1.1.1.2或1.1.2.8或1.1.3.13)，醛脱氢酶(EC1.2.1.3)，乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)，乙酰-CoA合成酶(EC6.2.1.1)，异柠檬酸裂解酶(EC4.1.3.1)，苹果酸合酶(EC2.3.3.9)，异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(EC 2.7.11.5，EC 3.1.3.-)组成的组的酶。
19.生成化学物质的方法，其包括在合适的培养条件下培养权利要求7所述的合成微生物并保持足够的时间以生成所述化学物质。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述合适的培养条件包括含有作为唯一碳源或作为主要碳源的甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、或萘中的至少一种的培养基。
21.根据权利要求19所述的方法，其中权利要求7所述的合成微生物是在使所述合成微生物生成化学物质的条件下培养，所述化学物质由第二微生物或第二合成微生物转化为第二化学物质。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249238A (zh) * 2021-05-07 2021-08-13 江南大学 一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用
CN114807182A (zh) * 2022-06-07 2022-07-29 天津大学 降解长链烷烃的酵母菌株及其应用
WO2023216227A1 (zh) * 2022-05-07 2023-11-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种微生物菌微胶囊的制备方法、微生物菌群的合成方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3132022A4 (en) * 2014-04-15 2017-12-13 Industrial Microbes, Inc. Synthetic methanotrophic and methylotrophic microorganisms
CN106139887A (zh) * 2015-05-13 2016-11-23 三星电子株式会社 包含编码具有羟化酶活性的蛋白质的基因的微生物和使用其降低样品中氟化甲烷浓度的方法
ES2905957T3 (es) * 2015-11-18 2022-04-12 Ind Microbes Inc Expresión funcional de monooxigenasas y métodos de uso
WO2018150377A2 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 Industrial Microbes, Inc. Culture modified to convert methane or methanol to 3-hydroxyproprionate
EP3649238A4 (en) * 2017-07-07 2021-09-01 Industrial Microbes, Inc. IMPROVED METHANE MONOXYGENASE ENZYMES
EP3613850A1 (en) * 2018-08-22 2020-02-26 Evonik Operations GmbH Amino acid production
US11559774B2 (en) 2019-12-30 2023-01-24 Marathon Petroleum Company Lp Methods and systems for operating a pump at an efficiency point
US11607654B2 (en) 2019-12-30 2023-03-21 Marathon Petroleum Company Lp Methods and systems for in-line mixing of hydrocarbon liquids
US10990114B1 (en) 2019-12-30 2021-04-27 Marathon Petroleum Company Lp Methods and systems for inline mixing of hydrocarbon liquids
CA3104319C (en) 2019-12-30 2023-01-24 Marathon Petroleum Company Lp Methods and systems for spillback control of in-line mixing of hydrocarbon liquids
US20230407350A1 (en) 2020-11-10 2023-12-21 Industrial Microbes, Inc. Microorganisms capable of producing poly(hiba) from feedstock
WO2022165158A1 (en) * 2021-01-29 2022-08-04 Industrial Microbes, Inc. Ethane or ethanol into 3-hydroxypropionate using an engineered microorganism
US11655940B2 (en) 2021-03-16 2023-05-23 Marathon Petroleum Company Lp Systems and methods for transporting fuel and carbon dioxide in a dual fluid vessel
US11578836B2 (en) 2021-03-16 2023-02-14 Marathon Petroleum Company Lp Scalable greenhouse gas capture systems and methods
US12012883B2 (en) 2021-03-16 2024-06-18 Marathon Petroleum Company Lp Systems and methods for backhaul transportation of liquefied gas and CO2 using liquefied gas carriers
US11447877B1 (en) 2021-08-26 2022-09-20 Marathon Petroleum Company Lp Assemblies and methods for monitoring cathodic protection of structures
US11686070B1 (en) 2022-05-04 2023-06-27 Marathon Petroleum Company Lp Systems, methods, and controllers to enhance heavy equipment warning
US12012082B1 (en) 2022-12-30 2024-06-18 Marathon Petroleum Company Lp Systems and methods for a hydraulic vent interlock
US12006014B1 (en) 2023-02-18 2024-06-11 Marathon Petroleum Company Lp Exhaust vent hoods for marine vessels and related methods
CN117126875B (zh) * 2023-10-20 2024-02-06 中国农业科学院生物技术研究所 一种适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140273128A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Intrexon Corporation Biological Conversion of Multi-Carbon Compounds from Methane
WO2015160848A1 (en) * 2014-04-15 2015-10-22 Industrial Microbes, Inc. Synthetic methanotrophic and methylotrophic microorganisms

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003027301A1 (fr) 2001-09-06 2003-04-03 Ajinomoto Co., Inc. Procede permettant de produire un alcool au moyen d'un micro-organisme
US20050176121A1 (en) * 2001-09-06 2005-08-11 Ryo Takeshita Method for producing alcohol by using microorganism
US7723498B2 (en) 2004-06-04 2010-05-25 University Of Connecticut Directed evolution of recombinant monooxygenase nucleic acids and related polypeptides and methods of use
US8535916B2 (en) 2006-02-13 2013-09-17 Ls9, Inc. Modified microorganisms and uses therefor
BRPI1014952A2 (pt) 2009-04-10 2019-09-24 Ls9 Inc "composição produzida por um microrganismo e composição de biocombustível."
US8530210B2 (en) * 2009-11-25 2013-09-10 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
EP2702138A2 (en) * 2011-04-29 2014-03-05 Metabolix, Inc. Green process for producing polyhydroxyalkanoates and chemicals using a renewable feedstock
GB201201178D0 (en) 2012-01-25 2012-03-07 Sinvent As Novel enzymes
US9081378B2 (en) 2012-02-10 2015-07-14 General Electric Company Methods and apparatuses for advanced multiple variable control with high dimension multiple constraints
MY172692A (en) 2012-07-13 2019-12-10 Calysta Inc Biorefinery system, methods and compositions thereof
WO2014047209A1 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Calysta Energy, Inc. Propylene synthesis using engineered enzymes
WO2015010103A2 (en) * 2013-07-19 2015-01-22 Opx Biotechnologies, Inc. Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
WO2015013295A1 (en) 2013-07-22 2015-01-29 Lygos, Inc. Recombinant production of chemicals from methane or methanol
US10323232B2 (en) 2013-10-15 2019-06-18 Mogene Lc Metabolically engineered methanotrophic, phototrophic microorganisms
CN106139887A (zh) 2015-05-13 2016-11-23 三星电子株式会社 包含编码具有羟化酶活性的蛋白质的基因的微生物和使用其降低样品中氟化甲烷浓度的方法
ES2905957T3 (es) * 2015-11-18 2022-04-12 Ind Microbes Inc Expresión funcional de monooxigenasas y métodos de uso
US20170183638A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Samsung Electronics Co., Ltd. Soluble methane monooxygenase protein variant and method of reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140273128A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Intrexon Corporation Biological Conversion of Multi-Carbon Compounds from Methane
WO2015160848A1 (en) * 2014-04-15 2015-10-22 Industrial Microbes, Inc. Synthetic methanotrophic and methylotrophic microorganisms

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEGHA GOYAL等: "GroEL-GroES assisted folding of multiple recombinant proteins simultaneously over-expressed in Escherichia coli", 《INT J BIOCHEM CELL BIOL》 *
STAINTHORPE,A.C.等: "soluble methane monooxygenase regulatory protein B [Methylococcus capsulatus], GenBank: AAF04158.2", 《GENBANK数据库》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249238A (zh) * 2021-05-07 2021-08-13 江南大学 一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用
WO2023216227A1 (zh) * 2022-05-07 2023-11-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种微生物菌微胶囊的制备方法、微生物菌群的合成方法
CN114807182A (zh) * 2022-06-07 2022-07-29 天津大学 降解长链烷烃的酵母菌株及其应用
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