CN110023501A - ω-羟基脂肪酸生产方法 - Google Patents

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Abstract

提供了生产至少一种ω‑羟基脂肪酸的方法，所述方法包括：(a)在含水培养基中使至少一种烷烃与至少一种重组酵母细胞接触，其中所述酵母细胞能够将所述烷烃氧化为相应的ω‑羟基脂肪酸，并且所述酵母细胞包含降低的脂肪酸降解能力。

Description

ω-羟基脂肪酸生产方法
发明领域
本发明涉及用于从至少一种烷烃生产至少一种ω-官能化羧酸的生物技术方法。特别地，所述方法可在乙酸和/或乙酸盐存在下使用酵母细胞来从至少一种烷烃生产相应的ω-羟基羧酸和/或其酯。
发明背景
ω-羟基脂肪酸是非常有价值的单体，其可用于合成独特的聚乙烯样生物基塑料家族。目前，ω-羟基脂肪酸主要通过需要昂贵的催化剂和苛刻条件的化学手段生产。因此，生产ω-羟基脂肪酸的生物技术手段是优选的。
存在本领域已知的几种生产ω-羟基脂肪酸和/或其酯的生物技术手段。例如，能够从用作底物的羧酸生产ω-官能化羧酸的基因修饰的细胞先前已经至少描述于WO2009077461和EP2322598中。WO2011008232中描述了使用假丝酵母属细胞的非常相似的程序，其中β-氧化途径在细胞中被阻断，并且由用作底物的脂肪酸形成ω-官能化羧酸。这些方法具有使用脂肪酸作为起始材料的缺点。这是因为，使用的脂肪酸及其衍生物主要仅仅从植物和动物油或脂肪获得。作为原料的动物脂肪仍然很少被客户接受，并且含有短和中等长度脂肪酸的植物油难以获得或仅在热带地区生产(破坏雨林的结果)。此外，特定的植物和动物油或脂肪原料具有特定、但限定的脂肪酸分布（ fatty acid profiles），导致偶联生产(coupled production)。
WO2013024114公开了从简单的碳源(诸如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素和半纤维素，还有甘油或非常简单的有机分子诸如CO2、CO或合成气)生产ω-官能化羧酸和/或其酯(包括ω-羟基脂肪酸)的方法。这些简单的糖，特别是葡萄糖的获得通常更昂贵。从简单的碳源生产ω-羟基脂肪酸和/或其酯的方法也可以被认为是复杂的，因为该方法中使用的细胞必须首先进行基因修饰以增加从这些简单碳源生产羧酸。这因此增加了生产成本。
发现阴沟假丝酵母（Candida cloacae）和热带假丝酵母（Candida tropicalis）能够以烷烃作为唯一的碳源生长。例如，热带假丝酵母能够氧化中等至长链烷烃，以合成二羧酸。然后已知合成的二羧酸通过β-氧化途径降解。在具有阻断或抑制的β-氧化途径的热带假丝酵母中，二羧酸总是为主要产物，并且以低选择性生产非常少量的ω-羟基脂肪酸。
因此，本领域中需要环境友好的、从除了脂肪酸和/或简单碳之外的碳源生产ω-羟基脂肪酸的简单和可持续的方法。
发明描述
本发明提供了氧化至少一种烷烃的方法，其中所述方法是可在乙酸和/或乙酸盐存在下进行的生物催化方法。特别地，乙酸和/或乙酸盐可用作氧化烷烃以生产至少一种ω-羟基脂肪酸的共底物。在从烷烃生产ω-羟基脂肪酸的方法中使用这些基因修饰的细胞，可以给这些化合物的生产增加灵活性（这是通过使容易获得的替代石油化学原料能够用于其生产）。另外，使用全细胞生物催化剂（它们能够在其内部整合将烷烃转化为ω-羟基脂肪酸的完整手段），使得转化过程更简单，因为仅仅少量的过程步骤参与转化。还可以消除ω-羟基脂肪酸生产对通常使用的昂贵碳底物诸如脂肪酸的依赖。
本发明提供了从至少一种碳底物生产至少一种ω-羟基脂肪酸的方法，其中所述方法包括：
(a)在含水培养基中使所述碳底物与至少一种酵母细胞接触，其中所述酵母细胞能够将所述碳底物氧化为相应的ω-羟基脂肪酸和/或二羧酸；并且所述酵母细胞包含降低的脂肪酸降解能力，其中所述含水培养基包含至少一种C1至C4 有机化合物。
特别地，降低的脂肪酸降解能力可以是以下的结果：
(i)至少一种参与β-氧化途径的酶相对于野生型细胞表达降低；和/或
(ii)至少一种参与β-氧化途径的酶中的至少一种失功能突变。
C1至C4有机化合物可以用作共底物。共底物可以至少是一种C1至C4有机化合物。特别地，C1至C4共底物可以是能量源，并且可以选自C1至C4烷烃、C1至C4醇、C1至C4醛、C1至C4羧酸、C1至C4羧酸盐及其混合物。更特别地，共底物可以至少是一种C2至C4有机化合物。共底物可以选自C2至C4烷烃、C2至C4醇，C2至C4醛、C2至C4羧酸、C2至C4羧酸盐及其混合物。特别地，共底物可以是至少一种C2至C4烷烃。C2至C4共底物可以是支化或未支化的。在一个实例中，共底物是至少一种C2至C4醇。 C2至C4醇可以包括一元醇和多元醇。C1至C4共底物可以选自乙酸盐、乙酸、丙酸、丙酸盐、乙醇、丙醇、乙二醇和甘油。 在一个实例中，C1至C4有机化合物可以是在含水培养基中用作能量源的唯一共底物。在此实例中，含水培养基包含至少一种C1至C4有机化合物作为共底物并且不包含葡萄糖。更特别地，含水培养基不包含可检测的葡萄糖。
根据本发明的任何方面，碳底物可以选自烷烃、脂肪醇、脂肪醛及其混合物。特别地，碳底物可包含7-22的碳数目。更特别地，碳底物可以包含8-22、8-20、8-19、9-18、10-22、12-22、10-20、10-18、10-16、10-14、7-14或10-12个碳原子。甚至更特别地，碳底物可以是包含7-22、10-14、7-14或10-12个碳原子的烷烃。
在本发明的一个方面，提供了从至少一种烷烃生产至少一种ω-羟基脂肪酸的方法，所述方法包括：
(a)在含水培养基中使所述烷烃与至少一种酵母细胞接触，
其中所述酵母细胞能够将所述烷烃氧化为相应的ω-羟基脂肪酸，并且所述酵母细胞包含降低的脂肪酸降解能力；并且
其中所述含水培养基包含乙酸和/或乙酸盐。
特别地，降低的脂肪酸降解能力可以是以下的结果：
(i)至少一种参与β-氧化途径的酶相对于野生型细胞表达降低；和/或
(ii)至少一种参与β-氧化途径的酶中的至少一种失功能突变。
乙酸和/或乙酸盐可用作共底物。包含酵母细胞的含水培养基中乙酸和/或乙酸盐的存在增加了由烷烃形成ω-羟基脂肪酸的选择性。特别地，相对于不存在乙酸和/或乙酸盐情况下的所述方法，ω-羟基脂肪酸形成的选择性可高达70%，甚至高达 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%（基于发酵产物的总重量，即 ，ω-羟基脂肪酸和二羧酸的总重量）。
因此，本发明的方法可以是从至少一种烷烃生产至少一种ω-羟基脂肪酸的方法，所述方法相对于含水培养基中不存在乙酸和/或乙酸盐的方法，对ω-羟基脂肪酸的形成具有增加的选择性。特别地，在根据本发明的任何方面的方法中，形成了较少副产物如二羧酸。因此，起始材料的浪费会更少，使得ω-羟基脂肪酸的生产成为最具成本效益的方法。因此，产量可以更高，和/或可在更短的时间段内获得更多的产量。这进一步导致成本和时间节省。
本文所用的术语“乙酸和/或乙酸盐(acetate)”指乙酸和其盐两者，这是不可避免地产生的，因为如本领域已知的，由于微生物在含水环境中工作，在存在的盐和酸之间总是存在平衡。在根据本发明的任何方面的方法中，乙酸和/或乙酸盐可以用作共底物。分子乙酸与乙酸和/或乙酸盐的比例取决于系统的 pH，即在恒定的“乙酸和/或乙酸盐”浓度下，pH 越低，相对于乙酸盐，分子乙酸浓度越高。
根据本发明的任何方面的含水培养基中的共底物的浓度可以是关键方面。共底物的浓度可选自 80-800 mmol/L、100-800、100-700、100-600、100-500、110-500、120-500、130-500、140-500、150-500、160-500、160-550、160-450、160-400、150-350 mmol/L等等之间的范围。
特别地，共底物可以是乙酸和/或乙酸盐。根据本发明的任何方面使用的含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐的浓度可以保持在提到的特定浓度。特别地，乙酸和/或乙酸盐可以以至少80mmol/L的最小浓度存在于根据本发明的任何方面的方法的含水培养基中。更特别地，存在于含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐浓度可以超过或等于约85mmol/L、90mmol/L、95mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、160mmol/L、170mmol/L、180mmol/L、190mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L、350mmol/L、400mmol/L、450mmol/L、500mmol/L、550mmol/L、600mmol/L、650mmol/L、700mmol/L、750mmol/L、800mmol/L等等。在一个实例中，含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐的浓度可以低于以下浓度：所述浓度可以导致抑制根据本发明的任何方面的酵母细胞的氧化能力。更特别地，含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐的浓度可以超过0mmol/L。甚至更特别地，含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐的浓度可以是在可检测量。含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐的浓度可以选自20-800 mmol/L、30-800、40-800、50-800、60-800、70-800、80-800、100-800、100-700、100-600、100-500、110-500、120-500、130-500、140-500、150-500、160-500、160-550、160-450、160-400、150-350 mmol/L等等之间的范围。在一个实例中，含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐的浓度可以不低于和等于160mmol/l和/或不高于和等于500mmol/l。
本文所用的术语“约”是指 20%内的变化。特别地，本文所用的术语"约"是指给定的测量值或数值的+/- 20%，更特别地，+/-10%，甚至更具体地，+/- 5%。
技术人员将能够通过本领域中已知的方法将乙酸和/或乙酸盐的浓度保持在期望的水平。特别地，技术人员将定期测量含水培养基中乙酸和/或乙酸盐的浓度并通过在培养基中添加更高或更低浓度的乙酸和/或乙酸盐相应地调节乙酸和/或乙酸盐的浓度。技术人员将能够使用本领域中已知的任何方法来测量含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐浓度。例如，可以使用乙酸和/或乙酸盐比色测定试剂盒（Sigma-Aldrich）、真空蒸馏和气相色谱法、导电性的测量、UV /可见光分光光度测量和本领域中已知的其它方法。在一个实例中，可以使用NMR测量乙酸和/或乙酸盐。特别地，可使用半定量1H-NMR光谱学来测量乙酸和/或乙酸盐的浓度。作为内部定量标准，可以使用三甲基甲硅烷基丙酸钠(T(M)SP)。在另一个实例中，可以按照制造商的说明，使用来自R-Biopharm的酶试剂盒（物品号：10148261035）测量乙酸和/或乙酸盐的浓度。在一个实例中，乙酸和/或乙酸盐可以独立于含水培养基的连续进料而在连续流中添加到含水培养基中。在另一实例中，乙酸和/或乙酸盐可以是正在被加满的培养基的一部分。特别地，乙酸和/或乙酸盐可以作为营养物进料的一部分或单独地进料到含水培养基中。无论采用何种途径将乙酸和/或乙酸盐进料到含水培养基中，技术人员可以理解用于保持含水培养基中的乙酸和/或乙酸盐的浓度的手段。在一个实例中，可以通过每发酵大约20小时将乙酸和/或乙酸盐加满而保持培养基中的乙酸和/或乙酸盐浓度。在另一实例中，可以从培养和/或发酵过程开始每大约5、10、15、20、25、30小时进行培养基中乙酸和/或乙酸盐的加满。在另一实例中，乙酸和/或乙酸盐可以不一定必须加满，因为乙酸和/或乙酸盐可以不用于生产ω-羟基脂肪酸的方法中。
特别地，乙酸和/或乙酸盐可以是在细胞中产生能量和还原当量(NADH/NADPH/FADH) 的共底物。该反应的副产物可以是二氧化碳。本文所用的术语“共底物”，是指可以被多底物酶使用以进行反应的底物。例如，乙酸和/或乙酸盐和/或乙醇可以被消耗以产生能量，该能量可以被用于还原其它共底物如NAD/NADP/FAD+以分别产生NADH/NADPH/FADH。乙醇和/或乙酸和/或乙酸盐可因此被用于保持含水培养基或细胞的胞质溶胶中NAD+/NADH、NADP+/NADPH和/或FAD+/FADH的比例。特别地，反应可以是这样的：
在一个实例中，对于80%的反应期，含水培养基中乙酸和/或乙酸盐的浓度保持在根据本发明的任何方面使用的任何浓度。在另一实例中，可以在50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、90%、95%或100%的反应时间保持乙酸和/或乙酸盐的浓度。在这方面，“反应时间”是指以下时期：在所述时期中发生一种过程。特别地，反应时间是指以下时间段：在所述时间段发生碳底物向期望的产物，即ω-羟基脂肪酸和/或二羧酸的转化。在一个实例中，反应时间是指从反应开始到反应结束和/或完成，即碳底物耗尽的时间段。在一个实例中，底物可以是烷烃，并且当发酵罐中的烷烃耗尽时反应完成并且反应终止，并且没有另外的烷烃进料到发酵罐中。因此，反应时间是指从转化开始（即，当在合适的反应条件下在容器中与酵母细胞接触时当烷烃首先被转化为可检测量的期望产物即ω-羟基脂肪酸和/或二羧酸时）到反应结束（即，当不再有碳底物诸如烷烃时和/或当容器中存在另外的限制因素时，所述限制因素终止反应使其不再继续）的时期。在一个实例中，反应期可以持续24小时、42小时、72小时、96小时、100小时、120小时、150小时、180小时、200小时、220小时、240小时，等等。在另一实例中，反应期可以持续115、116、117、118、119、120、121小时，等等。
来自混合物的剩余的乙酸和/或乙酸盐可以重新使用。特别地，这意味着，可以允许形成的ω-羟基脂肪酸积累，然后通过本领域已知的手段分离。剩余的乙酸和/或乙酸盐可因此在反应混合物中保持和重新使用。ω-羟基脂肪酸可以以分批方式或以连续方式移除。在后一种情况下，形成的ω-羟基脂肪酸通过本领域中已知的分离步骤连续地移除。
根据本发明的任何方面的方法可包括用于生产乙酸和/或乙酸盐的在先步骤。乙酸和/或乙酸盐可以通过本领域中已知的任何手段生产，以便将此化合物外源引入到至少所述酵母细胞用于生产ω-羟基脂肪酸。特别地，乙酸和/或乙酸盐可从NaAc、HAc 和/或等等引入到含水培养基中。
在一个实例中，NaAc可以在转化期中进料，并且HAc可通过自动pH调节进料。如本文所用的术语“转化期”是指发酵阶段，此时微生物将底物转化为目标发酵产物。例如，所述转化期可以指热带假丝酵母（Candida tropicalis）ATCC20962将烷烃转化为ω-羟基脂肪酸的发酵阶段。
在微生物细胞周期中，转化期之后可以是生长期。如本文所用，术语“生长期”是指微生物细胞周期中与静止期相比微生物数目增加更快的时期。生长期可以相应于微生物细胞周期中的滞后期和指数生长期。
因此，根据本发明的任何方面的方法可以包括在先步骤：a’)生产酵母细胞。此步骤的目的可以是增加细胞数目。此步骤可以相应于微生物细胞周期中的生长期。在该步骤中，可以在用于根据本领域已知的方法最优生长的至少一种能量源诸如底物（如葡萄糖）中培养细胞。
在一个实例中，在酵母细胞的转化期中进行将碳底物氧化为相应的ω-羟基脂肪酸。在转化期中可以不加入能量源。在转化期中可以首先加入共底物。在该期中，几乎没有可检测量的、曾经在酵母细胞的生长期中存在的能量源。能量源可以选自葡萄糖、蔗糖、果糖、乙酸、甘油等等。在转化期中，能量源可以是不可检测的浓度。特别地，培养基中的能量源的浓度可以是少于5、0.5、0.3、0.2或0.1 mmol/L。特别地，生长期中的能量源可以是葡萄糖。在根据本发明的任何方面的转化期，葡萄糖的浓度可以是低于20mmol/L。特别地，培养基中的葡萄糖的浓度可以是少于5、0.5、0.3、0.2或0.1 mmol/L。在该实例中，能量源可以不同于根据本发明的任何方面的共底物。
在另一实例中，根据本发明的任何方面使用的能量源可以与所使用的共底物相同。特别地，使用的共底物可以是至少一种C1-C4有机化合物，并且在生长期中这也可以是生物体的能量源。更特别地，能量源（其也可以是共底物）可以是乙酸、甘油等等。
根据本发明的任何方面的酵母细胞可以用于以高时空产量、高碳产量和培养物上清液中的高浓度从所有烷烃生产ω-羟基脂肪酸。作为这些优点的结果，可以促进高效的后处理。
酵母细胞可以能够将烷烃氧化为相应的ω-羟基脂肪酸。这可以是野生型细胞中天然存在的性状。这种将烷烃转化为相应的ω-羟基脂肪酸必需的酶可以是酵母细胞中的ω-氧化途径的一部分。在一个实例中，将烷烃转化为相应的ω-羟基脂肪酸所需的必需酶可以遗传引入酵母细胞。将烷烃转化为相应的ω-羟基脂肪酸所需的必需酶可以选自细胞色素P450羟化酶复合物（其由细胞色素P450单加氧酶（CYP蛋白）和伴随的NADPH细胞色素P450还原酶（NCP）组成）、脂肪醇氧化酶、脂肪醛脱氢酶等等。 技术人员将能够容易地确定可以通过重组手段引入酵母细胞以便能够进行将烷烃转化为相应的ω-羟基脂肪酸的酶。在另一实例中，酵母细胞可以天然包含进行将烷烃氧化为相应的ω-羟基脂肪酸必需的酶。
酵母细胞可以进一步包含降低的脂肪酸降解能力。可以使用本领域熟知的重组技术通过基因修饰将降低的脂肪酸降解能力的这种特征引入野生型细胞中。在一个实例中，可以使用本领域已知的方法对野生型菌株热带假丝酵母ATCC 20336进行基因修饰以使其具有降低的脂肪酸降解能力。特别地，可以用Pictaggio, S (1992) Biotechnology, 10:894- 97中公开的方法修饰细胞以产生ATCC 20962。在另一实例中，野生型酵母细胞可以天然包含降低的/抑制的脂肪酸降解能力。例如，具有降低的脂肪酸降解能力的野生型酵母细胞可以是热带假丝酵母的菌株。特别地，菌株可以是Institute of Forestry andPedology, Academia Sinica (1979, Acta Microbiologica Sinica, 19(1):64-70中公开的热带假丝酵母19-2。
如本文中与细胞结合使用的短语“野生型”可以表示具有野生中天然观察到的形式的基因组组成的细胞。该术语可以适用于完整细胞和单独的基因两者。因此，术语“野生型”还可以包括已在其它方面(即，关于一种或多种基因)、但不与目标基因相关进行了基因修饰的细胞。因此，术语“野生型”不包括此类细胞：其中已经使用重组方法通过人工至少部分改变了特定目标基因的基因序列。因此，根据本发明的任何方面的野生型酵母细胞是指这样的细胞：其没有通过重组手段带来的、关于完整基因组和/或特定基因的基因突变。在一个实例中，野生型酵母细胞可以包含能够将烷烃氧化为相应的ω-羟基脂肪酸的酶的野生型表达和/或得到包含降低的脂肪酸降解能力的酵母细胞的相关酶的野生型表达。因此，在一个实例中，关于酶E1的野生型细胞可以指细胞中具有酶E1的天然/未改变表达的细胞。关于与脂肪酸降解相关的酶的野生型细胞可以用相同方式解释，并且可以指细胞中具有这些特定酶的天然/未改变表达的细胞。在又另一实例中，野生型细胞可包含至少一种参与β-氧化途径的酶中的天然存在的失功能突变。因此，野生型酵母细胞可以包括具有天然存在的突变的酵母细胞。这些天然存在的突变可以在至少一种参与β-氧化途径的酶中，因此得到相对于没有天然存在的突变的细胞具有降低的脂肪酸降解能力的细胞。野生型细胞中酶的突变可以导致酶表达的减少或无功能酶的表达。
特别地，本文所用的术语“具有降低的脂肪酸降解能力”是指，各自的细胞降解脂肪酸(特别是从环境吸收的那些)的速度低于具有正常脂肪酸降解能力的野生型细胞在相同条件下的速度。更特别地，由于至少一种编码参与β-氧化途径的酶的基因的缺失、抑制或灭活，这样的细胞的脂肪酸降解较低。在一个实施例中，相对于各自的野生型微生物中的相同酶在类似条件下的活性，至少一种参与β-氧化途径的酶已经丧失5%、10%、20%、40%、50%、75%、90%或99%活性。在另一实例中，根据本发明的任何方面使用的酵母细胞的脂肪酸降解能力可以高达野生型细胞或类似细胞的脂肪酸降解能力的例如95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%或0%。
本领域技术人员熟知可以用于使编码酶的基因缺失或降低细胞中这样的酶的活性的各种技术，例如通过将细胞暴露于放射性、随后积累或筛选得到的突变体、点突变的定点引入，或编码活性酶的染色体整合基因的敲除，如在Sambrook/Fritsch/Maniatis(1989)中所述。
更特别地，可以通过各种方式降低细胞的脂肪酸降解能力。如本文所用的术语“基因的缺失”是指，编码所述基因的核酸序列可以被修饰，使得由所述基因编码的活性多肽的表达减少。酶的表达可以指细胞中酶的活性。例如，可以通过符合读框地除去序列的一部分而使基因缺失，所述序列包含编码多肽的催化活性中心的序列。替代地，可以改变核糖体结合位点，使得核糖体不再翻译相应的RNA。本领域技术人员能够使用如在酶学教科书，例如Cornish-Bowden (1995)中所述的标准测定，常规地测量由活细胞表达的酶的活性。
脂肪酸的降解可以通过一系列酶催化的反应来完成。首先，脂肪酸被吸收和经由转运/酰基-活化机制而跨细胞膜转移，所述机制涉及至少一种外膜蛋白和一种内膜结合的具有脂肪酸辅酶A连接酶活性的蛋白。在细胞内，要降解的脂肪酸受到催化β-氧化途径的其它反应的酶处理。参与β-氧化途径的酶的一般说明可以至少公开于Beopoulos, A. (2011)Appl Microbio Biotechnol, 90:1193-1206中。第一个细胞内步骤涉及酰基辅酶A通过酰基辅酶A脱氢酶转化为烯酰辅酶A。可以使用本领域中已知的任何方法测定酰基辅酶A脱氢酶的活性。例如通过在100 mM MOPS, pH 7.4、0.2 mM烯酰辅酶A、0.4 mM NAD+中，在340 nm分光光度法监测NADH的浓度。得到的烯酰辅酶A通过烯酰辅酶A水合酶/3-羟基酰基辅酶A脱氢酶催化的水合和氧化经由3-羟基酰基辅酶A转化成3-酮脂酰辅酶A。可以如在现有技术中所述，通过分光光度法测定烯酰辅酶A水合酶/3-羟基酰基辅酶A脱氢酶活性（更具体地，产物NADH的形成）。最后，3-酮脂酰辅酶A硫解酶催化3-酮脂酰辅酶A的裂解，以产生乙酰辅酶A和缩短了2个碳原子的输入酰基辅酶A。可以如在现有技术中，例如在Antonenkov, V.,1997中所述测定酮脂酰辅酶A硫解酶的活性。
在另一实例中，参与β-氧化途径的酶可以通过将脂肪酸或其衍生物识别为底物，将它转化为作为β-氧化途径的一部分而形成的代谢物。例如，酰基辅酶A脱氢酶(EC1.3.99.-)是参与β-氧化途径的酶，因为它与脂肪酸辅酶A相互作用并将脂肪酸辅酶A酯转化为烯酰辅酶A，而烯酰辅酶A是作为β-氧化的一部分而形成的代谢物。在另一实例中，本文所用的术语“参与β-氧化途径的酶”包括来自含有以下的组的任何多肽：酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.-)、烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶EC 1.1.1.35)和3-酮脂酰辅酶A硫解酶(EC 2.3.1.16)。酰基辅酶A合成酶(EC 6.2.1.1)可以催化脂肪酸转化为脂肪酸的辅酶A酯，即这样的分子，其中羧基的官能团-OH被-S辅酶A替换，并将所述脂肪酸引入β-氧化途径。在一个实例中，本文所用的术语“酰基辅酶A脱氢酶”可以是能够催化酰基辅酶A转化为烯酰辅酶A (作为β-氧化途径的一部分)的多肽。本文所用的术语“烯酰辅酶A水合酶”也被称作3-羟基酰基辅酶A脱氢酶，是指能够催化烯酰辅酶A通过水合和氧化而转化成3-酮脂酰辅酶A (作为β-氧化途径的一部分)的多肽。本文所用的术语“酮脂酰辅酶A硫解酶”可以表示这样的多肽：其能够催化3-酮脂酰辅酶A的裂解，得到缩短了2个碳原子的酰基辅酶A和乙酰辅酶A，作为β-氧化途径的最终步骤。
在一个实例中，降低的脂肪酸降解能力可以是至少一种选自下组的酶相对于野生型细胞表达降低的结果：酰基辅酶A脱氢酶、2,4-二烯酰辅酶A还原酶、烯酰辅酶A水合酶、3-酮脂酰辅酶A硫解酶和酰基辅酶A氧化酶。降低的脂肪酸降解能力也可以是至少一种选自下组的酶的失功能的结果：酰基辅酶A脱氢酶、2,4-二烯酰辅酶A还原酶、烯酰辅酶A水合酶、3-酮脂酰辅酶A硫解酶和酰基辅酶A氧化酶。特别地，具有降低的表达和/或失功能的酶可以是酰基辅酶A氧化酶(EC 6.2.1 .3)。更特别地，酰基辅酶A氧化酶可以选自POX1、POX2、POX3、POX4、POX5和POX6。
根据本发明的任何方面的酵母细胞的降低的脂肪酸降解能力可以是至少一种上文列出的参与β-氧化途径的酶中的至少一种失功能突变的结果。所述失功能突变可以是天然存在的现象。在另一实例中，失功能突变可以通过遗传手段诱导。天然存在或通过人工手段引起的失功能突变可以得到生产特定酶的细胞，所述特定酶以相对于没有此突变的细胞相等的量参与β-氧化途径。但是，细胞中的所述突变可以得到生产所述酶的非功能形式的细胞。一般而言，根据本发明的任何方面的失功能突变可以导致β-氧化的强减少或甚至完全缺失。所述失功能突变可以是导致β-氧化的实质性减少的点突变、插入、缺失（完全或部分）或基因替换。这些失功能突变可以天然存在或可以通过重组手段进行。
酵母菌株（其中脂肪酸的β-氧化可以减少）包括所有携带至少一种编码直接参与β-氧化的酶的基因中的至少一种失功能突变的菌株。这些菌株也包括所有携带至少一种仅仅间接影响β-氧化（包括通过生物发生和过氧化物酶体功能）的失功能突变的菌株。这些根据本发明的任何方面的细胞可以具有至少一种参与β-氧化途径的酶中的突变的组合，或超过一种参与β-氧化途径的酶中的突变的组合。在一个实例中，根据本发明的任何方面的酵母细胞可以携带选自POX1、POX2、POX3、POX4、POX5、POX6、MFE1和POT1的至少一种基因中的至少一种失功能突变。该突变可以通过天然或重组手段存在于基因中。
根据本发明的任何方面使用的酵母细胞可以能够将至少一种烷烃转化为相应的ω-羟基脂肪酸。在一个实例中，根据本发明的任何方面的酵母细胞可以具有烷烃，特别是正烷烃的伯位氧化（primary oxidation）或单末端氧化（monoterminal oxidation）的能力。
根据本发明的任何方面的酵母细胞可以选自假丝酵母属（Candida）、亚罗酵母属（Yarrowia）、毕赤酵母属（Pichia）、球拟酵母属（Torulopsis）、红酵母属（Rhodotorula）和拟威克酵母属（Wickerhamiella）。特别地，酵母细胞可以选自热带假丝酵母（Candida tropicalis）、阴沟假丝酵母（Candida cloacae）、解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、胶粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、杜姆克氏拟威克酵母（Wickerhamiella domercqiae）等等。
在一个实例中，所述酵母细胞具有阻断或抑制的β-氧化途径。该特征可以天然存在于细胞中或可以通过本领域已知的遗传手段引入。在一个进一步的实例中，细胞可以是热带假丝酵母ATCC 20962或保藏号为CGMCC 14251的解脂亚罗酵母C122菌株（于2017年6月19日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院，100101，中国）。解脂亚罗酵母CGMCC 14251具有以下表型：它不能在以烷烃（例如十二烷）或脂肪酸（例如十二酸）作为唯一碳源的基本培养基中生长。
在一个特定的实例中，衍生自热带假丝酵母ATCC20336的菌株，如热带假丝酵母ATCC20962可以用于生产ω-羟基脂肪酸。热带假丝酵母ATCC20962是这样的菌株：其中β-氧化途径通过破坏编码酰基辅酶A氧化酶的POX4和POX5基因而被阻断。
根据本发明的任何方面使用的酶可以是重组的。本文中所用的术语“重组的”是指一种分子或由这样的分子编码，特别是多肽或核酸，其本身不天然地存在，而是基因工程的结果，或是指包含重组分子的细胞。例如，如果核酸分子包含以下这样的启动子，则核酸分子是重组的：所述启动子与编码催化活性多肽的序列功能性地连接，且所述启动子已经经过工程化，使得所述催化活性多肽相对于包含原始未改变核酸分子的相应野生型细胞中的多肽水平过量表达。
技术人员将能够使用本领域已知的任何方法来基因修饰细胞或微生物。根据本发明的任何方面，基因修饰的细胞可以被基因修饰，使得在规定的时间间隔内，在2小时内，特别是在8小时或24小时内，其形成的氨基酸为野生型细胞的至少1倍或2倍，尤其至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍。产物形成的增加可以例如通过在合适的营养培养基中在相同条件（相同细胞密度、相同营养培养基、相同培养条件）下将根据本发明的任何方面的细胞和野生型细胞各自分开地培养指定的时间间隔，并然后测定营养培养基中目标产物（ω羟基脂肪酸）的量来确定。
基因修饰的细胞或微生物可以与野生型细胞或微生物在基因上不同。根据本发明的任何方面的基因修饰的微生物与野生型微生物之间的基因差异可以是在基因修饰的微生物中存在可能在野生型微生物中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等。根据本发明的任何方面的细胞可以根据本领域中已知的任何方法遗传转化。特别地，可以根据WO2013024114中公开的方法生产所述细胞。
在相同的上下文中，短语“降低的酶Ex的活性”可以与针对本发明的任何方面使用的“降低的酶Ex的表达”互换使用，可以理解为表示降低至最多二分之一，特别是最多十分之一，更特别是最多百分之一，甚至更特别是最多千分之一，和最特别地是最多万分之一的活性。短语“降低的活性”也包括不可检测的活性(“活性为0”)。某种酶的活性的降低可以如下实现：例如，通过选择性突变，或通过本领域技术人员已知的用于降低某种酶的活性的其它措施。特别地，本领域技术人员例如至少在Dubeau等人. 2009. Singh & Röhm. 2008.,Lee等人, 2009等等中发现了关于借助于中断特定基因而修饰和减少蛋白表达以及伴随降低酶活性的说明。根据本发明的任何方面的细胞中的酶活性的降低可以通过包含核酸序列之一的基因的修饰实现，其中所述修饰选自包含以下、由以下组成的组：将外源DNA插入基因中、基因的至少部分的缺失、基因序列中的点突变、RNA干扰(siRNA)、反义RNA，或位于基因侧翼的调节序列(诸如，例如启动子和终止子)或核糖体结合位点的修饰(插入、缺失或点突变)。
在此方面，外源DNA将理解为表示任何对于基因（而不是对于生物体）是“外源的”DNA序列，即，内源性DNA序列在此方面也可以作为“外源DNA”起作用。在此方面，特别优选的是通过插入选择标记基因而使基因中断，这样外源DNA是选择标记基因，其中优选地，通过基因座中的同源重组实现插入。
借助1维和2维蛋白凝胶分离，随后用合适的评估软件视觉鉴定凝胶中的蛋白浓度，可测定上文提到的和所有下文提到的酶和基因的表达。
如果酶活性的降低仅仅基于相应基因表达的减少，则可以通过比较野生型和基因修饰细胞之间的1维或2维蛋白分离来简单地测定酶活性降低的定量。用于使用细菌制备蛋白凝胶和用于鉴定蛋白的常用方法是Hermann等人(Electrophoresis, 22: 1712-23(2001)描述的程序。通过使用对于待测定的蛋白为特异性的抗体的蛋白印迹杂交(Sambrook等人, Molecular Cloning: a laboratory manual, 第2版.Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.USA, 1989)，随后使用适当软件进行视觉评估用于测定浓度(Lohaus和Meyer (1989) Biospektrum, 5:32-39;Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111:2630-2647)，也可以分析蛋白浓度。当由待测定的酶活性催化的反应的可能产物可以在微生物中快速代谢或者野生型中的活性本身太低而使其不足够可能基于产物形成而测定待测定的酶活性时，该方法也总是一种选项。
贯穿本说明书中提到的、与本发明关联阐述的登录号相应于具有日期2011年7月26日的NCBI ProteinBank数据库条目；通常，条目的版本号在本文中通过“数字”诸如例如“.1”来标识。
除非另有说明，否则所有指出的百分比(％)为质量百分比。
烷烃是具有各种应用（取决于碳原子的数目和烷烃的结构(即支化的、直链的、环状等)）的饱和烃。烷烃(技术上，总是无环或开链化合物)具有化学通式CnH2n+2。根据本发明的任何方面使用的烷烃可以是具有3至22、6至18或8至14个碳原子的未取代烷烃。特别地，烷烃可以是未支化的。更特别地，烷烃可以选自辛烷、癸烷、十二烷和十四烷。甚至更特别地，根据本发明的任何方面使用的烷烃可以包含至少6个碳原子。特别地，烷烃可以选自C7-C22烷烃。更特别地，烷烃可以选自C8-C22、C8-C20、C8-C18、C8-C16、C10-C20、C10-C18、C10-C16、C10-C14、C10-C12烷烃等等。甚至更特别地，烷烃可以选自C10-C12烷烃等等。在一个实例中，根据本发明的任何方面使用的烷烃可以选自癸烷、十一烷、十二烷等等。
根据本发明的任何方面的方法的ω-羟基脂肪酸的选择性可以高达70%，甚至高达75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%（基于发酵产物的总重量，即，ω-羟基脂肪酸和二羧酸的总重量）。
因此，根据本发明的任何方面的方法提供了简单和有效的手段，以使用简单微生物诸如酵母细胞(特别是热带假丝酵母或解脂亚罗酵母)通过从烷烃发酵来实现ω-羟基脂肪酸的选择性生产。可以不需要繁琐的基因修饰。可以将占优势的产物选择为ω-羟基脂肪酸而不是二羧酸。
如本文所用的术语“接触”是指在步骤(a)中，引起根据本发明的任何方面的细胞与包含烷烃和/或乙酸和/或乙酸盐的培养基之间的直接接触。例如，在步骤(a)中，细胞和包含烷烃和/或乙酸和/或乙酸盐的培养基可以处于不同的隔室中。特别地，烷烃可以处于气态并添加到包含根据本发明的任何方面的细胞的培养基中。
根据本发明的任何方面的方法可以是分批培养、补料分批培养或半连续发酵。在一个实例中，该方法是补料分批培养。根据本发明的任何方面，发酵可以在通气的培养条件下进行。
本发明的方法对发酵条件如培养基、pH值或发酵时间没有特殊要求，这些都可以是常规的。在一个实例中，根据本发明任何方面的方法可以在具有5和8、5.5和7之间的pH的含水培养基中进行。压力可以在1和10 bar之间。
术语“水溶液”或“培养基”包括任何包含水，主要是水作为溶剂的溶液，所述溶液可用于将根据本发明任何方面的细胞至少暂时地保持在代谢活性和/或存活状态，并且包含（如果这是必要的）任何额外基质。本领域技术人员熟悉可用于保持细胞的许多水溶液，通常称为培养基的制备。与复杂培养基相比，有利的是使用基本培养基作为水溶液，所述基本培养基即具有合理简单组成的培养基，其仅包含对于使细胞保持在代谢活性和/或存活状态必不可少的最小盐和营养物组，以避免不想要的副产物不必要地污染产物。例如，M9培养基可用作基本培养基。将细胞与碳源一起温育足够长时间以生产期望的产物。例如至少1、2、4、5、10或20小时。选择的温度必须使得根据本发明的任何方面的细胞保持催化能力和/或代谢活性，例如，10至42°C，优选30至40°C，特别地，32至38°C。
根据本发明的任何方面的提取ω-羟基脂肪酸的手段可以包括含水的两相系统，例如，包括聚乙二醇、毛细管电泳、色谱，等等。在一个实例中，当将色谱用作提取手段时，可以使用离子交换柱。在另一实例中，可以使用pH改变使氨基酸沉淀。技术人员通过简单的反复试验可以容易地鉴定提取ω-羟基脂肪酸的最合适手段。
根据本发明的另一方面，提供了酵母细胞用于在含水培养基中从至少一种烷烃生产至少一种ω-羟基脂肪酸的用途，其中所述酵母细胞包含降低的脂肪酸降解能力；并且所述含水培养基包含用作共底物的乙酸和/或乙酸盐。
根据本发明的一个进一步的方面，根据本发明的任何方面生产的ω-羟基脂肪酸可以用作聚酰胺，特别是聚酰胺-12生产的原料。特别地，WO/2009/077461中公开的方法可以用于从根据本发明的任何方面生产的ω-羟基脂肪酸选择性地生产聚酰胺12。
根据本发明的一方面，提供了生产聚酰胺的方法，包括：
(i)通过本领域已知的任何手段将根据本发明的任何方面生产的ω-羟基脂肪酸转化为至少一种ω-氨基羟基脂肪酸；和
(ii)将所述ω-氨基羟基脂肪酸用作单体来进行聚合，以生产聚酰胺。
根据本发明的还另一方面，提供了至少一种C1至C4有机化合物用于增加发酵过程中从至少一种碳底物形成ω-羟基脂肪酸的选择性的用途，其中所述过程包括：
(a)在含水培养基中使所述碳底物与至少一种酵母细胞接触，其中所述酵母细胞能够将所述碳底物氧化为相应的ω-羟基脂肪酸和/或二羧酸；并且所述酵母细胞包含降低的脂肪酸降解能力，其中所述含水培养基包含至少一种C1至C4 有机化合物。特别地，所述C1至C4有机化合物是乙酸和/或乙酸盐。
概言之，所述ω-羟基脂肪酸可以进一步转化为ω-氧代羧酸，并且然后转化为ω-氨基羧酸，所述ω-氨基羧酸然后将通过聚合转化为聚酰胺。技术人将能够基于本领域已知的方法发现用于这些转化的合适技术。在一个实例中，可以将另外的酶，诸如烷烃单加氧酶、醇脱氢酶或醇氧化酶引入根据本发明的任何方面的细胞中，用于将所述ω-羟基脂肪酸转化为ω-氧代羧酸。细胞也可以表达至少一种ω-转氨酶以将ω-氧代羧酸转化为ω-氨基羧酸。在另一实例中，根据本发明的任何方面生产的ω-羟基脂肪酸可以引入能够将ω-羟基脂肪酸转化为ω-氨基羧酸的另外的细胞。
附图简述
图1是当根据比较实施例1用葡萄糖进料时随时间的10-羟基癸酸和癸二酸浓度曲线图。
图2是当根据实施例1用NaAc和HAc进料时随时间的10-羟基癸酸和癸二酸浓度曲线图。
图3是根据实施例2使用不同的烷烃底物情况下的ω-羟基脂肪酸和二羧酸浓度曲线图。
图4是当根据实施例3用NaAc进料时随时间的10-羟基癸酸和癸二酸浓度曲线图。
图5是当根据比较实施例2用葡萄糖进料时随时间的10-羟基癸酸和癸二酸浓度曲线图。
实施例
以上描述了优选实施方案，如本领域技术人员将理解的，在不背离权利要求的范围的情况下，所述优选实施方案可以在设计、构造或操作方面进行变化或修改。例如，这些变化意欲被权利要求的范围所涵盖。
材料和方法
在实施例中，通过使用GC-MS进行发酵产物的鉴定，并且经由气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)测定发酵产物的量。
通过TMS (三甲基甲硅烷基化)衍生化来处理发酵产物的样品，然后注入用于GC-FID分析。
详细程序如下：将样品溶解于乙酸乙酯或乙腈（如果必需）中，然后将溶液与衍生化试剂（N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺, BSTFA）以1:1(v/v)在2mL小瓶中(在300uL内插小瓶(insert vial)中80uL: 80uL)混合。此后，在烤箱中将混合物加热到80 ℃持续30分钟，然后注入GC-FID分析。
仪器: Agilent 7890B;
入口条件: 温度: 260 ℃, 分流比: 20:1; 注入体积: 1uL;
柱: Agilent 19091J-413L, HP5, 30m x 320um x 0.25um;
载气: 氦气;
柱流量: 恒定， 1 mL/min;
烤箱程序: 60 ℃ (保持1min), 10 ℃/min到300 ℃ (保持5min);
FID检测器:
温度: 280 ℃;
空气流量: 300 mL/min;
H2燃料流量: 30 mL/min;
尾吹气流量: 25 mL/min。
实施例1
种子培养期:
在100mL种子培养基中预培养热带假丝酵母ATCC20962菌株在琼脂板上的菌落，并且在1L带挡板摇瓶中以200 rpm, 30 ℃振荡20小时。
种子培养基含有(每升)：葡萄糖, 30g; 玉米浆(Sigma), 9g; KH2PO4,2g;K2HPO4, 1g; MgSO4, 1.0g; CaCl2, 0.1 g; NaCl, 0.1g; 尿素, 3.6g; 和1 mL/L的微量元素溶液 (每升: H3BO3, 0.5g; CuSO4·5H2O, 0.04g; KI, 0.1g; FeCl3·6H2O, 0.6g;MnSO4·H2O, 0.4g; Na2MoO4·2H2O, 0.2 g; ZnSO4·7H2O, 0.4 g)。
生长期:
将细胞以10 % (v/v)接种到1.4 L DASGIP发酵罐(DASGIP Parallel BioreactorSystems for Microbial Research and Development, 1L工作体积)中的400mL生长培养基中。加入30g/L癸烷以诱导相关酶诸如细胞色素P450的表达(He, F., (2005), Yeast,22:481-491; Van Beillen, J.B., (2006), App and Env. Microbiology:59-65 和Kogure T. (2007), FEMS Microbiol Lett: 106-111)。使培养物在30 ℃在1.0 vvm的通气速度下生长30小时作为生长期。通过自动加入4 mol/L NaOH或5 mol/L HCl溶液将pH保持在5.80。通过搅拌和O2-级联控制模式将溶解氧保持在25%饱和度。生长6小时后，基于以下公式将葡萄糖(600g/L)以指数方式进料，其中µ = 0.05 h-1且YX/S = 0.35g DCW (干细胞重量)/g葡萄糖且ms = 0.04g/g DCW*h。C S0 是底物浓度，C X0 是进料开始时的DCW。
生长培养基含有(每升)：葡萄糖, 30g; (NH4)2SO4, 8g; 玉米浆(Sigma), 9g;KH2PO4,2g; K2HPO4, 1g; MgSO4, 1.0g; CaCl2, 0.1 g; NaCl, 0.1g; 消泡剂204 (Sigma批号：MKBP4191V), 1mL和1 mL/L的微量元素溶液(每升: H3BO3, 0.5g; CuSO4·5H2O,0.04g; KI, 0.1g; FeCl3·6H2O, 0.6g; MnSO4·H2O, 0.4g; Na2MoO4·2H2O, 0.2 g;ZnSO4·7H2O, 0.4 g)。
转化期:
在30小时的生长期后开始癸烷的转化。用4 mol/L NaOH溶液在2小时中将pH逐渐升高至7.5。以0.4mL/h的速度将癸烷进料，并且以1.0-2.0mL/h的速度将NaAc (300g/L, pH7.5)进料 (Ac-的浓度是10g/L至30g/L)。然后通过自动加入75 % (v/v) HAc将pH保持在7.5。转化期持续130小时。不时取出培养液样品以测定细胞密度、残留葡萄糖、Ac-浓度和产物浓度。
酶促（葡萄糖氧化酶）检测残留葡萄糖的浓度，并且该浓度是不可检测的。
通过H-NMR方法对乙酸根(Ac-)的浓度进行定量，该方法针对具有已知浓度的内标(TMSP, 3-(三甲基甲硅烷基)丙-2,2,3,3-d4酸钠盐)计算样品。Ac-的浓度是10g/L至30g/L。
当用NaAc和HAc进料时随时间的10-羟基癸酸和癸二酸浓度显示于图2。
样品萃取:
通过添加5M HCl将200uL样品培养液酸化至pH 1-2，然后加入8倍(1.6mL)的乙酸乙酯(EA)。剧烈振荡后，通过25 ℃, 13000rpm下离心2分钟取出EA相。然后将1 mL EA相用于GC-FID分析以测定培养液中的氧化的产物（10-羟基癸酸和癸二酸）。
比较实施例1
种子培养期和生长期是按照实施例1的那些进行的。在转化期中，在30小时的生长期后开始癸烷的转化。用4 mol/L NaOH溶液在2小时中将pH逐渐升高至7.5。以0.4mL/h的速度将癸烷进料，并且以保持葡萄糖的浓度为大约10g/L的速度将葡萄糖(600g/L)进料。然后通过自动加入4 mol/L NaOH溶液将pH保持在7.5。转化期持续130小时。不时取出培养液
样品以测定细胞密度、残留葡萄糖和产物浓度。
如图1所示，当根据比较实施例1在转化期中将葡萄糖进料时，主要产物是癸二酸，其浓度在160小时为13.88g/L，并且几乎没有发现10-羟基癸酸(0.15g/L)。10-羟基癸酸的选择性是1.1%。
但是，如图2所示，当根据实施例1在转化期中将NaAc和HAc进料时，占优势的产物是10-羟基癸酸而不是癸二酸(在160小时，7.56g/L 10-羟基癸酸对0.96g/L癸二酸)。10-羟基癸酸的选择性是88.7%。
实施例2
种子培养期和生长期是按照实施例1的那些进行的。然后通过在4500rpm, 4℃离心4分钟收集诱导的细胞。进一步，用10mM PBS（磷酸缓冲盐溶液, pH7.5）洗涤收集的细胞以获得静息细胞。
将静息细胞的整分试样悬浮于在25mL 10mM PBS (pH7.5)中含有NaAc (28g/L)和烷烃底物(10g/L)的培养基中，以制备OD10的细胞悬浮液。将该细胞悬浮液用于转化期。分别将三种烷烃：癸烷、十一烷和十二烷作为底物测试。30℃和200rpm下在250mL Schott带挡板摇瓶（其中用纯氧替代空气）中进行转化期，持续24小时。酸化后用等量的乙酸乙酯萃取培养液中的产物。通过GC-FID测定每种产物的浓度定量。24小时的转化后，残留NaAc浓度为约2-3g/L。
图3中的结果显示，对于所有这三种底物，主要产物都是ω-羟基脂肪酸。10-羟基癸酸和癸二酸的浓度分别是0.452g/L和0.039g/L，并且10-羟基癸酸的选择性是92.0%。11-羟基十一酸和十一烷二酸的浓度分别是0.469g/L和0.098g/L，并且11-羟基十一酸的选择性是82.7%。12-羟基十二酸和十二烷二酸的浓度分别是0.502g/L和0.204g/L，并且12-羟基十二酸的选择性是71.1%。
实施例3
种子培养期:
在50mL种子培养基中预培养保藏号为CGMCC 14251的解脂亚罗酵母C122菌株（于2017年6月19日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院，100101，中国）在琼脂板上的菌落，并且在500mL带挡板摇瓶中以200rpm, 30 ℃振荡24小时。
种子培养基含有(每升): 葡萄糖, 10g; 蛋白胨, 20g; 酵母提取物, 10g; 癸烷, 3g。
然后通过在4500rpm, 4℃离心4分钟收集诱导的细胞。进一步，用10mM PBS（磷酸缓冲盐溶液, pH7.5）洗涤收集的细胞以获得静息细胞。
将静息细胞的整分试样悬浮于在25mL 10mM PBS (pH7.5)中含有NaAc (28g/L)和烷烃底物(40g/L)的培养基中，以制备OD20的细胞悬浮液。将该细胞悬浮液用于转化期。将癸烷作为烷烃底物测试。
转化期：
30℃和200rpm下在250mL Schott带挡板摇瓶（其中用纯氧替代空气）中进行转化期，持续24小时。酸化后用等量的乙酸乙酯萃取培养液中的产物。通过GC-FID测定每种产物的浓度定量。
图4是当根据实施例3用NaAc进料时随时间的10-羟基癸酸和癸二酸浓度曲线图。图4中的结果显示，主要产物是ω-羟基脂肪酸。10-羟基癸酸的浓度是0.260g/L，并且10-羟基癸酸的选择性是58.3%。
比较实施例3
种子培养期和转化期是按照实施例3的那些进行的，不同之处是在转化期中，用葡萄糖(20 g/L)替代了NaAc。
图5中的结果显示，主要产物是癸二酸。癸二酸的浓度是0.205g/L，并且10-羟基癸酸的选择性是4.0%。

Claims (15)

1.生产至少一种ω-羟基脂肪酸的方法，所述方法包括：
(a)在含水培养基中使至少一种烷烃与至少一种酵母细胞接触，其中所述酵母细胞能够将所述烷烃氧化为相应的ω-羟基脂肪酸，并且所述酵母细胞包含降低的脂肪酸降解能力；所述降低的脂肪酸降解能力是以下的结果：
(i)至少一种参与β-氧化途径的酶相对于野生型细胞表达降低；和/或
(ii)至少一种参与β-氧化途径的酶中的至少一种失功能突变；并且
所述含水培养基包含用作共底物的乙酸和/或乙酸盐。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)中的乙酸和/或乙酸盐浓度是至少20mmol/L。
3.根据权利要求1或2的任一项的方法，其中所述乙酸和/或乙酸盐浓度保持在80-800mmol/L之间。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述乙酸和/或乙酸盐浓度保持在160-500mmol/L之间。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述含水培养基包含不可检测浓度的葡萄糖。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述乙酸和/或乙酸盐选自NaAc和HAc。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述烷烃包含至少6个碳原子。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述烷烃选自C7-C22烷烃。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述烷烃选自C10-C12。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述酵母细胞选自假丝酵母属（Candida）、亚罗酵母属（Yarrowia）、毕赤酵母属（Pichia）、球拟酵母属（Torulopsis）、红酵母属（Rhodotorula）和拟威克酵母属（Wickerhamiella）。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述酵母细胞选自热带假丝酵母（Candida tropicalis）和解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述降低的脂肪酸降解能力是至少一种选自下组的酶相对于野生型细胞表达降低的结果：酰基辅酶A脱氢酶、2,4-二烯酰辅酶A还原酶、烯酰辅酶A水合酶和3-酮脂酰辅酶A硫解酶。
13.酵母细胞用于在含水培养基中从至少一种烷烃生产至少一种ω-羟基脂肪酸的用途，其中所述酵母细胞能够将所述烷烃氧化为相应的ω-羟基脂肪酸，并且所述酵母细胞包含降低的脂肪酸降解能力；所述降低的脂肪酸降解能力是以下的结果：
(i)至少一种参与β-氧化途径的酶相对于野生型细胞表达降低；和/或
(ii)至少一种参与β-氧化途径的酶中的至少一种失功能突变；并且
所述含水培养基包含用作共底物的乙酸和/或乙酸盐。
14.根据权利要求13的用途，其中乙酸和/或乙酸盐浓度保持在20-800mmol/L之间。
15.根据权利要求13或14的任一项的用途，其中所述烷烃选自C7-C22烷烃。
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