CN105624179A - 一种生产脂肪端烯的系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物能源与合成生物学领域，具体而言是一种生物合成生产脂肪端烯的系统及其应用。系统包含脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产元件和还原伴侣蛋白；或，系统包含脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产元件、还原伴侣蛋白和胞内过氧化氢水平调控元件。本发明构建的微生物能够稳定生产脂肪端烯，原料成本低廉，构建步骤简单。利用本发明方法制备脂肪端烯节能环保，且不受石油短缺制约，具有广阔的应用前景。

Description

一种生产脂肪端烯的系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物能源与合成生物学领域，具体而言是一种生物合成生产脂肪端烯的系统及其应用。

背景技术

石油、煤炭等化石燃料资源的快速消耗和不可再生性带来了诸如油价高企、能源紧缺、环境污染等一系列问题。在可持续发展和节能减排的大背景下，借助合成生物学方法，利用基因工程、酶工程和代谢工程手段，大规模生产可替代化石燃料的可再生生物燃料势在必行。在生物燃料中，中长链脂肪烃具有与传统液体化石燃料最为接近的物理化学性质，是最理想的替代燃料。因此，利用生物方法实现脂肪烃的合成具有重要意义。

在生物体中，脂肪烃主要来自于脂肪酸代谢途径。脂肪酸作为生物体内细胞膜的基本组成成分和主要储能物质，在生物体内含量十分丰富。典型的脂肪酸含有长度为C₄-C₂₄的烷烃侧链(McEwenandAtsumi2012)，具备高能量密度和疏水性的特点。利用脂肪烃生物合成途径将二氧化碳或葡萄糖等碳源转化成能够直接利用的脂肪烃，是一种极具潜力的方法。

近年来，不同生物体中基于脂肪酸代谢的脂肪烃生物合成途径的阐明为脂肪烃的异源高效合成提供了可能。目前已经鉴定了五条脂肪烃的生物合成途径：(1)存在于真核生物中的脂酰辅酶A还原酶-脂肪醛脱羰基酶途径(ACR-ADC途径)(Aarts,Keijzeretal.1995,Reed,Quilicietal.1995,Bourdenx,Bernardetal.2011,Qiu,Tittigeretal.2012)；(2)存在于藤黄微球菌，由OleA催化的长链脂肪烃生物合成途径(Beller,Gohetal.2010)；(3)存在于大多数蓝细菌中的脂酰ACP还原酶-脂肪醛去甲酰加氧酶途径(AAR-ADO途径)(Schirmer,Rudeetal.2010)；(4)存在于蓝细菌聚球藻PCC7002中的生产含有末端双键脂肪烃的“OLS聚酮合成酶”途径(Mendez-Perez,Begemannetal.2011)；(5)存在于咸海鲜球菌的P450脂肪酸脱羧酶OleT_JE催化的脂肪酸脱羧生成脂肪端烯的途径(Rude,Baronetal.2011)。该途径由脂肪酸底物一步脱羧生成端烯，是最为简单直接的脂肪烃生物合成途径。

自然界中的产烃微生物虽具备脂肪烃的天然合成途径(Beller,Gohetal.2010,Mendez-Perez,Begemannetal.2011,Rude,Baronetal.2011)，但对其认识有限且缺乏相应的基因改造工具，因此天然产烃微生物并不具备工业应用潜力。而目前被广泛应用于合成生物学研究和工业生产的一些模式微生物，具有遗传背景清晰，生物工程技术手段成熟等特点，相较之下是构建脂肪烃生物合成系统的优势异源宿主。将天然脂肪烃生物合成途径应用于具有工业开发潜力的异源微生物中合成脂肪烃极具工业应用价值。

模式生物大肠杆菌基因操作技术成熟，易于代谢改造，倍增时间短，易于大规模发酵培养(ClomburgandGonzalez2010,Handke,Lynchetal.2011,Tee,Chowdhuryetal.2014)。此外，其脂肪酸代谢途径、调控机制研究比较透彻，目前已取得的最高脂肪酸产量为8.6g/L(Xu,Guetal.2013)，是作为脂肪酸途径出发的脂肪烃生物合成研究和开发的理想宿主。随着基因工程、代谢工程及合成生物学的发展，将上述报道的脂肪烃天然合成途径引入大肠杆菌，已成功检测到多种脂肪烃的合成，表现出良好的应用前景。

然而，目前对脂肪烃的生物合成研发多集中于AAR-ADO途径(ChoiandLee2013,Harger,Zhengetal.2013)或CAR-ADO途径(Akhtar,Turneretal.2013,Kallio,Pasztoretal.2014)，均为先合成脂肪醛，再进一步由脂肪醛合成脂肪烷烃，合成途径复杂，脂肪烃合成效率较低。

模式光合生物蓝细菌属于原核微生物，细胞结构相对简单，培养方便，营养要求低，遗传背景清晰，遗传操作技术平台已经相当成熟，细胞内生化代谢途径及其调控机制也日趋完善。作为一种光能自养微生物，蓝细菌可以利用二氧化碳作为唯一碳源进行自养生长，不需耗费其它能源，不需要发酵外源生物质。上述脂肪烃合成途径中有两种都天然存在于蓝细菌中，使得蓝细菌成为一个开发脂肪烃合成的另一理想宿主。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产脂肪端烯的系统及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种生产脂肪端烯的系统，系统包含脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产元件和还原伴侣蛋白；

或，系统包含脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产元件、还原伴侣蛋白和胞内过氧化氢水平调控元件。

所述的脂肪端烯合成元件为来源于鲜咸海鲜球菌(Jeotgalicoccussp.)ATCC8456菌株的P450脂肪酸脱羧酶OleT_JE或其功能等同体。

所述脂肪端烯合成基因为P450脂肪酸脱羧酶基因oleT_JE和/或融合来源于红球菌(Rhodococcussp.)NCIMB9784的P450还原伴侣蛋白RhFRED编码基因的脂肪酸脱羧酶基因oleT_JE-RhFRED。

所述的脂肪酸高产元件为来源于大肠杆菌的硫酯酶'tesA基因、硫酯酶'tesA基因功能等同体的过表达载体、乙酰辅酶A羧化酶基因accBCDA、accBCDA功能等同体的过表达载体、脂肪酸代谢调控基因fadR、fadR功能等同体的过表达载体、脂酰辅酶A合成酶基因fadD、fadD功能等同体基因敲除的宿主菌株、脂酰辅酶A脱氢酶基因fadE、fadE功能等同体基因敲除的宿主菌株、来源于蓝细菌的脂酰ACP合成酶基因slr1609基因、slr1609基因功能等同体基因敲除的宿主菌株中的一种或几种。

所述的P450还原伴侣蛋白为来源于红球菌(Rhodococcussp.)NCIMB9784P450还原伴侣蛋白RhFRED、不同宿主来源的flavodoxin和flavodoxinreductase、或ferredoxin和ferredoxinreductase及上述相应的功能等同体中的一种或几种。

所述的胞内过氧化氢水平调控元件为oxyR调控基因敲除的宿主菌株。

一种生产脂肪端烯的系统用于生产脂肪端烯的应用。

一种生产脂肪端烯的化能异养微生物，异养微生物携带所述生产脂肪端烯的系统。所述的微生物为大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、酵母或丝状真菌。

进一步的说，所述化能异养微生物的基因组DNA或质粒DNA中包含所述系统的核酸序列中的一种或多种。

更进一步的说，所述的异养微生物含有质粒pET28b-oleT_JE、pBAD33-'tesA和质粒pFN476-accBCDA，以及含有脂酰辅酶A合成酶基因fadD或脂酰辅酶A脱氢酶基因fadE和胞内过氧化氢水平调控元件oxyR双敲除的大肠杆菌；所述的质粒pET28b-oleT_JE启动子为T7启动子，复制子为pBR322复制子，包含oleT_JE基因；所述的质粒pBAD33-'tesA启动子为pBAD启动子，复制子为p15A复制子，包含'tesA基因；所述的质粒pFN476-accBCDA启动子为T7启动子，复制子为pSC101复制子，包含accBCDA基因。

一种所述的生产脂肪端烯的化能异养微生物用于生产脂肪端烯的应用。

一种生产脂肪端烯的光能自养微生物，光能自养微生物携带所述生产脂肪端烯的系统或系统中至少一个元件。所述的微生物为蓝细菌或真核微藻。

进一步的说，所述光能自养微生物的基因组DNA中包含所述系统或系统中元件的核酸序列中的一种或多种。

更进一步的说，所述光能自养微生物为基因组中整合了基因oleT_JE、accBCDA基因，且含有脂酰-ACP合成酶基因aas敲除的蓝细菌菌株。所述的基因oleT_JE整合在基因slr1609位点，启动子为P_rbcL启动子，终止子为T_rbc终止子；所述的基因accBCDA整合在基因slr0168位点，启动子为P_rbcL启动子，终止子为T_rbc终止子；

或，所述的微生物为基因组中整合了基因oleT_JE-RhFRED、accBCDA基因，且含有脂酰-ACP合成酶基因aas敲除的蓝细菌菌株。所述的基因oleT_JE-RhFRED整合在基因slr1609位点，启动子为P_rbcL启动子，终止子为T_rbc终止子；所述的基因accBCDA整合在基因slr0168位点，启动子为P_rbcL启动子，终止子为T_rbc终止子。

一种所述的生产脂肪端烯的光能自养微生物用于生产脂肪端烯的应用。

所述的脂肪端烯合成元件在化能异养微生物中优选为来源于鲜咸海鲜球菌(Jeotgalicoccussp.)ATCC8456菌株的P450脂肪酸脱羧酶oleT_JE基因(例如参见NCBIID:HQ709266.1)；

所述的还原伴侣蛋白基因在化能异养微生物中，优选为来源于大肠杆菌的flavodoxin和flavodoxinreductase基因(例如参见NCBIID:CP001509.3)；

所述的脂肪酸合成元件在化能异养微生物中优选为包括来源于大肠杆菌的硫酯酶'tesA基因(例如参见NCBIID:CP001509.3)的过表达载体、乙酰辅酶A羧化酶基因accBCDA(例如参见NCBIID:CP001509.3)的过表达载体、脂肪酸代谢调控基因fadR(例如参见NCBIID:CP001509.3)的过表达载体在内的脂酰辅酶A合成酶基因fadD(例如参见NCBIID:CP001509.3)敲除菌株；

在光合自养微生物中优选为过表达蓝细菌乙酰辅酶A羧化酶基因accBCDA(例如参见NCBIID:NC_000911.1)及敲除蓝细菌脂酰ACP合成酶基因slr1609(例如参见NCBIID:NC_000911.1)的蓝细菌菌株。

所述的生产脂肪端烯的化能异养微生物优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述生产脂肪端烯的光能自养微生物优选为蓝细菌集胞藻PCC6803。

所得到的工程菌可利用化能异养或光能自养产生的能量合成脂肪端烃，相应碳源为葡萄糖或二氧化碳。

本发明的原理：

本发明脂肪端烯生产系统由脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产元件、还原伴侣蛋白和/或胞内过氧化氢水平调控元件组成。其中脂肪端烯合成元件为系统的核心，其作用在于催化脂肪酸生成脂肪端烯；还原伴侣蛋白在系统中起协调电子传递作用，脂肪端烯合成元件借助还原伴侣蛋白进行电子传递；脂肪酸高产元件为系统底物合成中心，借助该元件系统能够过量合成脂肪酸底物；胞内过氧化氢水平调控元件调控细胞内过氧化氢浓度，为脂肪端烯合成元件提供足量的过氧化氢辅因子。

本发明相对于现有技术具有如下优点与效果：本发明利用生产脂肪端烯的系统获得了稳定高效生产脂肪端烯的异养微生物(大肠杆菌)或光能自养微生物(蓝细菌工程菌株)。通过构建的微生物能稳定合成脂肪端烯，为脂肪端烯的生物合成奠定了基础，具有广阔的工业价值和应用前景。

本发明的生产脂肪端端烯的系统提高脂肪端烯合成能力的方法为增强上述系统中底物或辅因子合成基因或其功能等同体的表达或对底物或辅因子竞争性代谢途径基因的敲除。同时本发明利用合成生物学、基因工程及代谢工程的发展使得利用目标微生物表达外源基因成为可能，进而通过合适元件的选择与组合在化能异养微生物或光合自养微生物中表达与重建脂肪端烯合成途径，建立生产脂肪端烯的系统。

附图说明

图1为本发明实施例提供的质粒pET28b-oleT_JE的基本结构。

图2为本发明实施例提供的质粒pET28b-oleT_JE-RhFRED的基本结构。

图3为本发明实施例提供的脂肪酸高产元件、脂肪端烯合成元件与还原伴侣蛋白元件的不同组合所得到的大肠杆菌EA1-EA4脂肪端烯合成系统的脂肪端烯合成量。

图4为本发明实施例提供的含有脂肪酸高产元件、脂肪端烯合成元件与还原伴侣蛋白元件的大肠杆菌脂肪端烯合成菌株EA3经再培养得到的脂肪端烯合成量。

图5为本发明实施例提供的含有脂肪酸高产元件、脂肪端烯合成元件与还原伴侣蛋白元件及胞内过氧化氢水平调控元件的大肠杆菌菌株EA3ΔoxyR的脂肪端烯合成量。

图6为本发明实施例提供的质粒pCDFDuet-fadR的基本结构。

图7为本发明实施例提供的质粒pEASY-FOKR的基本结构。

图8为本发明实施例提供的质粒pLX105的基本结构。

图9为本发明实施例提供的质粒pLX106的基本结构。

图10为本发明实施例提供的脂肪酸高产元件、脂肪端烯合成元件与还原伴侣蛋白元件的不同组合所得到的蓝细菌LX111-LX114脂肪端烯合成系统的脂肪端烯合成量。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。根据附图和优选方法的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

除非特别指出，否则本发明中所使用的分子生物学试验方法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆:实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，JohnWiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例中用到的引物如表1所示：

表1引物列表

实施例1：脂肪端烯合成元件的构建

为了实现脂肪烃合成元件的表达，分别构建脂肪酸脱羧酶基因或融合还原伴侣基因RhFRED的脂肪酸脱羧酶基因的过表达载体。

1.质粒pET28b-oleT_JE的构建

以Jeotgalicoccussp.ATCC8456菌株基因组为模板，以OleT-NdeI/OleT-HindIII(引物序列见表1)为引物PCR(PCR反应条件为：95℃预变性5min，之后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1-2min，反应30个循环，最后72℃延伸10min)，得到带有NdeI和HindIII酶切位点的oleT_JE基因片段，将基因片段克隆进表达载体pET28b(商业载体)，得到质粒pET28b-oleT_JE。该质粒示意图如图1所示，序列(不含骨架载体序列)如SEQIDNO.1所示(基因序列见序列表)。该质粒控制基因表达的启动子为T7启动子，质粒复制子为pBR322复制子。

2.质粒pET28b-oleT_JE-RhFRED的构建

采用引物对RhFRED-F/RhFRED-R(引物序列见表1)以质粒pET28b-pikC-RhFRED(Li,Podustetal.2007)为模板克隆RhFRED还原酶编码基因；采用引物对OleT-F/OleT-RhFRED-OE(引物序列见表1)以上述获得质粒pET28b-oleT_JE为模板进行PCR(PCR条件见实施例1.1)；取上述两步得到的PCR产物切胶回收后作为模板进行重叠延伸PCR(重叠延伸PCR条件为：95℃预变性5min，之后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，反应18个循环，最后72℃延伸10min)，即将得到的PCR产物稀释至1/100后作为模板，以OleT-F/RhFRED-R(引物序列见表1)为引物，进行常规PCR(PCR条件见实施例1.1)；纯化后的PCR产物采用NdeI/HindIII双酶切克隆进表达载体pET28b(商业载体)，得到质粒pET28b-oleT_JE-RhFRED。该质粒示意图如图2所示，序列如(不含骨架载体序列)SEQIDNO.2所示(基因序列见序列表)。该质粒控制基因表达的启动子为T7启动子，质粒复制子为pBR322复制子。

实施例2：含有脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产合成元件、还原伴侣蛋白元件的大肠杆菌工程菌株的构建。

1.菌株EF1的构建

以敲除了fadD基因的菌株BL21(DE3)ΔfadD为出发菌株，共转化质粒pBAD33-'tesA及pFN476-accBCDA得到菌株EF1。

2.含有脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产合成元件、还原伴侣蛋白元件的大肠杆菌工程菌株的构建。

将质粒pET28b-oleT_JE及pET28b-oleT_JE-RhFRED分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)ΔfadD及EF1，得到脂肪烃合成菌株EA1(pET28b-oleT_JE转化BL21(DE3)ΔfadD)、EA2(pET28b-oleT_JE-RhFRED转化BL21(DE3)ΔfadD)、EA3(pET28b-oleT_JE转化EF1)、EA4(pET28b-oleT_JE-RhFRED转化EF1)。其中，工程菌中还原伴侣蛋白利用大肠杆菌内源的flavodoxin与flavodoxinreductase。

2.EA1-EA4菌株摇瓶发酵生产脂肪端烯

将上述培养过夜的EA1-EA4菌株种子液以1％(V/V)接种量接种至含氨苄青霉素、卡纳霉素及氯霉素的LB培养基(含胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，NaCl10g/L)，37℃220rpm培养至OD₆₀₀为1.0左右，加入终浓度为0.4％的L-阿拉伯糖，30min后加入终浓度为0.2mM的IPTG，同时加入终浓度为0.5mM的5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，改变培养条件至28℃，220rpm。在诱导20h后，提取脂肪端烯，进行GC-MS检测分析。

将上述EA1-EA4菌株中脂肪端烯合成量最高的菌株进行再培养，提取脂肪端烯。

具体是，将培养过夜的种子液以5％(V/V)接种量接种至以3％葡萄糖为碳源的改良微量元素培养基中(6g/LNa₂HPO₄,3g/LKH₂PO₄,0.5g/LNaCl,2g/LNH₄Cl,0.25g/LMgSO₄·7H₂O,11mg/LCaCl₂,27mg/LFeCl₃·6H₂O,2mg/LZnCl₂·4H₂O,2mg/LNa₂MoO₄·2H₂O,1.9mg/LCuSO₄·5H₂O,0.5mg/LH₃BO₃,1mg/L维生素B1,200mMBis-Tris(pH7.25)和0.1％(v/v)Triton-X100)，37℃250rpm培养至OD₆₀₀为1.0左右，加入终浓度为0.4％的L-阿拉伯糖诱导，30min后加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，同时加入终浓度为0.5mM的5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，培养条件改变至28℃，250rpm。在诱导40h后，提取脂肪端烯，进行GC-MS检测分析。

脂肪端烯提取方法：

取20mL培养液，加入十七酸内标，作为校准标准，30％功率，工作5s，间歇5s超声波破碎30min；破碎后的培养液加入等体积的抽提液(氯仿：甲醇＝2:1，V/V)，充分振荡，以充分提取培养液中的脂肪烃；4℃，10000rpm离心15min，取下层有机相经氮气吹干后，重新溶解于乙酸乙酯中，加入正二十烷作为内标，进行GC-MS测定。

测试分析条件：

脂肪烃的检测采用连接有四级杆质谱检测器的安捷伦7890A气象色谱-质谱联用仪。所使用的气相色谱柱为HP-INNOWax(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为氮气，流速为1mL/min，进样量为1μL，进样口温度为280℃。柱箱程序升温程序为40℃维持4min，10℃/min升至250℃，250℃维持15min。气相测试结束后使用与仪器相连的分析软件进行相关定性与定量分析。

由上述可知，EA1-EA4菌株均成功的产生了一系列不同链长的脂肪端烯,(如1-十三烯，1,6-十三二烯，1-十五烯，1,8-十五二烯及1,10-十七二烯)，结果如图3所示。这些端烯对应的脂肪酸均与文献报道的大肠杆菌产酸菌株所产生的脂肪酸产物相一致(Lu,Voraetal.2008)(14:0,14:1,16:0,16:1及18:1脂肪酸)。在LB培养基发酵培养下，测试脂肪端烯大肠杆菌产生的主要脂肪端烯均为1,10-十七二烯。其中，EA3菌株总脂肪端烯产量最高，为11.8mg/L，在其脂肪端烯产物中1,10-十七二烯为主要产物，产量为7.7mg/L。

将EA3再经培养进行脂肪端烯发酵，其总脂肪端烯产量达到131.7mg/L(见图4)，相较于LB培养基220rpm发酵20h提高了11倍，其主要脂肪端烯产物仍为1,10-十七二烯。

实施例3：含有胞内过氧化氢水平调控元件的大肠杆菌工程菌株的构建。

1.EA3ΔoxyR脂肪端烯合成工程菌的构建

采用引物对UP-oxyR-F/Down-oxyR-R(引物序列见表1)，以质粒pKD4(DatsenkoandWanner2000)为模板，PCR扩增带有FRT位点的卡纳抗性基因(PCR条件见实施例1.1)；将得到的线性片段电转入表达RED重组酶的BL21(DE3)ΔfadD菌株中；挑取卡纳抗性转化子，向其中电转入质粒pCP20(DatsenkoandWanner2000)，消除卡纳抗性基因，采用鉴定引物JD-oxyR-F/JD-oxyR-R(引物序列见表1)进行PCR(PCR条件见实施例1.1)，电泳结果正确的菌株即为菌株BL21(DE3)ΔfadDΔoxyR。将质粒pET28b-oleT_JE、pBAD33-'tesA及pFN476-accBCDA共转化菌株BL21(DE3)ΔfadDΔoxyR即得到菌株EA3ΔoxyR。

2.EA3ΔoxyR菌株发酵脂肪端烯产量

将上述菌株EA3ΔoxyR培养过夜的种子液以5％(V/V)接种量接种至以3％葡萄糖为碳源的改良微量元素培养基中，37℃250rpm培养至OD₆₀₀为1.0左右，加入终浓度为0.4％的L-阿拉伯糖诱导，30min后加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，同时加入终浓度为0.5mM的5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，培养条件改变至28℃，250rpm。在诱导40h后，提取脂肪端烯，进行GC-MS检测分析。

经检测，菌株EA3ΔoxyR的总脂肪端烯产量为193.2mg/L(见图5)，其合成的脂肪端烯组成为1-十三烯，1-十五烯，1,8-十五二烯及1,10-十七二烯，其中1,10-十七二烯产量最高为125mg/L。

实施例4：脂肪酸调控基因fadR引入对脂肪端烯合成的影响

1.质粒pCDFDuet-fadR的构建

以BL21(DE3)基因组为模板采用引物F-BamHI-fadR/R-fadR-SalI(引物序列见表1)进行PCR(PCR条件见实施例1.1)，得到带有BamHI和SalI酶切位点的fadR基因片段，克隆进表达载体pCDFDuet-1(商业载体)，得到质粒pCDFDuet-fadR。该质粒示意图如图6所示，序列(不含骨架载体序列)如SEQIDNO.3所示(基因序列见序列表)。该质粒控制基因表达的为T7启动子，质粒复制子为CloDF13复制子。

2.脂肪酸调控基因fadR引入对脂肪端烯合成的影响

实验方法：

采用质粒pCDFDuet-fadR转化大肠杆菌菌株EA3，得到引入fadR脂肪酸调控基因的菌株EA3-R，其培养过夜的种子液以5％(V/V)接种量接种至以3％葡萄糖为碳源的改良微量元素培养基中，37℃250rpm培养至OD₆₀₀为1.0左右，加入终浓度为0.4％的L-阿拉伯糖诱导，30min后加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，同时加入终浓度为0.5mM的5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，培养条件改变至28℃，250rpm。在诱导40h后，提取脂肪烃，进行GC-MS检测分析。

结论：

fadR是脂肪酸代谢过程的全局调控因子，对于脂肪酸的生物合成、降解及膜转运都具有调控作用，对该基因进行过表达能够取得73％的理论脂肪酸产量(Zhang,Ouelletetal.2012)。菌株EA3-R的总脂肪端烯产量较菌株EA3提高了18.9％。

实施例5：脂肪端烯合成元件基因组整合对脂肪端烯合成的影响

为了降低质粒系统的不稳定性，减少宿主细胞过表达多质粒的负担，构建oleT_JE基因基因组替换质粒pEASY-FOKR，用于实现脂肪端烯合成元件在大肠杆菌基因组fadE位点整合。

1.质粒pEASY-FOKR的构建

以菌株BL21(DE3)的基因组为模板，采用引物对F-BamHI-fadEup/R-fadE-oleT_JE-OE及F-SacI-fadEdown/R-fadEdown-SalI(引物序列见表1)分别克隆fadE基因上下游各1kb同源臂；以质粒pET28b-oleT_JE为模板，以F-KpnI-oleT_JE/R-Km-oleT_JE-OE(引物序列见表1)为引物，克隆oleT_JE基因；以质粒pKD4(DatsenkoandWanner2000)为模板，以F-SpeI-Km/R-fadEdown-Km-OE(引物序列见表1)为引物，克隆含有FRT位点的卡纳抗性基因。以上得到的片段两两融合并克隆到载体pGEM-TEASY(商业载体)中，采用酶切连接将克隆入pGEM-TEASY的融合片段按顺序转移至载体pEASY-T1中，即得到oleT_JE在大肠杆菌基因组脂酰辅酶A脱氢酶基因fadE位点同源重组载体pEASY-FOKR。该质粒示意图如图7所示，控制基因表达的为T7启动子，质粒复制子为pUC复制子。

2.EA3ΔfadE::oleT_JE脂肪端烯合成工程菌的构建

采用BamHI和SalI对质粒pEASY-FOKR进行双酶切并回收用于oleT_JE基因组整合的功能基因片段；将得到的线性片段电转入表达RED重组酶的BL21(DE3)ΔfadD菌株中，挑取卡纳抗性转化子，向其中电转入质粒pCP20(DatsenkoandWanner2000)，消除卡纳抗性基因，得到经鉴定引物JD-fadE-F/JD-fadE-R(引物序列见表1)鉴定正确的克隆即为工程菌株BL21(DE3)ΔfadE::oleT_JE。以菌株BL21(DE3)ΔfadE::oleT_JE为出发菌株，共转化质粒pBAD33-'tesA及pFN476-accBCDA得到菌株EA3ΔfadE::oleT_JE。

3.脂肪端烯合成元件基因组整合对脂肪端烯合成的影响

将上述获得菌株EA3ΔfadE::oleT_JE培养过夜的种子液以5％(V/V)接种量接种至以3％葡萄糖为碳源的改良微量元素培养基中，37℃250rpm培养至OD₆₀₀为1.0左右，加入终浓度为0.4％的L-阿拉伯糖诱导，30min后加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，同时加入终浓度为0.5mM的5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，培养条件改变至28℃，250rpm。在诱导40h后，提取脂肪烃，进行GC-MS检测分析。

菌株EA3ΔfadE::oleT_JE的总烃产量为152.2mg/L，其总产烃量比菌株EA3(131.7mg/L)高15.5％。在EA3ΔfadE::oleT_JE的脂肪端烯产物中，1,10-十七二烯仍为主要产物，产量为114.8mg/L。菌株EA3ΔfadE::oleT_JE与EA3的细胞干重相差不大，分别为4.7g/L与4.9g/L。

实施例6：蓝细菌脂肪端烯合成元件的构建

为了实现蓝细菌脂肪烃合成元件的表达，分别构建了脂肪酸脱羧酶基因oleT_JE或融合还原伴侣基因RhFRED的脂肪酸脱羧酶基因oleT_JE-RhFRED的表达载体。

1.质粒pLX105的构建

以蓝细菌Synechocystissp.PCC6803菌株基因组为模板，以1609F/1609R(引物序列见表1)为引物PCR得到slr1609基因片段，克隆进T载体pMD-19TSimple(商业载体)，得到质粒pMD19T-1609。采用SalI/PvuII双酶切将Km抗性基因ck2片段从pRL446(Yin,Lietal.2007)质粒上切下来，补平后平末端克隆进pMD19T-1609质粒的SmaI酶切位点，得到质粒pLX77。分别以质粒pFQ20(Tan,Yaoetal.2011)和质粒pET28b-oleT_JE为模版，以PrbcL-F/PrbcL-OleT-R和PrbcL-OleT-F/OleT-R(引物序列见表1)为引物PCR，得到P_rbcL启动子片段和oleT_JE基因片段，以上得到的片段两两融合并克隆进T载体pGEM-TEASY(商业载体)，得到质粒pLX89。以质粒pFQ20为模板，以Trbc-F/Trbc-R(引物序列见表1)为引物PCR，得到T_rbc终止子片段，克隆进T载体pGEM-TEASY(商业载体)，得到质粒pLX90。通过NdeI酶切补平并自连消除掉pLX90的NdeI酶切位点，得到质粒pLX91。采用XbaI/XhoI双酶切将含有P_rbcL启动子和oleT_JE基因的片段从pLX89质粒上切出，克隆进pLX91质粒的XbaI/XhoI位点，得到质粒pLX92。采用XbaI/SacI双酶切将含有P_rbcL启动子、oleT_JE基因和T_rbc终止子的片段从质粒pLX92质粒上切出，克隆进pLX77质粒的XbaI/SacI位点，得到质粒pLX105。

2.质粒pLX106的构建

以质粒pET28b-oleT_JE-RhFRED为模版，以OleT-F2/RhFRED-R2(引物序列见表1)为引物PCR，得到oleT_JE-RhFRED基因片段，克隆进T载体pGEM-TEASY(商业载体)，得到质粒pLX99。采用XhoI酶切、补平、NdeI酶切将oleT_JE-RhFRED基因片段从质粒pLX99质粒上切出，克隆进pLX92质粒的NdeI/PvuII位点，得到质粒pLX103。采用XbaI/SacI双酶切将含有P_rbcL启动子、oleT_JE-RhFRED基因和T_rbc终止子的片段从质粒pLX103质粒上切出，克隆进pLX77质粒的XbaI/SacI位点，得到质粒pLX106。

实施例7：含有脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产合成元件、还原伴侣蛋白元件的蓝细菌工程菌株的构建。

1.菌株LX111-LX114的构建

以Synechocystissp.PCC6803野生型菌株和过表达accBCDA基因的蓝细菌Synechocystissp.PCC6803菌株ACC(Tan,Yaoetal.2011)为出发菌株，分别将质粒pLX105及pLX106转化得到脂肪端烯合成菌株LX111(pLX105转化6803yu)、LX112(pLX106转化ACC)、LX113(pLX106转化6803yu)、LX114(pLX106转化ACC)。其中，合成菌株中的还原伴侣蛋白利用集胞藻PCC6803内源的ferredoxin和ferredoxinreductase。

2.LX111-LX114菌株通气培养光合生产脂肪端烯

将培养到对数期的LX111-LX114菌株接种至500mL三角烧瓶的300mLBG11液体培养基(BG11培养基成分为：1.5g/LNaNO₃,40mg/LK₂HPO₄·3H₂O,36mg/LCaCl₂·2H₂O,6mg/L柠檬酸,6mg/L柠檬酸铁铵,1mg/LEDTA二钠盐,20mg/LNaCO₃,2.9mg/LH₃BO₃,1.8mg/LMnCl₂·4H₂O,0.22mg/LZnSO₄·7H₂O,0.39mg/LNaMoO₄·2H₂O,0.079mg/LCuSO₄·5H₂O和0.01mg/LCoCl₂·6H₂O)中，最终OD₇₃₀为0.1，通无菌空气30℃培养，在培养时每个菌株培养三个平行，光照强度100μE·m^-2s^-1。培养基中根据菌株性质加入相应的抗生素：卡那霉素抗生素为20μg/mL，壮观霉素为30μg/mL，氯霉素为50μg/mL。蓝细菌生长过程中用可见光分光光度计测定OD₇₃₀。在培养到稳定期后，提取脂肪端烯，进行GC-MS检测分析。

脂肪端烯提取方法：

取200mL培养液，经9000rpm离心5min收集后，用10mL超纯水重悬；超声破碎：40％功率，5s超声，10s间隔，有效超声时间10min；将细胞破碎液加入到50mL圆底离心管中，向破碎液中加入50μL二十烷烃(eicosane)标样(1mg/mL)和50μL十七酸(heptadecanoicacid)标样(1mg/mL)，内标用于对脂肪烃和游离脂肪酸进行定量。再加入10mL氯仿:甲醇(v:v＝2:1)溶液，封上Parafilm膜，在室温下用涡旋振荡器振荡萃取1h或更长时间；室温8000g离心15min，产生一个两相液体，上层为水溶液，取下层有机相溶液于一个新的小玻璃试管中，55℃氮气吹干至只残留少量液体；最后，残留物加入1mL正己烷溶解，样品经过滤有机相的滤膜过滤进GC-MS进样瓶后，即可用于GC-MS检测。

测试分析条件：

脂肪烃的检测采用连接有四级杆质谱检测器的安捷伦7890A气象色谱-质谱联用仪。所使用的气相色谱柱为HP-INNOWax(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为氦气，流速为1mL/min，进样量为1μL，进样口温度为250℃，风流比为20:1。柱箱程序升温程序为100℃维持1min，5℃/min升至150℃，10℃/min升至250℃，250℃维持15min。气相测试结束后使用与仪器相连的分析软件进行相关定性与定量分析。

结论：

LX111-LX114菌株分别产生脂肪端烯1-十七烯，产量都约为75μg/L，结果如图10中星号所示。结果表明将oleT_JE或oleT_JE-RhFRED基因整合在蓝细菌Synechocystissp.PCC6803菌株的基因组上，可以产生一种新的脂肪端烯。

而后可按照上述实施例的记载将胞内过氧化氢水平调控元件整合于蓝细菌Synechocystissp.PCC6803菌株的基因组上，进而通过其对宿主细胞内过氧化氢浓度的调控，使蓝细菌工程菌能稳定大量合成脂肪端烯。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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Claims (11)

1.一种生产脂肪端烯的系统，其特征在于：系统包含脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产元件和还原伴侣蛋白；

或，系统包含脂肪端烯合成元件、脂肪酸高产元件、还原伴侣蛋白和胞内过氧化氢水平调控元件。

2.按权利要求1所述的生产脂肪端烯的系统，其特征在于：所述的脂肪端烯合成元件为来源于鲜咸海鲜球菌(Jeotgalicoccussp.)ATCC8456菌株的P450脂肪酸脱羧酶OleT_JE或其功能等同体。

3.按权利要求2所述的生产脂肪端烯的系统，其特征在于：所述脂肪端烯合成基因为P450脂肪酸脱羧酶基因oleT_JE和/或融合来源于红球菌(Rhodococcussp.)NCIMB9784的P450还原伴侣蛋白RhFRED编码基因的脂肪酸脱羧酶基因oleT_JE-RhFRED。

4.按权利要求1所述的生产脂肪端烯的系统，其特征在于：所述的脂肪酸高产元件为来源于大肠杆菌的硫酯酶'tesA基因、硫酯酶'tesA基因功能等同体的过表达载体、乙酰辅酶A羧化酶基因accBCDA、accBCDA功能等同体的过表达载体、脂肪酸代谢调控基因fadR、fadR功能等同体的过表达载体、脂酰辅酶A合成酶基因fadD、fadD功能等同体基因敲除的宿主菌株、脂酰辅酶A脱氢酶基因fadE、fadE功能等同体基因敲除的宿主菌株、来源于蓝细菌的脂酰ACP合成酶基因slr1609基因、slr1609基因功能等同体基因敲除的宿主菌株中的一种或几种。

5.按权利要求1所述的生产脂肪端烯的系统，其特征在于：所述的P450还原伴侣蛋白为来源于红球菌(Rhodococcussp.)NCIMB9784P450还原伴侣蛋白RhFRED、不同宿主来源的flavodoxin和flavodoxinreductase、或ferredoxin和ferredoxinreductase及上述相应的功能等同体中的一种或几种。

6.按权利要求1所述的生产脂肪端烯的系统，其特征在于：所述的胞内过氧化氢水平调控元件为oxyR调控基因敲除的宿主菌株。

7.一种权利要求1所述的生产脂肪端烯的系统用于生产脂肪端烯的应用。

8.一种生产脂肪端烯的化能异养微生物，其特征在于：异养微生物携带所述生产脂肪端烯的系统。

9.一种权利要求8所述的生产脂肪端烯的化能异养微生物用于生产脂肪端烯的应用。

10.一种生产脂肪端烯的光能自养微生物，其特征在于：光能自养微生物携带所述生产脂肪端烯的系统或系统中至少一个元件。

11.一种权利要求10所述的生产脂肪端烯的光能自养微生物用于生产脂肪端烯的应用。