JP6997758B2 - オメガ－ヒドロキシル脂肪酸の生成工程 - Google Patents

オメガ－ヒドロキシル脂肪酸の生成工程 Download PDF

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Description

CGMCC 14251
本発明は、少なくとも１つのアルカンから少なくとも１つのω－官能化カルボン酸を生成するためのバイオテクノロジ方法に関する。具体的には、この方法は、アセテートの存在下で酵母細胞を用いて、少なくとも１つのアルカンからそれに対応するω－ヒドロキシルカルボン酸及び／又はそのエステルを生成してもよい。
ω－ヒドロキシル脂肪酸は非常に価値のあるモノマーであり、プロエチレン状のバイオ系プラスチック類の合成に用いることができる。現在、ω－ヒドロキシル脂肪酸は主に、高価の触媒や厳しい条件を必要とする化学的手段により生成されている。従って、ω－ヒドロキシル脂肪酸を生成するためのバイオテクノロジ手段が好ましい。
本技術分野において知られているω－ヒドロキシル脂肪酸及び／又はそのエステルを生成するためのいくつかのバイオテクノロジ手段がある。例えば、基質に当たるカルボン酸からω官能化カルボン酸を生成することができる遺伝子組換え細胞が、少なくともＷＯ２００９０７７４６１及びＥＰ２３２２５９８に記載されている。ＷＯ２０１１００８２３２に記載の、カンジダ細胞を用いる類似の手順では、細胞においてβ酸化経路が遮断され、ω官能化カルボン酸が基質として用いられる脂肪酸から形成される。これらの方法は、出発原料として脂肪酸を使用するという欠点を有する。これは、用いられる脂肪酸やその誘導体は、主に、動植物油脂からのみ得られるためである。原料としての動物脂肪はいまだに顧客の受け入れをほとんど受けておらず、短鎖脂肪酸及び中鎖脂肪酸を含有する植物油は、入手が難しいか又は熱帯地域でのみ生産される（熱帯雨林の破壊の結果）。さらに、特定の動植物油脂原料は、特定の、しかし明確に定義された脂肪酸プロファイルを有し、その結果、結合生成をもたらす。
ＷＯ２０１３０２４１１４は、ω官能化カルボン酸及び／又はそのエステルを生成する方法を開示しており、ω官能化カルボン酸及び／又はそのエステルには、単一の炭素源（例えば、グルコース、サッカロース、アラビノース、キシロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロース、ヘミセルロースとなるが、グリセリン、又はＣＯ２、ＣＯ、合成ガスなど、非常に単純な構造の有機分子も含まれる）から得るω－ヒドロキシル脂肪酸が含まれる。これらの単糖、特にグルコースは、通常、取得コストがさらにかかる。単純な炭素源からω－ヒドロキシル脂肪酸及び／又はそのエステルを生成する方法は、また、まずこの方法で用いられる細胞に遺伝子組換えを加えてこれらの単純な炭素源から得られるカルボン酸の生成量を増加させなければならないため、非常に複雑であると考えられる。従ってこれは生成コストを増大させる。
Candida cloacae及びCandida tropicalisは、アルカンを唯一の炭素源として増殖することができることが見出された。例えば、Candida tropicalisは、中鎖～長鎖のアルカンを酸化し、ジカルボン酸を合成することができる。合成されたジカルボン酸は、β酸化経路を介して分解されることが知られている。β酸化経路が遮断又は抑制されるCandida tropicalisでは、ジカルボン酸が常に主生成物であり、非常に少量のω－ヒドロキシル脂肪酸が低い選択率で生成される。
よって、脂肪酸及び／又は単純炭素の他に、炭素源からω－ヒドロキシル脂肪酸を生成するための、環境に優しく、単純且つ持続可能な方法が本分野において必要とされている。
本発明は、少なくとも１つのアルカンを酸化する方法を提供し、この方法は、アセテートの存在下で実施してもよいバイオ触媒法である。具体的には、アセテートは、アルカンを酸化して、少なくとも１つのω－ヒドロキシル脂肪酸を生成するための補基質（co-substrate）として用いられてもよい。アルカンからω－ヒドロキシル脂肪酸を生成する方法においてこれらの遺伝子組換え細胞を使用することで、これらの化合物の生成に対して容易に入手可能な代替の石油化学原料の使用を可能とし、生成に柔軟性を与えることができる。さらに、アルカンをそれらの中でω－ヒドロキシル脂肪酸に転換する手段の全てを統合することができる全細胞バイオ触媒を用いると、転換に含まれる工程ステップの数が少ないため、転換工程がより単純なものとなる。ω－ヒドロキシル脂肪酸の生成が、脂肪酸などの一般的に用いられる高価な炭素基質に依存することもなくなる。
本発明は、少なくとも１つの炭素基質から少なくとも１つのω－ヒドロキシル脂肪酸を生成する方法であって、
（ａ）水性培地中で炭素基質を少なくとも１つの酵母細胞と接触させることを含み、酵母細胞は、炭素基質を対応するω－ヒドロキシル脂肪酸及び／又はジカルボン酸に酸化することができ、さらに酵母細胞は低減された脂肪酸分解能力を含み、水性培地は、少なくとも１つのＣ１～Ｃ４有機化合物を含む、方法を提供する。
具体的には、脂肪酸分解能力は、
（ｉ）野生型細胞に比べてベータ酸化経路に係る少なくとも１つの酵素の発現の減少、及び／又は、
（ｉｉ）ベータ酸化経路に係る少なくとも１つの酵素における少なくとも１つの機能喪失型変異、によって低下してもよい。
Ｃ１～Ｃ４有機化合物は、補基質として用いられてもよい。補基質は、少なくとも１つのＣ１～Ｃ４有機化合物であってもよい。具体的には、Ｃ１～Ｃ４補基質は、エネルギ源であってもよく、Ｃ１～Ｃ４アルカン、Ｃ１～Ｃ４アルコール、Ｃ１～Ｃ４アルデヒド、Ｃ１～Ｃ４カルボン酸、Ｃ１～Ｃ４カルボン酸塩、及びこれらの混合物からなる群から選択されてもよい。より具体的には、補基質は、少なくとも１つのＣ２～Ｃ４有機化合物であってもよい。補基質は、Ｃ２～Ｃ４アルカン、Ｃ２～Ｃ４アルコール、Ｃ２～Ｃ４アルデヒド、Ｃ２～Ｃ４カルボン酸、Ｃ２～Ｃ４カルボン酸塩、及びこれらの混合物からなる群から選択されてもよい。具体的には、補基質は、少なくとも１つのＣ２～Ｃ４アルカンであってもよい。Ｃ２～Ｃ４補基質は、分枝でも非分枝でもよい。一例では、補基質は、少なくとも１つのＣ２～Ｃ４アルコールであってもよい。Ｃ２～Ｃ４アルコールは、一価アルコール及び多価アルコールを含んでもよい。Ｃ１～Ｃ４補基質は、酢酸塩、酢酸、プロパン酸、プロピオン酸塩、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、グリセロールからなる群から選択されてもよい。一例では、Ｃ１～Ｃ４有機化合物は、水性培地においてエネルギ源として用いられる唯一の補基質である。この例では、水性培地は、少なくとも１つのＣ１～Ｃ４有機化合物を補基質として含み、グルコースを含有しない。より具体的には、水性培地は、検出可能なグルコースを含んでいない。
本発明のいずれかの態様によると、炭素基質は、アルカン、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、及びそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。具体的には、炭素基質は、７～２２の炭素数を有してもよい。より具体的には、炭素基質は、８～２２、８～２０、８～１９、９～１８、１０～２２、１２～２２、１０～２０、１０～１８、１０～１６、１０～１４、７～１４、又は１０～１２の炭素原子を有してもよい。さらにより具体的には、７～２２、１０～１４、７～１４、又は１０～１２の炭素原子を有するアルカンであってもよい。
本発明の一態様において、少なくとも１つのアルカンから少なくとも１つのオメガヒドロキシル脂肪酸を生成する方法であって、
（ａ）水性培地中でアルカンを、少なくとも１つの酵母細胞と接触させることを含み、酵母細胞は、アルカンを対応するω－ヒドロキシル脂肪酸に酸化することができ、さらに酵母細胞は低減された脂肪酸分解能力を含み、水性培地は、アセテートを含む、方法を提供する。
具体的には、脂肪酸分解能力は、
（ｉ）野生型細胞に比べてベータ酸化経路に係る少なくとも１つの酵素の発現の減少、及び／又は、
（ｉｉ）ベータ酸化経路に係る少なくとも１つの酵素における少なくとも１つの機能喪失型変異、によって低下してもよい。
アセテートは補基質として用いられてもよい。酵母細胞を含む水性培地中にアセテートが存在すると、アルカンからのω－ヒドロキシル脂肪酸の形成に対する選択率が増大する。具体的には、ω－ヒドロキシル脂肪酸の選択率は、発酵生成物の総重量、つまり、アセテートの不在下での方法に対するω－ヒドロキシル脂肪酸及びジカルボン酸の総重量に基づき、最大７０％、あるいは最大７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であってもよい。
従って、本発明の方法は、少なくとも１つのアルカンから少なくとも１つのω－ヒドロキシル脂肪酸を生成する方法であって、アセテータが水性培地中に存在しない方法に比べてω－ヒドロキシル脂肪酸の形成の選択率が増大している方法であってもよい。具体的には、本発明のいずれかの態様による方法では、ジカルボン酸などの副生成物の形成量がより少ない。従って、出発原料の無駄が少なくなり、オメガ－ヒドロキシル脂肪酸の生成において最も費用対効果の高い方法となる。結果として、収率がより高くなる、及び／又は、より高い収率をより短期間で得られる。これはさらにコストと時間の節約をもたらす。
本明細書で用いられる「アセテート」という用語は、酢酸とその塩の両方を指し、本分野で知られているように、微生物は水性環境で作用し、存在する塩と酸の間には常に均衡が取れているため、必然的に生成される。アセテートは、本発明のいずれかの態様による方法において補基質として用いられてもよい。酢酸に対する分子酢酸の比率は系のｐＨに依存し、つまり、「アセテート」濃度が一定である場合、ｐＨが低いほどアセテート塩に比べて分子酢酸の濃度が高くなる。
本発明のいずれかの態様による水性培地中の補基質の濃度は、極めて重要な要因である。補基質の濃度は、８０～８００ｍｍｏｌ／Ｌ、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１１０～５００、１２０～５００、１３０～５００、１４０～５００、１５０～５００、１６０～５００、１６０～５５０、１６０～４５０、１６０～４００、１５０～３５０ｍｍｏｌ／Ｌなどの範囲から選択されてもよい。
具体的には、補基質はアセテートであってもよい。本発明のいずれかの態様によって用いられる水性培地中のアセテートの濃度は、言及された特定の濃度で維持されてもよい。具体的には、本発明のいずれかの態様による方法の水性培地中に存在するアセテートの最小濃度は、少なくとも８０ｍｍｏｌ／Ｌであってもよい。より具体的には、水性培地中に存在するアセテートの濃度は、約８５ｍｍｏｌ／Ｌ、９０ｍｍｏｌ／Ｌ、９５ｍｍｏｌ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１６０ｍｍｏｌ／Ｌ、１７０ｍｍｏｌ／Ｌ、１８０ｍｍｏｌ／Ｌ、１９０ｍｍｏｌ／Ｌ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ、３００ｍｍｏｌ／Ｌ、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ、４００ｍｍｏｌ／Ｌ、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ、５５０ｍｍｏｌ／Ｌ、６００ｍｍｏｌ／Ｌ、６５０ｍｍｏｌ／Ｌ、７００ｍｍｏｌ／Ｌ、７５０ｍｍｏｌ／Ｌ、８００ｍｍｏｌ／Ｌ以上であってもよい。一例では、水性培地中のアセテートの濃度は、本発明のいずれかの態様による酵母細胞の酸化能力を抑制することになり得る濃度より低くてもよい。より具体的には、水性培地中のアセテートの濃度は、０ｍｍｏｌ／Ｌを超えてもよい。さらにより具体的には、水性培地中のアセテートの濃度は、検出可能な量であってもよい。水性培地中のアセテートの濃度は、２０～８００ｍｍｏｌ／Ｌ、３０～８００、４０～８００、５０～８００、６０～８００、７０～８００、８０～８００、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１１０～５００、１２０～５００、１３０～５００、１４０～５００、１５０～５００、１６０～５００、１６０～５５０、１６０～４５０、１６０～４００、１５０～３５０ｍｍｏｌ／Ｌなどの範囲から選択されてもよい。一例では、水性培地中のアセテートの濃度は、１６０ｍｍｏｌ／ｌ以上５００ｍｍｏｌ／ｌ以下である。
本明細書における「約」という用語は、２０％以内の変動を指す。具体的には本明細書において「約」という用語は、所与の測定値又は数値の±２０％、より具体的には±１０％、さらにより具体的には±５％を指す。
当業者であれば、本分野で知られている方法によってアセテートの濃度を所望の値に維持することができるであろう。具体的には、当業者は水性培地中のアセテート濃度を定期的に測定し、それに応じて培地により高濃度又はより低濃度のアセテートを添加することでアセテートの濃度を調整することができる。当業者であれば、既知の方法を用いて水性培地中のアセテート濃度を測定することができる。例えば、アセテート比色検定キット（Sigma-Aldrich）、真空蒸留及びガスクロマトグラフィ、導電率の測定、紫外／可視分光光度測定、及び本分野で既知の他の方法を用いてもよい。一例では、ＮＭＲを用いてアセテートを測定することができる。具体的には、判定量的１Ｈ－ＮＭＲ分光法を用いてアセテートの濃度を測定することができる。内部定量標準としてトリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム（Ｔ（Ｍ）ＳＰ）を使用してもよい。別の例では、R-Biopharmの酵素キット（品番：10148261035）を使用し、製造業者の指示に従ってアセテートの濃度を測定する。一例では、水性培地の連続供給とは別途の連続流によりアセテートを水性培地に添加する。別の例では、アセテートは補給される培地の一部である。具体的には、アセテートを栄養素供給物の一部として又は別々に水性培地に供給してもよい。水性培地にアセテートをいずれの経路から供給するとしても、当業者であれば、水性培地中のアセテート濃度を維持するための手段を理解するであろう。一例では、発酵過程において約２０時間毎にアセテートを補給し、培地中のアセテート濃度を維持する。別の例では、培養及び／又は発酵工程の開始時点から約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２５時間、約３０時間毎に培地におけるアセテートの補給を行う。別の例では、アセテートはオメガ－ヒドロキシル脂肪酸を生成する方法に使用されなくてもよいため、アセテートを必ずしも補充する必要はない。
具体的には、アセテートは、細胞内でエネルギを生成し等価物を還元する補基質（ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ／ＦＡＤＨ）であってもよい。この反応の副生成物は、二酸化炭素であってもよい。本明細書において「補基質」という用語は、多基質酵素によって用いられて反応を行う基質を意味する。例えば、アセテート及び／又はエタノールを消費し、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ／ＦＡＤ＋のような他の補基質を還元してＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ／ＦＡＤＨをそれぞれ生成するエネルギを生成してもよい。よって、エタノール及び／又はアセテートを使用して、細胞の水性培地又は細胞質ゾル中のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ、及び／又はＦＡＤ＋／ＦＡＤＨの比率を維持してもよい。具体的には、反応は、下記のものであってもよい。
アセチルＣｏＡ＋ＮＡＤ＋ → ＮＡＤＨ＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２（反応１）
一例では、水性培地中のアセテート濃度は、反応期間の８０％にわたって本発明のいずれかの様態によって使用される任意の濃度に維持される。別の例では、反応時間の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％の時間にわたってアセテートの濃度を維持する。これについて、「反応時間」とは、工程が行われる間の期間を意味する。具体的には、反応時間とは、炭素基質の所望の生成物、つまりオメガ－ヒドロキシル脂肪酸及び／又はジカルボン酸への転換が起こる期間を指す。一例では、反応時間とは、反応が開始してから反応が終了、及び／又は完了するまで、つまり基質が使い果たされるまでの期間を指す。一例では、基質はアルカンであってもよく、発酵槽内のアルカンが使い果たされて反応が停止し、さらなるアルカンが発酵槽に供給されなくなったときに、反応が完了する。従って反応時間は、転換の開始（つまり、適切な反応条件で容器内の酵母細胞と接触したアルカンが、検出可能な量の所望の生成物、つまりオメガ－ヒドロキシル脂肪酸及び／又はジカルボン酸へ最初に転換されるとき）から、反応の終了（つまり、アルカンなどの炭素基質が全てなくなったとき、及び／又は、容器内で反応の継続を止める別の制限要因が生じたとき）までの期間を意味する。一例では、反応期間は２４時間、４２時間、７２時間、９６時間、１００時間、１２０時間、１５０時間、１８０時間、２００時間、２２０時間、２４０時間などである。別の例では、反応期間は１１５時間、１１６時間、１１７時間、１１８時間、１１９時間、１２０時間、１２１時間などである。
混合物から得た残りのアセテートは再使用してもよい。具体的には、形成したω－ヒドロキシル脂肪酸を本分野で既知の手段により蓄積し、次いで分離してもよいことを意味する。それによって、残りのアセテートが反応混合物中に維持され、再利用することができる。オメガ－ヒドロキシル脂肪酸は、回分式又は連続式で除去してもよい。後者の場合、形成したオメガ－ヒドロキシル脂肪酸を、本分野で既知の分離ステップにより連続して除去する。
本発明のいずれかの態様による方法は、アセテートを生成するためのより初期のステップを含んでもよい。アセテートは、オメガ－ヒドロキシル脂肪酸の生成に用いられる少なくとも酵母細胞にこの化合物を外因的に導入するための、本分野で既知の手段により生成してもよい。具体的には、アセテートはＮａＡｃ、ＨＡｃ及び／又はその他同類のものから水性培地に導入してもよい。
一例では、転換期中にＮａＡｃを供給してもよく、自動ｐＨ調整によりＨＡｃを供給してもよい。本明細書における「転換期」という用語は、微生物が基質を目標の発酵生成物に転換する発酵段階を指す。例えば、転換期とは、Candida tropicalis ATCC20962がアルカンをω―ヒドロキシル脂肪酸に転換させる発酵段階を指すことができる。
転換期は、微生物細胞周期において、増殖期に続いてもよい。本明細書における「増殖期」という用語は、微生物細胞周期における定常期と比べ、微生物の数がより急速に増加する期間を指す。増殖期は、微生物細胞周期における遅滞期及び次数増殖期（exponential growth phase）に対応してもよい。
従って、本発明のいずれかの態様による方法は、より初期のステップとしてａ’）酵母細胞を生成するステップを含んでもよい。このステップの目的は、細胞数を増やすことである。このステップは、微生物細胞周期における増殖期に対応してもよい。このステップでは、細胞は、本分野で既知の方法によって最適な増殖のためにグルコースなどの基質などの少なくとも１つのエネルギ源中で培養してもよい。
一例では、酵母細胞の転換期中に、炭素基質を対応するオメガ－ヒドロキシル脂肪酸へ酸化させる。転換期中には、これ以上のエネルギ源を追加せずともよい。補基質を転換期中に最初に追加してもよい。この段階の間、酵母細胞の増殖期に存在していた検出可能なエネルギ源はほとんど存在しない。エネルギ源は、グルコース、サッカロース、フルクトース、酢酸、グリセリンなどからなる群から選択されてもよい。転換期中において、エネルギ源は、検出できない濃度であってもよい。具体的には、エネルギ源の濃度は、培地中で５、０．５、０．３、０．２、又は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満であってもよい。具体的には、増殖期中のエネルギ源は、グルコースであってもよい。本発明のいずれかの態様による転換期では、グルコースの濃度は２０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であってもよい。具体的には、グルコースの濃度は、培地中で５、０．５、０．３、０．２、又は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満であってもよい。この例では、エネルギ源は、本発明のいずれかの態様による補基質とは異なる。
別の例では、本発明のいずれかの態様に従って使用するエネルギ源は、使用する補基質と同じである。具体的には、使用する補基質は、少なくとも１つのＣ１～Ｃ４有機化合物であってもよく、これは、増殖期の有機体のエネルギ源でもあり得る。より具体的には、補基質であってもよいエネルギ源は、酢酸、グリセロールなどであってもよい。
本発明のいずれかの態様による酵母細胞は、培養上清中に、高時空収率、高炭素収率及び高濃度で、全てのアルカンからオメガ－ヒドロキシル脂肪酸を生成するために使用してもよい。これらの利点の結果として、効率的な後処理を促進することができる。
酵母細胞はアルカンを対応するオメガ－ヒドロキシル脂肪酸に酸化することができる。これは野生型細胞に天然に存在する形質である。アルカンを対応するオメガ－ヒドロキシル脂肪酸へ転換するために必要な酵素は、酵母細胞におけるω酸化経路の一部であってもよい。一例では、アルカンを対応するオメガ－ヒドロキシル脂肪酸へ転換するために必要な酵素は、酵母細胞に遺伝的に導入することができる。アルカンを対応するオメガ－ヒドロキシル脂肪酸へ転換するために必要な酵素は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰタンパク質）、及び付随するＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＮＣＰ）を含む、シトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ複合体、脂肪アルコールオキシダーゼ、脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼなどからなる群から選択される。当業者であれば、アルカンを対応するω－ヒドロキシル脂肪酸へ転換できるようにするために、組換え手段によって酵母細胞に導入してもよい酵素を容易に同定することができる。別の例では、酵母細胞は、アルカンを対応するオメガ－ヒドロキシ酸に酸化するために必要な酵素を天然に含む。
酵母細胞はさらに、脂肪酸分解能力が低下していてもよい。本分野で既知の組換え技術を用いた遺伝子組換えによって野生型細胞の脂肪酸分解能力を低下させてもよい。一例では、本分野で既知の方法を用いて野生型株のCandida tropicalis ATCC20336に遺伝子組換えを施し、脂肪酸分解能力を低下させている。具体的には、Pictaggio, S(1992)Biotechnology, 10:894-97に開示された方法を用いて細胞を改変し、ATCC20962を生成してもよい。別の例では、野生型酵母細胞の脂肪酸分解能力が元から低下／抑制している。例えば、脂肪酸分解能力の低下した野生型酵母細胞は、Candida lipolytica由来の株である。具体的には、この株は、Institute of Forestry and Pedology, Academia Sinica(1979, Acta Microbiologica Sinica, 19(1):64-70)に開示されているCandida lipolytica19-2であってもよい。
本明細書において、細胞と組み合わせて用いられる「野生型」という語句は、野生で見られるような形態のゲノム構成を有する細胞を意味している。この用語は、全細胞及び個々の遺伝子の両方に適用可能である。従って、「野生型」という用語は、他の態様において（つまり、１つ以上の遺伝子に対して）遺伝子組換えを行っているが、対象遺伝子に対しては遺伝子組換えを行っていない細胞も含まれてもよい。よって「野生型」という用語は、対象となる特定の遺伝子の遺伝子配列が組換え法を用いて人の手により少なくとも部分的に書き換えている細胞は含まない。故に、本発明のいずれかの態様による酵母細胞は、人為的な手段により全ゲノム及び／又は特定の遺伝子に対して遺伝子変異が生じていない細胞を指す。一例では、野生型酵母細胞は、アルカンを対応するオメガ－ヒドロキシアルキル脂肪酸に酸化することができる酵素の野生型発現、及び／又は脂肪酸分解能力の低下している酵母細胞をもたらす関連する酵素の野生型発現を含む。従って、一例では、Ｅ１酵素に対する野生型細胞は、細胞内でＥ１酵素の天然の／未変異の発現を示す細胞を意味する。脂肪酸分解に係る酵素に関する野生型細胞は同様に解釈してよく、細胞内でこれらの特定の酵素の天然の／未変異の発現を示す細胞を意味し得る。また別の例では、野生型細胞は、ベータ酸化経路に係る少なくとも１つの酵素が天然の機能喪失型変異を起こしている。従って、野生型酵母細胞は、自然発生の突然変異を有する酵母細胞を含んでもよい。このような自然発生の突然変異は、ベータ酸化経路に係る少なくとも１つの酵素に生じ、よって自然発生の突然変異を有しない細胞と比べて脂肪酸分解能力が低下している細胞をもたらす。野生型細胞における酵素の突然変異は、酵素の発現の減少、又は機能のない酵素の発現の減少をもたらす。
具体的には、本明細書における「脂肪酸分解能力の低下」という用語は、通常の脂肪酸分解能力を有する野生型細胞が同条件下で示すはずの分解速度よりも低い速度で、それぞれの細胞が脂肪酸、特に環境から取り込まれた脂肪酸を分解することを意味する。より具体的には、そのような細胞の脂肪酸分解は、β酸化経路に係る酵素をコード化する少なくとも１つの遺伝子の欠失、抑制、又は不活性化により低下する。一例では、β酸化経路に係る少なくとも１つの酵素は、それぞれの野生型微生物における同程度の条件下で、同じ酵素と比べて５％、１０％、２０％、４０％、５０％、７５％、９０％、又は９９％の活性を失っている。別の例では、本発明のいずれかの態様により用いられる酵母細胞は、野生型細胞、又は対照群の細胞に対して、例えば最大９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、又は０％の脂肪酸分解能力を有している。
当業者であれば、細胞内の酵素をコード化する遺伝子の欠失、あるいは酵素の活性減少に用いられる様々な技術、例えばSambrook/Fritsch/Maniatis(1989)に記載の、放射能への暴露により生じた変異体の蓄積又はスクリーニング、点当然変異の部位特異的導入、あるいは、活性酵素をコード化する染色体上に組み込まれた遺伝子のノックアウトに精通している。
より具体的には、細胞の脂肪酸分解能力は、様々な方式により低下させてもよい。本明細書における「遺伝子の欠失」という用語は、遺伝子をコード化する核酸配列を修飾し、遺伝子によりコード化された活性ポリペプチドの発現を減少させることを意味する。酵素の発現は、細胞内の酵素の活性を意味することがある。例えば、ポリペプチドの触媒活性中心をコード化する配列を含む配列の一部に対してインフレーム除去を行い、遺伝子を欠失させてもよい。あるいは、リボソーム結合部位を変化させ、リボソームが対応するＲＮＡをそれ以上翻訳しないようにしてもよい。当業者は、酵素学の教科書、例えばCornish-Bowden(1995)に記載されている標準アッセイを用いて、生細胞により発現された酵素の活性を測定することができる。
一連の酵素触媒反応により脂肪酸を分解することができる。まず、取り込まれた脂肪酸は、少なくとも１つの外膜タンパク質、及び脂肪酸－ＣｏＡリガーゼ活性を有する１つの内膜関連タンパク質が係る輸送／アシル活性化メカニズムを介して細胞膜を横切って移動する。細胞内では、分解される脂肪酸は、β酸化経路の他の反応を触媒する酵素に晒される。ベータ酸化経路に係る酵素に関する一般的な説明は、少なくともBeopoulos, A.(2011)Appl Microbio Biotechnol, 90:1193-1206に開示されている。第１の細胞内ステップには、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼを介してアシル－ＣｏＡがエノイル－ＣｏＡへ転換するプロセスを含む。アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性を、本分野において既知の任意の方法により検定してもよい。例えば、１００ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、０．２ｍＭエノイル－ＣｏＡ、０．４ｍＭ ＮＡＤ＋において、３４０ｎｍでＮＡＤＨ濃度を、分光光度法でモニタリングする方法がある。結果として得られたエノイル－ＣｏＡは、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ／３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼの触媒作用の下、水和及び酸化により３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡを介して３－ケトアシル－ＣｏＡに転換する。エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ／３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、より具体的には、生成物ＮＡＤＨの形成は、本分野で記載されているように、分光光度法で検定してもよい。最後に、３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼは３－ケトアシル－ＣｏＡの開裂を触媒して、アセチル－ＣｏＡと、炭素原子２個分短くなった入力アシル－ＣｏＡを得る。ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼの活性は、例えばAntonenkov, V(1997)のような最新技術の記載に従って検定してもよい。
別の例では、β酸化経路に係る酵素は、脂肪酸、又はその誘導体を基質と見なすことによって、それをβ酸化経路の一部として形成される代謝産物に転換する。例えば、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．９９．－）は、脂肪酸ＣｏＡと相互作用をきたし、脂肪酸ＣｏＡエステルを、β酸化の一部として形成される代謝産物のエノイルＣｏＡに転換するので、β酸化経路に係る酵素となる。別の例では、本明細書における「β酸化経路に係る酵素」という用語は、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．９９．－）、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）、３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３５）、３－ケト－アシル－ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６）を含む群から任意に選択したポリペプチドを有する。アシル－ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ６．２．１．１）は、脂肪酸が、脂肪酸のＣｏＡエステル、つまりカルボキシ基の官能基－ＯＨが－Ｓ－ＣｏＡで置換されている分子へ転換し、この脂肪酸をβ酸化経路に導入するプロセスを触媒することができる。一例では、本明細書における「アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、β酸化経路の一部として、アシル－ＣｏＡからエノイル－ＣｏＡへの転換を触媒することができるポリペプチドである。本明細書における「エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ」という用語は、３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとも呼ばれ、β酸化経路の一部として、水和及び酸化を介してエノイル－ＣｏＡから３－ケトアシル－ＣｏＡへの転換を触媒することができるポリペプチドを意味する。本明細書における「ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ」という用語は、３－ケトアシル－ＣｏＡの開裂を触媒することができ、β酸化経路の最終ステップとして炭素原子２個分短くなったアシル－ＣｏＡ及びアセチル－ＣｏＡをもたらすことができるポリペプチドを意味する。
一例では、脂肪酸分解能力は、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４－ジエノイル－ＣｏＡレダクターゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ、アシル－コエンザイムＡオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素の、野生型細胞と比較した発現の減少が原因となり低下する。脂肪酸分解能力はまた、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４－ジエノイル－ＣｏＡレダクターゼ、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ、３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ、アシル－コエンザイムＡオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素の機能喪失が原因となり低下する。具体的には、発現の減少及び／又は機能喪失を伴う酵素は、アシル－コエンザイムＡオキシダーゼ（ＥＣ６．２．１．３）であってもよい。さらに具体的には、アシル－コエンザイムＡオキシダーゼは、ＰＯＸ１、ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、ＰＯＸ６からなる群から選択されてもよい。
本発明のいずれかの態様による酵母細胞の脂肪酸分解能力は、上述の通り、ベータ酸化経路に係る少なくとも１つの酵素における、少なくとも１つの機能喪失型変異（loss-of function mutation）が原因となり、低下することがある。機能喪失型変異は、自然発生の現象であってもよい。別の例では、機能喪失型変異は、遺伝的手段により誘導される。自然発生の又は人為的な機能喪失型変異により、細胞は、この変異の生じてない等量の細胞に比べて、β酸化経路に係る特定の酵素を生成する。しかしながら、細胞内の突然変異は、細胞が正常に機能しない酵素を生成することもある。一般的に、本発明のいずれかの態様による機能喪失型変異は、時に、ベータ酸化を大幅に減少させるか又は完全に消失させる。機能喪失型変異は、ベータ酸化の実質的な減少をもたらす、点突然変異、挿入、欠失（全欠失又は部分欠失）、遺伝子置換であってもよい。これらの機能喪失型変異は自然発生のものであってもよく、又は組換え手段によるものであってもよい。
脂肪酸のベータ酸化が減少する酵母株は、ベータ酸化に直接係る酵素をコード化する少なくとも１つの遺伝子において、少なくとも１つの機能喪失型変異を有する全ての株を含む。これらの株はさらに、ペルオキシソームの生合成及び機能を介する場合を含めて、間接的にのみベータ酸化に影響を与える少なくとも１つの機能喪失型変異を有する全ての株を網羅する。本発明のいずれかの態様によるこれらの細胞は、ベータ酸化経路に係る少なくとも１つの酵素における突然変異の組合せ、あるいはベータ酸化経路に係る２つ以上の酵素における突然変異の組合せを有してもよい。一例では、本発明のいずれかの態様による酵母細胞は、ＰＯＸ１、ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４、ＰＯＸ５、ＰＯＸ６、ＭＦＥ１、ＰＯＴ１からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの機能喪失型変異を有してもよい。この突然変異は、遺伝子で自然発生又は組換え手段により生じてもよい。
本発明のいずれかの態様により用いられる酵母細胞は、少なくとも１つのアルカンを対応するω－ヒドロキシル脂へ転換することができる。一例では、本発明のいずれかの態様による酵母細胞は、アルカン、特にｎ－アルカンを一次酸化又はモノ末端酸化する能力を有する。
本発明のいずれかの態様による酵母細胞は、カンジダ（Candida）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、ピチア（Pichia）属、トルロプシス（Torulopsis）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ウイッカーハミーラ（Wickerhamiella）属からなる群から選択されてもよい。具体的には、酵母細胞は、Candida tropicalis、Candida cloacae、Yarrowia lipolytica、Schizosaccharomyces pombe、Rhodotorula glutinis、Wickerhamiella domercqiaeなどからなる群から選択されてもよい。
一例では、酵母細胞のβ酸化経路は、遮断されているか、あるいは抑制されている。この特徴は、細胞内に自然発生したものであってもよく、本分野で既知の遺伝的手段により導入されてもよい。さらなる例では、この細胞は、受け入れ番号CGMCC14251のYarrowia lipolyticaC122株、あるいはCandida tropicalis ATCC20962株（２０１７年６月１９日付で中国北京市朝陽区北辰西路１街（100101）所在の中国科学院微生物研究所中国公共微生物培養収集センターに寄託）であってもよい。Yarrowia lipolytica CGMCC14251は、アルカン（ドデカンなど）又は脂肪酸（ドデカン酸など）を唯一の炭素源とする最小培地では増殖できないという表現型を有している。
一つの特定の例では、Candida tropicalis ATCC20336から由来する株、例えばCandida tropicalis ATCC20962を用いて、ω－ヒドロキシル脂肪酸を生成する。Candida tropicalis ATCC20962は、アシル－コエンザイムＡオキシダーゼをコード化するＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子を破壊してβ酸化経路を遮断している株である。
本発明のいずれかの態様により用いられる酵素は、組換えであってもよい。本明細書における「組換え」という用語は、天然の状態では生じないが、遺伝子操作の結果として得られた、特にポリペプチドや核酸などの分子そのもの、その分子によりコード化されている状態、あるいは、組換え分子を含む細胞を意味する。例えば、核酸分子が触媒活性ポリペプチドをコード化する配列に機能的に連結されているプロモータを有し、プロモータは、上記の触媒活性ポリペプチドが、元の変異していない核酸分子を含む対応の野生型細胞のポリペプチドの存在量に比べ過剰発現するように操作されている場合、核酸分子を組換え型と称する。
当業者であれば、本分野で既知の任意の方法により、細胞又は微生物に対して遺伝子組換えを行うことができるであろう。本発明のいずれかの態様によると、遺伝子組換えを行った結果、遺伝子組換え細胞は、２時間以内、具体的には８時間又は２４時間以内という所定の時間間隔にて、野生型細胞よりも少なくとも１倍又は２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、あるいは、少なくとも１００００倍以上のアミノ酸を有する。生成物形成の増加は、例えば、本発明のいずれかの態様による細胞と野生型細胞をそれぞれ別々に同様の条件（同じ細胞密度、同じ栄養培地、同じ培養条件）下で、特定の時間、適切な栄養培地を用いて培養し、栄養培地における目標生成物（ω－ヒドロキシル脂肪酸）の生成量を測定して定める。
遺伝子組換え細胞又は微生物は、野生型細胞又は微生物とは遺伝的に異なる。本発明のいずれかの態様による遺伝子組換え微生物と野生型微生物との遺伝的差異は、完全遺伝子、アミノ酸、ヌクレオチド等の存在の有無であると言えよう。つまり、遺伝子組換え微生物には存在するが、野生型微生物には存在しない。本発明のいずれかの態様による細胞は、本分野で既知の任意の方法により、遺伝的に改変されてもよい。具体的には、細胞は、ＷＯ２０１３０２４１１４に開示の方法によって生成されてもよい。
同じ文脈において、「Ｅｘ酵素の活性の減少」という語句は、本発明のいずれかの態様において用いられる「Ｅｘ酵素の発現の減少」と相互に取り替え可能であり、活性が、少なくとも０．５倍、具体的には少なくとも０．１倍、より具体的には少なくとも０．０１倍、さらに具体的には少なくとも０．００１倍、また具体的には少なくとも０．０００１倍ほど減少することを意味するものとして理解することができる。また、「活性の減少」という語句は、検出できない活性（「活性０」）を含む。特定の酵素の活性減少は、例えば、選択的突然変異、あるいは、特定の酵素活性を低減する当業者に既知の他の手段により可能となる。具体的には、当業者は、例えば、Dubeau et al.,2009, Singh&Rohm, 2008, Lee et al., 2009などを参照とし、特定の遺伝子を中断することにより、タンパク質発現の修飾及び低減、並びにそれに伴う酵素活性の低減をもたらす手法を見出すことができる。本発明のいずれかの態様による核酸配列のうちの１つを含む遺伝子の修飾により細胞の酵素活性の減少を達成してもよい。ここにおいて、修飾は、遺伝子に対する外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列の点突然変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、制御配列（例えばプロモータやターミネータ）あるいは遺伝子に隣接するリボソーム結合部位の修飾（挿入、欠失、点突然変異）からなる群から選択される。
これに関連して、外来ＤＮＡは、遺伝子に対して（生物に対してではない）「外来」である任意のＤＮＡ配列を意味すると理解すべきである。つまり、内因性ＤＮＡ配列もまた、「外来ＤＮＡ」として作用することができる。これに関連して、選択マーカ遺伝子の挿入により遺伝子が中断されるのが特に好ましいが、よってここでは選択マーカ遺伝子が外来ＤＮＡとなる。また、遺伝子座における相同組換えにより挿入を行うのが好ましい。
本明細書が言及する全ての酵素及び遺伝子の発現は、１次元及び２次元タンパク質ゲル分離、並びにそれに続く適切な評価ソフトウェアによるゲル中のタンパク質濃度の光学的同定によって定めることができる。
酵素活性の減少が対応する遺伝子の発現の減少に起因する場合、酵素活性の減少の定量化は、野生型細胞と遺伝子組換え細胞の、１次元又は２次元タンパク質分離の比較により簡単に定めることができる。細菌を用いたタンパク質ゲルの調製及びタンパク質の同定のための一般的な方法は、Hermann et al.(Electrophoresis, 22:1712-23(2001))を参照すること。さらにタンパク質濃度は、判定すべきタンパク質に特異的な抗体とのウエスタンブロットハイブリダイゼーション（Sambrook et al., Molecular Cloning:a laboratory manual, 2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、アメリカ、ニューヨーク市,1989）、続いて濃度測定用の適切なソフトウェアによる光学的評価（Lohaus, Meyer(1989)Biospektrum, 5:32-39;Lottspeich(1999), Angewandte Chemie 111:2630-2647）により分析することができる。この方法は、測定される酵素活性により触媒される反応の可能性のある生成物が微生物中で急速に代謝されるか、さもなければ野生型における活性自体が低すぎて十分に判定できない場合には、生成編成に基づいて酵素活性を適切に判定するという選択肢が常に存在する。
本明細書を通して言及される本発明に関して述べられる受け入れ番号は、２０１１年７月２６日付のNCBI ProteinBankのデータベースへのエントリに対応する。原則として、エントリバージョン番号は、例えば「．１」のような「数字」により識別される。
全ての百分率（％）は、別途に定められていない限り、質量百分率である。
アルカンは、炭素原子の数及びアルカンの構造（つまり分枝、直線、環状など）に応じて様々な用途を有する飽和炭化水素である。アルカン（厳密には、常に非環式又は開鎖化合物）は、一般化学式ＣｎＨ２ｎ＋２で表される。本発明のいずれかの態様により用いられるアルカンは、３～２２、６～１８、又は８～１４の炭素原子を有する非置換アルカンであってもよい。具体的には、アルカンは分枝型でなくてもよい。より具体的には、アルカンは、オクタン、デカン、ドデカン、テトラデカンからなる群から選択されてもよい。さらにより具体的には、本発明のいずれかの態様により用いられるアルカンは、少なくとも６個のＣ原子を有してもよい。具体的には、アルカンはＣ７～Ｃ２２アルカンからなる群から選択されてもよい。より具体的には、Ｃ８～Ｃ２２アルカン、Ｃ８～Ｃ２０アルカン、Ｃ８～Ｃ１８アルカン、Ｃ８～Ｃ１６アルカン、Ｃ１０～Ｃ２０アルカン、Ｃ１０～Ｃ１８アルカン、Ｃ１０～Ｃ１６アルカン、Ｃ１０～Ｃ１４アルカン、Ｃ１０～Ｃ１２アルカンなどからなる群から選択されてもよい。さらにより具体的には、アルカンはＣ１０～Ｃ１２アルカンからなる群から選択されてもよい。一例では、本発明のいずれかの態様により用いられるアルカンは、デカン、ウンデカン、ドデカンなどからなる群から選択される。
本発明のいずれかの態様による方法におけるω－ヒドロキシル脂肪酸の選択率は、発酵生成物の総重量、つまりω－ヒドロキシル脂肪酸及びジカルボン酸の総重量に基づき、最大７０％、あるいは最大７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であってもよい。
従って、本発明のいずれかの態様による方法は、酵母細胞、特にCandida tropicalis又はYarrowia lipolyticaのような単純な微生物を用いたアルカンからの発酵によるω－ヒドロキシル脂肪酸の選択的生産を行う、簡単且つ効果的な手段を提供する。煩雑な遺伝子組換えは必要ない。主生成物は、ジカルボン酸の代わりにω－ヒドロキシ酸であるように選択されてもよい。
本明細書における「接触」という用語は、本発明のいずれかの態様による細胞と、アルカン及び／又はアセテートを含む培地とを、ステップ（ａ）にて本発明のいずれかの態様による方法に従い直接接触させることを意味する。例えば、細胞と、アルカン及び／又はアセテート含む培地は、ステップ（ａ）において異なる区画に位置する。具体的には、アルカンはガス状態であってもよく、本発明のいずれかの態様による細胞を含む培地に添加されてもよい。
本発明のいずれかの態様による方法は、回分培養、流加培養、又は半連続発酵であってもよい。一例では、この方法は流加培養である。本発明のいずれかの態様によると、発酵は通気培養条件下で行ってもよい。
本発明の工程は、培地、ｐＨ値、又は発酵時間のような発酵条件に対して特別に限定はなく、従来の条件をそのまま採用してもよい。一例では、本発明のいずれかの態様による方法は、ｐＨ５～８、５．５～７の水性培地で実施することができる。圧力は１～１０バールである。
「水性溶液」又は「培地」という用語は、水を含む任意の溶液であって、本発明のいずれかの態様による細胞を、少なくとも一時的に、代謝活性状態及び／又は生存可能な状態に保つ溶媒として主に水を使用し、必要であれば追加の基質を含む、溶液を指す。当業者は、細胞を保持する培地として、様々な水性溶液の調製に精通している。水性溶液を最少培地、つまり複合培地とは対照的に、細胞代謝活性状態及び／又は生存可能な状態に保つために必須不可欠な最小の塩及び栄養素のみを含む、合理的に単純な組成の培地として使用すると、望まない副産物により生成物が不要に汚染されることを回避することができる。例えば、Ｍ９培地は最少培地として使用することができる。細胞を、所望の生成物を生成するまで十分な時間、炭素源と共に培養する。培養時間は、例えば、少なくとも１時間、２時間、４時間、５時間、１０時間、又は２０時間となる。選択される温度は、本発明のいずれかの態様による細胞が触媒活性又は代謝活性を維持できるように、例えば１０～４２℃、好ましくは３０～４０℃であり、具体的には３２～３８℃となる。
本発明のいずれかの態様によるオメガ－ヒドロキシル脂肪酸の抽出手段には、例えばポリエチレングリコールを含む水性二相系、キャピラリー電気分解、クロマトグラフィなどが含まれてもよい。一例では、クロマトグラフィを抽出手段として使用する場合、イオン交換カラムを使用する。別の例では、ｐＨシフトを用いてアミノ酸を沈殿させる。当業者であれは、簡単な試行錯誤により、オメガ－ヒドロキシアルキル脂肪酸を抽出する最も適切な手段を容易に同定することができる。
本発明の他の態様において、水性培地中で少なくとも１つのアルカンから、少なくとも１つのオメガ－ヒドロキシル脂肪酸を生成し、酵母細胞の脂肪酸分解能力が低下していて、水性培地は補基質として用いられるアセテートを有する、酵母細胞の用途を提供する。
本発明のさらなる態様において、本発明のいずれかの態様により生成されたオメガ－ヒドロキシル脂肪酸は、ポリアミド、具体的にはポリアミド－１２の生成原料として用いられてもよい。具体的には、ＷＯ２００９０７７４６１に開示の方法を用いて、本発明のいずれかの態様により生成されたオメガ－ヒドロキシル脂肪酸を用いて、ポリアミド－１２を選択的に生成することができる。
本発明の一態様において、
（ｉ）本分野で既知の任意の手段を用いて、本発明のいずれかの態様により生成されたオメガ－ヒドロキシル脂肪酸を少なくとも１つのオメガ－アミノヒドロキシル脂肪酸に転換することと、
（ｉｉ）オメガ－アミノヒドロキシル脂肪酸を重合陽のモノマーとして用いて、ポリアミドを生成することと、を含む、ポリアミドの生成方法を提供する。
本発明のさらなる態様において、発酵工程中に少なくとも１つの炭素基質から形成されるオメガ－ヒドロキシル脂肪酸の選択率を増大させる、少なくとも１つのＣ１～Ｃ４有機化合物の用途であって、発酵工程は、（ａ）水性培地中で少なくとも１つの炭素基質を、少なくとも１つの酵母細胞と接触させることを含み、酵母細胞は、炭素基質を対応するω－ヒドロキシル脂肪酸及び／又はジカルボン酸に酸化することができ、酵母細胞の脂肪酸分解能力は低下していて、水性培地は、少なくとも１つのＣ１～Ｃ４有機化合物を有する、用途を提供する。具体的には、Ｃ１～Ｃ４有機化合物は、アセテートである。
まとめると、オメガ－ヒドロキシル脂肪酸をさらにオメガ－アミノカルボン酸に転換し、その後、重合によりポリアミドに転換してもよい。当業者であれば、本分野において既知の方法に基づき、これらの転換に適した技術を見つけることができるだろう。一例では、オメガ－ヒドロキシル脂肪酸をオメガ－アミノカルボン酸に転換するために、アルカンモノオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼのようなさらなる酵素を本発明のいずれかの態様に従って細胞に導入する。細胞はまた、少なくとも１つのω－トランスアミナーゼを転換し、オメガ－オキソカルボン酸をオメガ－アミノカルボン酸に転換してもよい。別の例では、本発明のいずれかの態様により生成されたオメガ－ヒドロキシル脂肪酸を、オメガ－ヒドロキシル脂肪酸をオメガ－アミノカルボン酸に転換できるさらなる細胞に導入する。
比較例１に従ってグルコースを供給したときの、１０－ヒドロキシデカン酸及びデカン二酸の濃度の経時変化を示すグラフである。 実施例１に従ってＮａＡｃ及びＨＡｃを供給したときの、１０－ヒドロキシデカン酸及びデカン二酸の濃度の経時変化を示すグラフである。 実施例２に従って異なるアルカン基質を使用したときの、ω－ヒドロキシル脂肪酸及びジカルボン酸の濃度を示すグラフである。 実施例３に従ってＮａＡｃを供給したときの、１０－ヒドロキシデカン酸及びデカン二酸の濃度の経時変化を示すグラフである。 比較例２に従ってグルコースを供給したときの、１０－ヒドロキシデカン酸及びデカン二酸の濃度の経時変化を示すグラフである。
実施例
上記の好ましい実施形態は、当業者には理解されるように、特許請求の範囲から逸脱することなく、設計、構成、又は動作における改良や修正を加えることができる。これらの改良は、例えば特許請求の範囲によって含まれることを意図している。
方法及び物質
実施例において、ＧＣ－ＭＳを用いて発酵生成物を同定し、発酵生成物の量は、ガスクロマトグラフィ－炎イオン化検出（ＧＣ－ＦＩＤ）によって定めた。
ＧＣ－ＦＩＤ分析のために発酵生成物のサンプルを注入する前に本サンプルをＴＭＳ（トリメチルシリル化）誘導体化によって処理した。
詳細な手順は、以下の通りである。サンプルを（必要ならば）酢酸エチル又はアセトニトリルに溶解し、次いで、溶液と誘導体化試薬（Ｎ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド、ＢＳＴＦＡ）を１：１（ｖ／ｖ）で、２ｍＬ瓶中で混合した（３００μＬインサート瓶中では８０μＬ：８０μＬ）。その後、ＧＣ－ＦＩＤ分析に注入する前に混合物をオーブン中で３０分間８０℃に加熱した。
機器：Agilent 7890B
入口条件：温度２６０℃、分割比２０：１、注入量１μＬ
カラム：Agilent 19091J-413L、ＨＰ５、３０ｍ×３２０μｍ×０．２５μｍ
キャリアガス：ヘリウム
カラム流束：一定、１ｍＬ／分
オーブンプログラム：６０℃（１分間保持）、１０℃／分の勾配で３００℃（５分間保持）
ＦＩＤ検出器：温度２８０℃、気流速３００ｍＬ／分、Ｈ２燃料流束：３０ｍＬ／分、メイクアップガス流束：２５ｍＬ／分
実施例１
種培養期
Candida tropicalis ATCC20962株の寒天プレート上のコロニーを、種培地１００ｍＬで前培養し、１Ｌのバッフル付き振とうフラスコにて２００ｒｐｍ、３０℃で２０時間振とうした。
種培地は（１リットル当たり）、グルコース３０ｇ、コーンスティープリカー（Sigma）９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４ １．０ｇ、ＣａＣｌ２ ０．１ｇ、ＮａＣｌ ０．１ｇ、尿素３．６ｇ、微量元素溶液１ｍＬ／Ｌ（１リットル当たりＨ３ＢＯ３ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０４ｇ、ＫＩ ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ）を含有する。
増殖期
細胞１０％（ｖ／ｖ）を、１．４ＬのＤＡＳＧＩＰ発酵槽（微生物研究開発用ＤＡＳＧＩＰパラレルバイオリアクタシステム、作業容量１Ｌ）中の増殖培地４００ｍＬに接種した。デカン３０ｇ／Ｌを添加し、シトクロムＰ４５０のような関連酵素の発現を誘導した（He,F.(2005), Yeast, 22:481-491;Van Beillen,J.B.(2006), App and Env. Microbiology:59-65;Kogure T.(2007), FEMS Microbiol Lett:106-111）。増殖期として、培養物を３０℃、通気速度１．０ｖｖｍで３０時間増殖させた。ＮａＯＨ ４ｍｏｌ／Ｌ、又はＨＣｌ溶液５ｍｏｌ／Ｌを自動的に添加して、ｐＨを５．８０に維持した。溶存酸素は、攪拌、及びＯ２－カスケード制御モードにより、２５％飽和状態に維持した。６時間増殖の後、グルコース（６００ｇ／Ｌ）を下記の式に基づいて指数関数的に供給した。μは０．０５時間－１、ＹＸ／Ｓはグルコース０．３５ｇＤＣＷ（乾燥細胞重量）、ｍｓは０．０４ｇ／ｇＤＣＷ＊ｈである。ＣＳ０は基質濃度、ＣＸ０は供給開始時のＤＣＷである。
Figure 0006997758000001
増殖培地は（１リットル当たり）、グルコース３０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ８ｇ、コーンスティープリカー（Sigma）９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４ １．０ｇ、ＣａＣｌ２ ０．１ｇ、ＮａＣｌ ０．１ｇ、消泡剤２０４（Sigma Lot#:MKBP4191V）１ｍＬ、微量元素溶液１ｍＬ／Ｌ（１リットル当たりＨ３ＢＯ３ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０４ｇ、ＫＩ ０．１ｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ）を含有する。
転換期
デカンの転換は、増殖期から３０時間後に開始した。ＮａＯＨ溶液４ｍｏｌ／Ｌを用いて２時間でｐＨを７．５まで徐々に上げた。デカンを０．４ｍＬ／時の速度で供給し、ＮａＡｃ（３００ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５）を１．０～２．０ｍＬ／時の速度で供給した（Ａｃ－の濃度は１０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌ）。次いで、ＨＡｃ ７５％（ｖ／ｖ）の自動添加によりｐＨを７．５に維持した。転換期は１３０時間続いた。培養液サンプルを間隔を置いて採取し、細胞密度、残留グルコース、Ａｃ濃度、生成物濃度を判定した。
残留グルコースの濃度は酵素的に検出され（グルコースオキシダーゼ）、濃度は検出されなかった。
酢酸基（Ａｃ－）の濃度は、既知濃度の内部標準（ＴＭＳＰ、３－（トリメチルシリル）プロピオン－２，２，３，３－ｄ４酸性ナトリウム塩）に対してサンプルを算出するＨ－ＮＭＲ法により定量した。Ａｃ－の濃度は１０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌであった。
ＮａＡｃ及びＨＡｃを供給したときの１０－ヒドロキシデカン酸及びデカン二酸の濃度の経時変化を図２に示す。
サンプル抽出
５Ｍ ＨＣｌを添加してサンプル培養液２００μＬをｐＨ１～２に酸性化し、次いで８倍（１．６ｍＬ）の酢酸エチル（ＥＡ）を添加した。激しく振とうした後、２５℃、１３０００ｒｐｍで遠心分離を２分間かけ、ＥＡ相を取った。続いて、ＥＡ相１ｍＬをＧＣ－ＦＩＤ分析に使用し、培養液中の酸化生成物（１０－ヒドロキシデカン酸及びデカン二酸）を判定した。
比較例１
種培養期及び増殖期を実施例１と同様に行った。転換期において、増殖期から３０時間が経過した後にデカン転換を開始した。ＮａＯＨ溶液４ｍｏｌ／Ｌを用いて２時間でｐＨを７．５まで徐々に上げた。デカンを０．４ｍＬ／時の速度で供給し、グルコース（６００ｇ／Ｌ）をグルコースの濃度を約１０ｇ／Ｌに維持できる速度で供給した。次いで、ＮａＯＨ溶液４ｍｏｌ／Ｌの自動添加によりｐＨを７．５に維持した。転換期は１３０時間続いた。培養液サンプルを間隔を置いて採取し、細胞密度、残留グルコース、生成物濃度を判定した。
図１に示すように、比較例１に従ってグルコースを転換期で供給した場合、主生成物はデカン二酸であり、その濃度は１６０時間目に１３．８８ｇ／Ｌであった。１０－ヒドロキシデカン酸はほとんど見られなかった（０．１５ｇ／Ｌ）。１０－ヒドロキシデカン酸の選択率は１．１％であった。
しかしながら、図２に示すように、実施例１に従ってＮａＡｃ及びＨＡｃを転換期で供給した場合、主生成物はデカン二酸ではなく１０－ヒドロキシデカン酸であった（１６０時間目に１０－ヒドロキシデカン酸７．５６ｇ／Ｌ、デカン二酸０．９６ｇ／Ｌ）。１０－ヒドロキシデカン酸の選択率は８８．７％であった。
実施例２
種培養期及び増殖期を実施例１と同様に行った。その後、４℃、４５００ｒｐｍで遠心分離を４分間かけ、誘導細胞を集めた。さらに、回収細胞を１０ｍＭ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５）で洗浄し、休止細胞を得た。
休止細胞のアリコートを、２５ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で、ＮａＡｃ（２８ｇ／Ｌ）及びアルカン基質（４０ｇ／Ｌ）を含む培地に懸濁し、ＯＤ１０の細胞懸濁液を作製した。この細胞懸濁液を転換期に使用した。３種のアルカン、つまりデカン、ウンデカン、ドデカンをそれぞれ基質として試験した。空気を純酸素で置換した２５０ｍＬのＳｃｈｏｔｔバッフル付き振とうフラスコ内で、３０℃、２００ｒｐｍで転換期を２４時間行った。培養液中の生成物を酸性化の後、等量の酢酸エチルで抽出した。各生成物の濃度をＧＣ－ＦＩＤにより定量化した。転換から２４時間が経過した後、残留ＮａＡｃ濃度は約２～３ｇ／Ｌであった。
図３の結果は、これら３種類の基質において、主生成物が全てω－ヒドロキシアルキル脂肪酸であることを示している。１０－ヒドロキシデカン酸及びデカン二酸の濃度はそれぞれ０．４５２ｇ／Ｌ、０．０３９ｇ／Ｌであり、１０－ヒドロキシデカン酸の選択率は９２．０％であった。１１－ヒドロキシデカン酸及びウンデカン二酸の濃度はそれぞれ０．４６９ｇ／Ｌ、０．０９８ｇ／Ｌであり、１１－ヒドロキシデカン酸の選択率は８２．７％であった。１２－ヒドロキシデカン酸及びドデカン二酸の濃度はそれぞれ０．５０２ｇ／Ｌ、０．２０４ｇ／Ｌであり、１２－ヒドロキシデカン酸の選択率は７１．１％であった。
実施例３
種培養期
Yarrowia lipolytica C122株の寒天プレート上のコロニー（受け入れ番号CGMCC14251（２０１７年６月１９日付で中国北京市朝陽区北辰西路１街（100101）所在の中国科学院微生物研究所中国公共微生物培養収集センターに寄託）を、種培地５０ｍＬで前培養し、５００ｍＬのバッフル付き振とうフラスコにて２００ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とうした。
種培地は（１リットル当たり）、グルコース１０ｇ、ペプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、デカン３ｇを含有する。
４℃、４５００ｒｐｍで遠心分離を４分間かけ、誘導細胞を集めた。さらに、回収細胞を１０ｍＭ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５）で洗浄し、休止細胞を得た。
休止細胞のアリコートを、２５ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で、ＮａＡｃ（２８ｇ／Ｌ）及びアルカン基質（１０ｇ／Ｌ）を含む培地に懸濁し、ＯＤ２０の細胞懸濁液を作製した。この細胞懸濁液を転換期に使用した。デカンを基質として試験した。
転換期
空気を純酸素で置換した２５０ｍＬのＳｃｈｏｔｔバッフル付き振とうフラスコ内で、３０℃、２００ｒｐｍで転換期を２４時間行った。培養液中の生成物を酸性化の後、等量の酢酸エチルで抽出した。各生成物の濃度をＧＣ－ＦＩＤにより定量化した。
図４は、実施例３に従ってＮａＡｃを供給したときの、１０－ヒドロキシデカン酸及びデカン二酸の濃度の経時変化を示すグラフである。図４の結果は、主生成物がω－ヒドロキシアルキル脂肪酸であることを示している。１０－ヒドロキシデカン酸の濃度は０．２６０ｇ／Ｌ、１０－ヒドロキシデカン酸の選択率は５８．３％であった。
比較例３
種培養期及び増殖期を実施例３と同様に行った。ただし転換期において、ＮａＡｃをグルコース（２０ｇ／Ｌ）に取り替えた。
図５の結果は、主生成物がデカン二酸であることを示している。デカン二酸の濃度は０．２０５ｇ／Ｌ、１０－ヒドロキシデカン酸の選択率は４．０％であった。

Claims (10)

  1. 少なくとも１つのオメガ－ヒドロキシル脂肪酸を生成する方法であって、
    水性培地中で少なくとも１つのアルカンを少なくとも１つの酵母細胞と接触させることを含み、
    前記水性培地は、補基質として用いられるアセテートを含み、
    前記水性培地は、検出できない濃度のグルコースを含み、
    前記アルカンは、Ｃ７～Ｃ２２アルカンからなる群から選択され、
    前記酵母は、受け入れ番号ＡＴＣＣ２０９６２のＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ又は受け入れ番号ＣＧＭＣＣ１４２５１のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＣ１２２である、
    方法。
  2. 前記アセテートの濃度は、ステップ（ａ）において少なくとも２０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アセテートの濃度は、８０～８００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で維持される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記アセテートの濃度は、１６０～５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で維持される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記アセテートは、ＮａＡｃ及びＨＡｃからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記アルカンは、少なくとも６個の炭素原子を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記アルカンは、Ｃ１０～Ｃ１２からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記酵母細胞は、受け入れ番号ＡＴＣＣ２０９６２のＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記酵母細胞は、受け入れ番号ＣＧＭＣＣ１４２５１のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＣ１２２である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記アルカンは、デカン、ウンデカン及びドデカンからなる群から選択される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
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