MX2012008179A - Produccion de hidrocarburos en microorganismos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un microorganismo recombinante que emplea una ruta bacteriana para producir un aminoácido cíclico (por ejemplo, ácido coronámico o ácido norcoronámico) y una enzima vegetal (oxidasa de ACC) para oxidar el aminoácido y producir un alqueno (por ejemplo, 1-buteno o propeno). La expresión de estos dos módulos biosintéticos en varios chasis microbianos facilitará la producción de alqueno de fuentes de carbono y energía diversas, que incluyen azúcares, glicerol, CO2, CH4, H2 y luz solar.

Description

PRODUCCIÓN DE HIDROCARBUROS EN MICROORGANISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta descripción se refiere a la producción de hidrocarburos usando microorganismos recombinantes . En particular, esta descripción se refiere a la producción de alquenos tales como 1-buteno y/o propeno por microorganismos recombinantes .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El petróleo está enfrentando declinación de reservas globales y contribuye a más del 30% de emisiones de gases de invernadero conduciendo al calentamiento global. El consumo global de petróleo en la forma de combustibles de transportación alcanza 800 billones de barriles anualmente. El diesel y combustibles de aviación representan más de 50% de los combustibles de transportación global.

Debido al incremento en costos del petróleo y la dependencia en materias primas petroquímicas, la industria química también está buscando formas para mejorar el margen y estabilidad de precios, mientras reduce su huella ambiental. Una forma para realizar estas metas es a través del desarrollo de productos más ecológicos que son más eficientes en energía, agua y C02 que los productos actuales. Los combustibles producidos a partir de fuentes biológicas representan uno de tales procesos.

Las reservas totales de combustibles fósiles se están acabando y la extracción de combustibles fósiles de reservas conocidas está llegando a ser cada vez más costosa y compleja. Hidrocarburos producidos biológicamente tienen el potencial para reemplazar la dependencia de la sociedad en tales fósiles combustibles. Los hidrocarburos tienen alta densidad de energía, son compatibles con infraestructura existente que incluye instalaciones de almacenamiento y transporte, y constituyen una fuente de tanto de energía como materiales similares a plásticos y químicos de especialidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporciona en la presente un microorganismo recombinante, que comprende uno o más genes de la biosíntesis del ácido coronámico cuya expresión resulta en la producción de ácidos coronámicos y norcoronámicos; y un gen que codifica una ACC oxidasa (EC 1.14.17.4), en donde al menos uno de los genes es un gen recombinante. Uno o más genes de la biosíntesis del ácido coronámico pueden ser una isomerasa de L-isoleucina o L-valina y una sintasa de ácido coronámico .

El microorganismo recombinante puede incluir genes adicionales. Por ejemplo, el microorganismo recombinante puede comprender además un gen que codifica una ß-cianoalanina sintasa (EC 4.4.1.9) y un gen que codifica una nitrilasa (EC 3.5.5.1) Mientras en otras modalidades, el microorganismo recombinante puede comprender además uno o más de los siguientes: un gen que codifica una alanina deshidrogenasa (EC 1.4.1.1), un gen que codifica una glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2), un gen que codifica una serina O-acetil transferasa (EC 2.3.1.30), un gen que codifica una treonina deshidratasa (EC4.3.1.19) , un gen que codifica una homoserina deshidratasa (EC 4.4.1.1), un gen que codifica una citramalato sintasa (EC 4.1.3.22). En algunas modalidades, un microorganismo recombinante puede comprender además que codifican GDP mañosa sintasa (manosa-l-fosfato guanililtransferasa ; EC 2.7.7.22), GDP D-manosa epimerasa (EC 5.1.3.18), GDP L-galactosa pirofosforilasa (EC 2.7.7.69), L-galactosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.122) y L-galactonolactona deshidrogenasa (EC 1.3.2.3).

Un número de procariotas y eucariotas son adecuados para uso en la construcción de los microorganismos recombinantes descritos en la presente, por ejemplo, bacterias Gram-negativa, bacterias Gram-positivas, levadura, hongos, y organismos fotosintéticos . Por ejemplo, el microorganismo puede ser un Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Synechocystis 6803, Synechococcus 7002, Methylomonas methanica , Methylococcus capsulatus, o Rhodopseudomonas palustris .

El microorganismo también puede ser del género Pseudomonas . En algunas modalidades, tal microorganismo además comprende un gen que inhibe la producción de ácido coronafácico, o que comprende una mutación nula en un gen de ruta biosintética del ácido coronafácico .

Además se proporciona en la presente un método para producir 1-buteno, que comprende las etapas de: a) hacer crecer un microorganismo recombinante como se describe en la presente en un medio de cultivo, bajo condiciones en las cuales los genes de la biosintesis del ácido coronámico y el gen de ACC oxidasa son expresados; y b) recuperar el 1-buteno producido por dicho microorganismo. El buteno puede ser recuperado por métodos conocidos, por ejemplo, el 1-buteno puede ser recuperado como un producto volátil de los componentes gaseosos en el termentador. En algunas modalidades, el microorganismo es del género Pseudomonas y el medio de cultivo comprende un inhibidor de la biosintesis del ácido coronafácico .

También se proporciona un método para producir propeno, el método comprende las etapas de: a) hacer crecer un microorganismo recombinante como se describe en la presente, en donde el microorganismo además comprende un gen que codifica una sintasa de acetohidroxiácido resistente a retroalimentación (EC 2.2.1.6), en un medio de cultivo, bajo condiciones en las cuales los genes de la biosintesis del ácido coronámico, el gen ACC oxidasa y el gen de sintasa de acetohidroxiácido resistente a la retroalimentación son expresados; y b) recuperar el propeno producido por el microorganismo. El propeno puede ser recuperado por métodos conocidos, por ejemplo, el propeno puede ser recuperado como un producto volátil a partir de componentes gaseosos en el fermentador. En algunas modalidades, el microorganismo es del género Pseudomonas y el medio de cultivo comprende un inhibidor de la biosintesis del ácido coronafácico o es un mutante Pseudomonad que preferentemente acumula ácido coronámico sin transformación adicional.

Los detalles de una o más modalidades de la invención son expuestos en los dibujos acompañantes y la descripción siguiente. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la descripción y dibujos, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un esquema que ilustra la producción de buteno y propeno en un microorganismo recombinante usando varias materias primas. Los números indican átomos de carbono individuales .

La Figura 2 es un alineamiento de las secuencias de nucleótido de longitud completa de una ACC oxidasa de codón optimizado (ACC_opt) con la ACC oxidasa de tomate nativa (ACCO) .

La Figura 3 muestra un rastro cromatográfico de producción de propeno y buteno por las cepas recombinantes de P. syringae .

Símbolos de referencia similares en los varios dibujos indican elementos similares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Este documento se basa en el descubrimiento que microorganismos recombinantes expresan polipéptidos involucrados en la biosíntesis de ácidos coronámicos y norcoronámicos , y que expresan una 1-aminociclopropano-l-carboxilato oxidasa (ACC oxidasa) pueden producir alquenos tales como 1-buteno o propeno. La expresión de estos dos módulos biosintéticos en varios chasis microbianos permite a los alquenos ser producidos de fuentes de energía y carbono tales como azúcares, glicerol, C02, CH4, H2, y luz solar, en lugar de combustibles fósiles. Véase Figura 1. Al menos uno de los genes que codifican estos módulos biosintéticos es un gen recombinante, el gen recombinante particular dependiente de las especies o cepas seleccionadas para uso. Los módulos biosintéticos adicionales pueden ser incluidos para incrementar el rendimiento del alqueno, mejorar la eficiencia con la cual las fuentes de carbono y energía son convertidas a alquenos, y/o para facilitar la producción a gran escala de alqueno por el microorganismo durante el cultivo. Tales módulos biosintéticos adicionales incluyen un gen que codifica una ß-cianoalanina sintasa y un gen que codifica una nitrilasa, estos genes pueden ser genes endógenos o genes recombinantes .

Como se usa en la presente, el término microorganismo recombinante se refiere a un microorganismo, el genoma del cual ha sido aumentado por al menos una secuencia de ADN incorporada. Tales secuencias de ADN incluyen pero no se limitan a genes que no están naturalmente presentes, secuencias de ADN que no son normalmente transcritas en el ARN o traducidas en una proteína ("expresadas"), y otros genes o secuencias de ADN los cuales se desean introducir en el microorganismo no recombinante. Se apreciará que típicamente el genoma de un microorganismo recombinante descrito en la presente es aumentado a través de la introducción estable de uno o más genes recombinantes que no son originalmente residentes en el microorganismo que es el recipiente del ADN. Sin embargo, está dentro del alcance de la invención aislar un fragmento de ADN de un microorganismo dado, y subsecuentemente introducir una o más copias adicionales de tal ADN nuevamente en el mismo microorganismo, por ejemplo, para mejorar la producción del producto de un gen o alterar el patrón de expresión de un gen. En algunos casos, el ADN introducido modificará o aún reemplazará un gen endógeno o secuencia de ADN, mediante, por ejemplo, recombinación homologa o mutagénesis dirigida al sitio. El término "gen recombinante" se refiere a un gen o secuencia de ADN gue se introduce en un microorganismo recipiente, con respecto de si el mismo o similar gen puede ya estar presente en tal microorganismo. "Introducido" o "aumentado" en este contexto, se conoce en la técnica por significar introducido y aumentado por la mano del hombre. De este modo, un gen recombinante puede ser una secuencia de ADN de otras especies, o puede ser una secuencia de ADN que se origina de o está presente en las mismas especies, pero ha sido incorporada en un microorganismo por métodos de ingeniería genética para formar un microorganismo recombinante. Se apreciará que un gen recombinante que se introduce en un microorganismo puede ser idéntico a una secuencia de ADN que está normalmente presente en el microorganismo a ser transformado, y se introduce para proporcionar una o más copias adicionales del ADN para de este modo permitir la sobre expresión o expresión modificada del producto de gen de tal ADN.

Polipéptidos de la Biosíntesis del ácido coronámico El ácido coronámico (ácido l-amino-2-etilciclopropil-l-carboxílico; CMA) es un ciclopropil aminoácido producido por ciertas especies fitopatogénicas de Pseudomonas . El ácido coronámico es una porción encontrada en la fitotoxina, coronatina. La ruta bacteriana usada para producir ácido coronámico involucra isomerización de L-isoleucina a L-alo-isoleucina, la cual es entonces oxidativamente ciclizada para formar ácido coronámico. Un compuesto relacionado, ácido norcoronámico (ácido (lS,2S)-2-metil-l-aminociclopropano-l-carboxílico; nCMA) es producido por ciclización de L-valina.

La conversión de alo-isoleucina a ácido coronámico en Pseudomonas involucra un agrupamiento de genes, conocido como el agrupamiento cma . Véase, por ejemplo, US 2007/0264691; Gross, H. and Loper, J.E. (2009) Wat. Prod. Rep. 26: 1408-1446; Buell et al. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 100: 10181-10186 (2003); y Ullrich, M. and Bender, C.L. (1994) J. Bacteriol 176: 7574-7586). Por ejemplo, una región de 7-10 kb de un plásmido de 90 kb designado p4180A en P. syringae pv. glycinea PG4180 contiene genes co-transcritos suficientes para convertir alo-isoleucina a ácido coronámico. Como otro ejemplo, un agrupamiento de genes cromosómicamente codificados de P. syringae pv. tomato DC3000 contiene genes suficientes para la biosintesis del ácido coronámico . El agrupamiento del gen cma es también capaz de convertir valina en ácido norcoronámico e isoleucina en diastereómero (s ) de ácido coronámico natural. Couch, R. et al. (2004) J. Bacteriol. 186: 35-42; Parry, R.J. et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 223 : 1849-1850. Cinco genes (cmaA, cmaB, cmaC, cmaD y cmaE) son reportados por ser requeridos para la biosintesis de CMA y nCMA in vitro. Vaillancourt , F.H. et al. (2005) Nature 436: 1191-1194. Un gen adicional, cmaT, tiene actividad de tioesterasa y se reporta por estar involucrado en la liberación de CMA de la proteina CmaD. Patel et al., (1998) Tetrahedron 54: 15927-15936. Las secuencias de aminoácido y nucleótido para genes en los agrupamientos del gen cma se describen bajo en número de acceso de GenBank AY381839 (gi: 37575137) y U14657 (gi: 2673889). Las secuencias para el agrupamiento del gen cma de P. syringae pv. tomato DC3000 se pueden encontrar en la secuencia genómica completa para este organismo, bajo el número de acceso de GenBank AE016853 (gi: 28856110) .

La síntesis de los ciclopropil aminoácidos se reporta por ser controlada al nivel transcripcional por factores trans-actuantes . Por ejemplo, la síntesis de ciclopropil aminoácidos en P. syringae pv. glycinea PG4180 se informa, es regulada por un sistema de dos componentes controlado por la temperatura de crecimiento. Bender et al, Microbiol Mol Biol Rev 63:266-292 (1999). De manera similar, un regulador de la transcripción negativo, HrpV, se ha reportado por estar involucrado en la síntesis de coronatina en P. syringae pv. tomato DC3000. Penaloza-Vazquez A, et al, Microbiology 146 :2447-2456 (2000). El HrpV regula negativamente la expresión del reguión hrp. La supresión de este gen junto con hrcC y hrpT se encontró por incrementar la síntesis de ciclopropilaminoácidos por 30-40 veces. Véase, US 2007/0264691. Los tres genes (hrcC, hrpT y hrpV) son agrupados en conjunto en P. syringae pv. tomato DC3000.

La expresión de genes involucrados en la ruta biosintética de CMA y nCMA (por ejemplo, un agrupamiento de gen cma) en un microorganismo confiere la capacidad para sintetizar ácido coronámico o ácido norcoronámico sobre tal microorganismo. Como se discute en más detalle abajo, los genes de la biosíntesis del ácido coronámico pueden estar presentes naturalmente en un microorganismo, por ejemplo, Pseudomonas . En algunos casos, uno más de tales genes son genes recombinantes que han sido transformados en un microorganismo que no lo posee naturalmente, por ejemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Synechocystis 6803, Synechococcus 7002, Methylomonas methanica , Methylococcus capsulatus, o Rhodopseudomonas palustris .

El CmaA es una enzima de adenilación de aminoácido que reacciona con el derivado de AMP de L-alo-isoleucina para producir un intermediario de aminoacil tioléster. El CmaA contiene dominios de adenilación y tiolación. Varias secuencias de cmaA se pueden encontrar bajo los siguientes números de acceso de GenBank: ZP_06482567 (gi: 289651224), ZP_07252114 (gi: 302060573), NP_794453 (gi: 28871834) y AAC46032 (gi: 2673890) .

El CmaB es un componente de la sintetasa de ácido coronámico, una dioxigenasa de unión al hierro no heminico. Varias secuencias de cmaB se pueden encontrar bajo los siguientes números de acceso de GenBank: NP_794454 (gi: 28871835), ZP_06460771 (gi: 289627817) y ZP_04586949 (gi: 237798488) and YP_003450258 (gi: 288959918).

El CmaC es una ciclasa que cataliza la formación de un anillo ciclopropilo de L-alo-isoleucina clorada. Varias secuencias de cmaC se pueden encontrar bajo los siguientes números de acceso de GenBank: NP_794455 (gi: 28871836), ZP_07234588 (gi: 301386170), y ZP_06460770 (gi: 289627816) y YP_003450259 (gi: 288959919).

El CmaE es una acetil transferasa que transfiere grupos de aminoácido entre dominios de tiolación de CmaA y CmaD. Varias secuencias de cmaE se pueden encontrar bajo los siguientes números de acceso de GenBank: NP_794452 (gi: 28871833), ZP_06460773 (gi: 289627819), ZP_06482566 (gi: 289651223), ZP_07252113 (gi: 302060572), ZP_07235048 (gi: 301386630), ZP_04586951 (gi: 237798490) y ??058147 (gi: 28855086) .

El CmaD es una proteina portadora de acilo que tiene un sitio de unión a fosfo-panteteina . Varias secuencias de cmaD se pueden encontrar bajo los siguientes números de acceso de GenBank: NP_794451 (gi: 28871832), ZP_04586952 (gi: 237798491), AA058146 (gi: 28855085), ZP_06460774 (gi: 289627820), ZP_06482565 (gi: 289651222), ZP_07234760 (gi: 301386342), ZP_07252112 (gi: 302060571).

El CmaT es un componente de tioesterasa involucrado con la sintetasa de ácido coronámico en la liberación de CMA de la proteina CmaD. Varias secuencias de cmaT se pueden encontrar bajo los siguientes números de acceso de GenBank: NP_794456 (gi: 28871837), ZP_06482572 (gi: 289651229), ZP_07234587 (gi: 301386169), ZP_06460769 (gi: 289627815) y ZP_04586947 (gi: 237798486).

En vista de lo anterior, se apreciará que genes recombinantes para los seis polipéptidos de la biosintesis del ácido coronámico descrito anteriormente necesitan no necesariamente ser de un agrupamiento de gen cma que se origina naturalmente. Preferiblemente, una combinación útil de genes puede ser construida usando genes de diferentes especies o de diferentes cepas de las mismas especies. De este modo, uno o más constructos de ácido nucleico útiles en la invención pueden tener genes que codifican polipéptidos de la biosintesis del ácido coronámico que se derivan de o son homólogos funcionales de genes de la misma cepa, de dos diferentes especies o cepas, tres diferentes especies o cepas, cuatro diferentes especies o cepas, cinco diferentes especies o cepas, o aún seis diferentes especies o cepas.

Homólogos funcionales de los polipéptidos de la biosintesis de CMA y nCMA descritos anteriormente también son adecuados para uso en la producción de alqueno en un microorganismo recombinante . Un homólogo funcional es un polipéptido que tiene similitud de secuencia con un polipéptido de referencia, y que porta una o más de la(s) función (es) bioquímicas o fisiológicas del polipéptido de referencia. Un homólogo funcional y el polipéptido de referencia pueden ser polipéptidos que se originan naturalmente, y la similitud de secuencia puede ser debida a eventos evolucionarlos convergentes o divergentes. Como tal, los homólogos funcionales son algunas veces designados en la literatura como homólogos, u ortólogos o parálogos. Las variantes de un homólogo funcional que se origina naturalmente, tales como polipéptidos codificados por mutantes de una secuencia codificante de tipo nativo, pueden ellas mismas ser homólogos funcionales. Los homólogos funcionales también pueden ser creados vía mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia codificante para un polipéptido, o por combinación de dominios de las secuencias codificantes para diferentes polipéptidos que se originan naturalmente ("intercambio de dominio"). Los homólogos funcionales también pueden ser creados vía mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia codificante para un polipéptido que se origina naturalmente, o por dominios de combinación de las secuencias codificante para diferentes polipéptidos que se originan naturalmente ("intercambio de dominio") . Las técnicas para modificar genes que codifican polipéptidos de la biosintesis funcional del ácido coronámico y ACC oxidasas descritas en la presente se conocen e incluyen, entre otros, técnicas de evolución dirigida, técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de mutagénesis aleatoria, y pueden ser útiles para incrementar la actividad especifica de un polipéptido, alterar la especificidad del sustrato, alterar los niveles de expresión, alterar la ubicación subcelular, o modificar las interacciones polipéptido:polipéptido en una manera deseada. Tales polipéptidos modificados son considerados homólogos funcionales. El término "homólogo funcional" es algunas veces aplicado al ácido nucleico que codifica un polipéptido funcionalmente homólogo.

Homólogos funcionales pueden ser identificados por análisis de alineamientos de secuencia de polipéptido y nucleótido. Por ejemplo, realizando una pregunta en una base de datos de secuencias de polipéptido o nucleótido se pueden identificar homólogos de polipéptidos de la biosintesis del ácido coronámico. El análisis de secuencia puede involucrar análisis BLAST, BLAST reciproco o PSI-BLAS de bases de datos no redundantes usando una secuencia de aminoácido de polipéptido de la biosintesis del ácido coronámico como la secuencia de referencia. La secuencia de aminoácido es, en algunos casos, deducida de la secuencia de nucleótido. Estos polipéptidos en la base de datos que tienen más de 40% de identidad de secuencia son candidatos para evaluación adicional para adecuabilidad como un polipéptido de la biosintesis del ácido coronámico. La similitud de secuencia de aminoácido permite sustituciones de aminoácidos conservativos, tales como sustitución de un residuo hidrofóbico por otro o sustitución de un residuo polar por otro. Si se desea, se puede llevar a cabo inspección manual de tales candidatos para estrechar el número de candidatos a ser además evaluados. La inspección manual puede ser realizada seleccionando aquellos candidatos que parecen tener dominios presentes en polipéptidos de la biosintesis del ácido coronámico, por ejemplo, dominios funcionales conservados .

Regiones conservadas pueden ser identificadas localizando una región dentro de la secuencia de aminoácido primario de un polipéptido de la biosíntesis de CMA y nC A que es una secuencia repetida, forma algunas estructuras secundarias (por ejemplo, hélices y láminas beta), establece dominios positivamente o negativamente cargados, o representa una porción o dominio de proteina. Véase por ejemplo, el sitio de red Pfam que describe secuencias consenso para una variedad de porciones y dominios de proteina en la Amplia Red Mundial en sanger.ac.uk/Software/Pfam/ y pfam.janelia.org/. Una descripción de la información incluida en la base de datos de Pfam se describe en Sonnhammer et al., Nucí. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); y Bateman et al., Nucí. Acids Res., 27:260-262 (1999). Regiones conservadas también pueden ser determinadas por alineamiento de secuencias de los mismos polipéptidos o relacionados a partir de especies estrechamente relacionadas. Especies estrechamente relacionadas preferiblemente son de la misma familia. En algunas modalidades, el alineamiento de secuencias de dos diferentes especies es adecuado.

Típicamente, polipéptidos que presentan al menos aproximadamente 40% de identidad de secuencia de aminoácido son útiles para identificar regiones conservadas. Regiones conservadas de polipéptidos relacionados presentan al menos 45% de identidad de secuencia de aminoácido (por ejemplo, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácido) . En algunas modalidades, una región conservada presenta al menos 92%, 94%, 96%, 98%, ó 99% de identidad de secuencia de aminoácido. Se apreciará que homólogos funcionales de los polipéptidos descritos abajo son también adecuados para uso en la producción de alqueno en un microorganismo recombinante .

Polipéptidos de ACC oxidasa La 1-aminociclopropano-l-carboxilato oxidasa (ACC oxidasa) es una enzima encontrada naturalmente en plantas, y un miembro de una superfamilia de oxidasas y oxigenasas de hierro no heminico. La ACC oxidasa desdobla dos enlaces carbono-carbono en 1-aminociclopropan-l-carboxilato (ACC) para producir etileno, cianuro, y C02. El sistema usa ascorbato como un co-sustrato, contrario a la mayoría de oxidasas y oxigenasas de hierro no heminico, las cuales usan 2-cetoglutatarato. El C02 también actúa como un activador de ACC oxidasa en muchos casos, distinto de otros miembros de la superfamilia de la enzima no hemínica . La ACC oxidasa es codificada por una familia de gen múltiple en la mayoría de especies vegetales. Por ejemplo, el genoma de Arabidopsis codifica cinco genes de ACC oxidasa, mientras el de tomate codifica seis. Véase Lin, Z et al, supra, y Blume, B. and Grierson, D. Plant J. 12: 731-746 (1997).

Se ha descubierto que la ACC oxidasa no puede utilizar solamente ACC como un sustrato, también puede utilizar ácido coronámico, proporcionando 1-buteno como el producto de reacción.

Además, la ACC oxidasa puede utilizar ácido norcoronámico como un sustrato, proporcionando propeno como el producto de reacción. Todos los diastereoisómeros de ácido coronámico y ácido norcoronámico (1R,2R; 1R,2S; 1S,2R; 1S,2S) son oxidados por ACC oxidasa. De este modo, la expresión en un microorganismo recombinante de genes de la ruta de biosintesis del ácido coronámico y un gen de ACC oxidasa resulta en la conversión de isoleucina a 1-buteno. Además, la expresión en un microorganismo recombinante de genes de la ruta de biosintesis del ácido coronámico y un gen de ACC oxidasa resulta en la conversión de valina a propeno.

Subproductos de Polipéptidos de Reciclaje La síntesis de buteno y/o propeno en un microorganismo recombinante genera CO2 y CN como subproductos. Mientras el C02 se pierde como un gas o recaptura en el caso de organismos fotosintéticos , el CN es tóxico para muchos microorganismos. Por lo tanto, la presencia de una ruta de destoxificación de cianuro en el microorganismo recombinante puede facilitar el rendimiento superior y rendimiento incrementado de alqueno durante el cultivo y proporcionar un mecanismo para capturar eficientemente carbono y nitrógeno reducido. Enzimas adecuadas para uso en destoxificación de cianuro incluyen ß-cianoalanina sintasa y nitrilasa. La co-expresión de una ß-cianoalanina sintasa y una nitrilasa convierte cianuro a una porción es asparagina, la cual puede entonces ser convertida en varios otros aminoácidos. De este modo, la combinación de ß-cianoalanina sintasa y nitrilasa no solamente destoxifica el subproducto de cianuro, también puede reciclar nitrógeno de ácido coronámico en la combinación de aminoácido, de este modo reduciendo la cantidad de nitrógeno requerido en el medio de cultivo cuando se producen alquenos.

Los genes que codifican ß-cianoalanina sintasas se conocen. Varias especies vegetales tienen ß-cianoalanina sintasas eficientes para destoxificar cianuro. Los genes para nitrilasas pueden encontrarse en un amplio rango de microorganismos mesofilicos, que incluyen las especies de Bacillus , Norcardia , Bacteridium, Rhodococcus , Micrococcus , Brevibacterium , Alcaligenes, Acinetobacter, Corynebacteriu , Fusarium y Klebsiella.

Otros polipéptidos Genes para polipéptidos adicionales que facilitan la producción más eficiente o a escala más grande de un alqueno deseado también pueden ser introducidos en un microorganismo recombinante . Por ejemplo, un microorganismo recombinante también puede contener un gen que codifica una treonina deshidratasa o un gen que codifica una homoserina deshidratasa . Tales genes son útiles debido a que pueden incrementar el flujo de carbono y nitrógeno en la ruta de isoleucina, produciendo 2-ceto butirato de la homoserina generada por la ruta de destoxificación de cianuro. El amoniaco liberado puede ser capturado incluyendo un gen que codifica una alanina deshidrogenasa o un gen que codifica una glutamato deshidrogenasa.

En algunas modalidades, un microorganismo recombinante también contiene un gen que codifica GDP mañosa sintasa, GDP D-manosa epimerasa, GDP L-galactosa pirofosforilasa, L-galactosa deshidrogenasa, y L-galanolactona deshidrogenasa. Este grupo de genes funciona en conjunto para producir ascorbato biosintéticamente . Otras rutas también están disponibles para incrementar el flujo de carbono a través de ascorbato, un cosustrato importante para ACC oxidasa.

En algunas modalidades, un microorganismo recombinante también puede contener un gen que codifica una serina O-acetil transferasa. Esta enzima cataliza una de las etapas en la biosintesis de L-cisteina, la ruta predominante por la cual el azufre inorgánico se incorpora en compuestos orgánicos. La Serina O-acetil transferasa es capaz de catalizar la reacción de acetil-coenzima A y L-serina para producir coenzima A y O-acetil-L-serina .

Biosintesis de Valina e Isoleucina El flujo a través de los genes de la ruta biosintética nativa para la biosintesis de valina y/o isoleucina en microorganismos recombinantes es a menudo suficiente para producir buteno y/propeno como se describe en la presente. Sin embargo, es útil en algunos casos, modificar genes endógenos en un microorganismo recombinante para incrementar la tasa en la cual son sintetizadas la valina y/o isoleucina. Tales modificaciones incluyen mutaciones de punto, inserciones, supresiones y reacomodos de genoma, y pueden ser realizadas mediante, por ejemplo, técnicas de evolución dirigida.

En otros casos, es útil incrementar además el flujo a través de las rutas de biosintesis de valina o isoleucina introduciendo uno o más genes recombinantes que codifican y expresan polipéptidos involucrados en la biosintesis de valina en un microorganismo recombinante. Por ejemplo, un microorganismo recombinante puede contener uno o más de los siguientes genes recombinantes : un gen que codifica una acetohidroxiácido sintasa II insensible a inhibición de retroalimentación por valina, un gen que codifica una acetohidroxiácido reductoisomerasa , un gen que codifica una dihidroxiácido deshidratase y un gen que codifica una transaminasa-B . Elisakova et al., (2005) Applied and Environ, Microbiol, 71: 207-213. La expresión de tales genes en el microorganismo puede resultar en un incremento en la cantidad de valina producida, comparada con un microorganismo correspondiente que carece de tales genes recombinantes. En algunas modalidades, un gen recombinante que codifica una valina-isoleucina transaminasa que presenta una preferencia para L-alo-isoleucina puede ser introducido en un microorganismo recombinante y de este modo incrementar en la cantidad de L-alo-isoleucina producida, comparado con un microorganismo correspondiente que carece de tal gen recombinante .

Un microorganismo recombinante también puede contener genes que codifican y expresan polipéptidos involucrados en la biosintesis de isoleucina y, en algunos casos, la isomerización de L-isoleucina a L-alo-isoleucina . Existen dos rutas conocidas para la biosintesis de isoleucina, las cuales difieren de entre si en la manera en la cual 2-cetobutirato es sintetizado. Algunos microorganismos sintetizan 2-cetobutirato de treonina por treonina desaminasa. Otros microorganismos sintetizan 2-cetobutirado de citramalato via condensación de acetil-CoA y piruvato usando una serie de reacciones enzimáticas, que incluyen citramalato sintasa e isopropil malato deshidrogenasa . Atsumi S, et al., Appl Environ Microbiol 74:7802-7808 (2008). El 2-cetobutirato es entonces convertido a isoleucina en cuatro etapas enzimáticas. Los polipéptidos involucrados en la porción común de la ruta de la biosintesis de isoleucina, o en una o ambas de las porciones de 2-cetobutirato de la ruta de la biosintesis de isoleucina, pueden ser introducidos via genes recombinantes que codifican el (los) polipéptido ( s ) deseados y de este modo incrementar en la cantidad de valina producida, comparado con un microorganismo correspondiente que carece de tales genes recombinantes. Los polipéptidos involucrados en la isomerización de L-isoleucina a L-alo-isoleucina también pueden ser introducidos como genes recombinantes, si se desea. En algunas modalidades, un gen recombinante que codifica piridoxal fosfato aminotransferasa se introduce en un microorganismo. La piridoxal fosfato aminotransferasa ha sido reportada por catalizar la formación de L-alo-isoleucina de L-isoleucina. Mamer J. Chromatography 758: 49-55 (2001) .

Para aquellos microorganismos por los cuales el 2-cetobutirato es principalmente sintetizado de treonina, la desregulación de treonina desaminasa puede lograr cantidades mayores de isoleucina. Por ejemplo, un microorganismo recombinante puede contener un gen que codifica una treonina desaminasa y un gen que codifica una aspartato cinasa que es insensible a regulación de retroalimentacion por treonina. Se conocen aspartato cinasas mutantes insensibles a retroalimentacion, por ejemplo, aspartato cinasas de E. coli insensibles a retroalimentacion, y pueden resultar en niveles incrementados del sustrato treonina. Como otro ejemplo, un microorganismo recombinante puede contener uno o más de los siguientes genes recombinantes : un gen que codifica una aspartato cinasa insensible a retroalimentacion, un gen que codifica una treonina desaminasa resistente a inhibición de retroalimentacion por isoleucina, un gen que codifica una acetohitroxiácido sintasa II insensible a inhibición de retroalimentacion por isoleucina, un gen que codifica una acetohidroxiácido reductoisomerasa (EC 1.1.1.86), un gen que codifica una dihidroxiácido deshidratasa (EC 4.2.1.9) y un gen que codifica una transaminasa-B (EC 2.6.1.42). La expresión de uno o más de tales genes resulta en un incremento en la cantidad de isoleucina comparado con un microorganismo correspondiente que carece de tales genes recombinantes .

En algunas modalidades, un microorganismo recombinante contiene uno o más de los siguientes genes recombinantes: un gen que codifica una citramalato sintasa, un gen que codifica una acetohitroxiácido sintasa II insensible a inhibición de retroalimentación por isoleucina, un gen que codifica una acetohidroxiácido reductoisomerasa, un gen que codifica una dihidroxiácido deshidratasa y un gen que codifica a transaminasa-B . La expresión de uno o más de tales genes resulta en un incremento en la cantidad de isoleucina comparado con un microorganismo correspondiente que carece de tales genes recombinantes.

Algunos microorganismos, tales como P. syringae pv. tomato DC3000, contienen genes para treonina desaminasa asi como también genes involucrados en la ruta de citramalato, indicando que 2-cetobutirato puede ser producido ya sea de treonina o directamente de piruvato para estos microorganismos. Por lo tanto, el flujo a través de una o ambas de las porciones de treonina desaminasa o la porción de citramalato de la ruta de isoleucina pueden ser modificadas en tales microorganismos para incrementar la cantidad y velocidad de biosintesis de isoleucina.

Polipéptidos Rédox Puede ser útil balancear el metabolismo rédox en un microorganismo recombinante, específicamente, el nivel de estado listo de NADPH. Para lograr metabolismo rédox balanceado, un gen recombinante que codifica una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa que usa NADP-NADPH en lugar de NAD-NADH puede ser expresado a NADPH acumulado. Un ejemplo de tal enzima es una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum. Como otro ejemplo, un gen recombinante que codifica una transhidrogenasa NAD(P)+ funcional puede ser expresado en el microorganismo. Transhidrogenasas solubles son particularmente útiles en este sentido.

Genes Un gen que codifica un polipéptido descrito en la presente comprende la secuencia codificante para tal polipéptido, operablemente ligado en orientación sentido a una o más regiones reguladoras adecuadas para expresar el polipéptido. Debido a que muchos microorganismos se conocen por codificar proteínas múltiples de una ruta en una unidad policistrónica, polipéptidos múltiples pueden ser expresados bajo el control de una región reguladora única para estos microorganismos, si se desea. Una secuencia codificante y una región reguladora son consideradas por ser operablemente ligadas cuando la región reguladora y secuencias codificantes son posicionadas de manera que la región reguladora es efectiva para regular la transcripción o traducción de la secuencia. Típicamente, el sitio de iniciación de traducción del marco lector traduccional de la secuencia codificante es posicionado entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos corriente abajo de la región reguladora para un gen monocistrónico .

"Región reguladora" se refiere a un ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótido que tiene influencia en la iniciación y velocidad de la transcripción o traducción, y estabilidad y/o morbidez de un producto de transcripción o traslación. Regiones reguladoras incluyen, son limitación, secuencias promotoras, secuencias intensificadoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteína, elementos inducibles, secuencias de unión a la proteína, regiones no traducidas al 5' y 3' (UTRs) , sitios de inicio transcripcionales, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, intrones y combinaciones de los mismos. Una región reguladora típicamente comprende al menos un promotor nuclear (basal) . Una región reguladora también puede incluir al menos un elemento de control, tal como una secuencia intensificadora, un elemento corriente arriba o una región de activación corriente arriba (UAR) .

La elección de regiones reguladoras a ser incluidas depende de varios factores, que incluyen, pero no se limitan a, eficiencia, selectabilidad, inducibilidad, nivel de expresión deseado, y expresión preferencial durante ciertas etapas del cultivo. Es un tema de rutina para un experto en la técnica modular la expresión de una secuencia codificante seleccionado y posicionando regiones reguladoras apropiadamente con relación a la secuencia codificante. Se entenderá que más de una región reguladora puede estar presente, por ejemplo, intrones, intensificadores, regiones de activación corriente arriba, terminadores de la transcripción y elementos inducibles.

Se apreciará que puede ser deseable remover ciertas regiones reguladoras para incrementar los niveles de expresión. Por ejemplo, puede ser deseable remover regiones atenuadoras para incrementar la expresión de polipéptidos de la biosintesis de valina. Véase, Hashiguchi K et al., Biosci Biotechnol Biochem 63:672-679 (1999).

Uno o más genes pueden ser combinados en un constructo de ácido nucleico recombinante en "módulos" útiles para un aspecto discreto de producción de alqueno. Combinar una pluralidad de genes en un módulo, particularmente un módulo policistrónico, facilitar el uso del módulo en una variedad de especies. Por ejemplo, un agrupamiento de gen cma y una ACC oxidasa pueden ser combinados en un módulo policistrónico de manera que, después de la inserción de una región reguladora adecuada, el módulo puede ser introducido en una amplia variedad de especies no Pseudomonas . Además de genes útiles para producción de alqueno, un constructo recombinante típicamente también contiene un origen de replicación, y uno o más marcadores seleccionables para mantenimiento del constructo en especies apropiadas.

Se apreciará que debido a la degeneración del código genético, un número de ácido nucleicos puede codificar un polipéptido particular; es decir, para muchos aminoácidos, existe más de un triplete nucleótido que sirve como el codón para el aminoácido. De este modo, codones en la secuencia codificante para un polipéptido dado pueden ser modificados de manera que se obtiene la expresión óptima en un microorganismo particular, usando tablas de desvío de codón apropiado para tal microorganismo, y ácidos nucleicos optimizados de codón son típicamente usados cuando el polipéptido a ser expresado es heterólogo para tal microorganismo. Véase Figura 2, el cual muestra una secuencia codificante de ACC oxidasa optimizada para expresión en Pseudomonas .

En algunos casos, es deseable inhibir una o más funciones de un polipéptido endógeno de un polipéptido endógeno. Por ejemplo, puede ser deseable inhibir la biosintesis del ácido coronafácico en una cepa de Pseudomonas usando técnicas recombinantes . En tales casos, un ácido nucleico que inhibe la expresión de una proteina involucrada en la biosintesis del ácido coronafácico puede ser incluido en un constructo recombinante que es entonces transformado en la cepa.

Microorganismos Un número de procariotas y eucariotas son adecuados para uso en la construcción de microorganismos recombinantes descritos en la presente, por ejemplo, bacterias Gram-negativas, hongos y levaduras. Típicamente, una especie y cepa es primero analizada para determinar cuáles genes de producción de alquenos son endógenos a la cepa y cuales genes no están presentes. Genes para los cuales una contraparte endógeno está presente en la cepa son ensamblados en uno o más constructos recombinantes, los cuales son entonces transformados en la cepa para suministrar la(s) función (es) perdidas. Genes para los cuales una contraparte endógena está presente en la cepa pueden, si se desea, ser modificados como se describe anteriormente o suplementados con uno o más genes recombinantes para mejorar el flujo en la cepa a través de rutas particulares o etapas particulares.

Especies procarioticas y eucarióticas ejemplares se describen en más detalle abajo. Sin embargo, se apreciará que otras especies pueden ser adecuadas. Por ejemplo, especies adecuadas pueden estar en un género seleccionado del grupo que consiste de Acetobacter, Achromobacter, Acidiphilium, Acinetobacter, Alcalígenes, Bacíllus, Bifidobacterium, Brevibacillus, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Enterococcus, Erwinia, Klebsiella , Kluyveromyces, Lactobacillus, Leuconostoc, Methanogenium, Methylomonas, Micrococcus, Propionibacterium, Pseudomonas, Pyrococcus, Streptococcus, Streptomyces, Trichoderma, Xanthomonas, y Zymomonas . En algunas modalidades, un microorganismo puede ser una cianobacteria seleccionada del grupo que consiste de Synechocystis, Synechococcus, Anabaena , Cyanothece, Thermosynechococcus, Rhodopseudomonas . En algunas modalidades, un microorganismo de un género seleccionado del grupo que consiste de Aspergillus, Candida, Pichia, Saccharomyces, y Rhodotorula. En algunas modalidades, un microorganismo puede ser un microorganismo fotosintético . Por ejemplo, el organismo puede ser de un género seleccionado del grupo que consiste de Chlamydomonas, Dunaliella , Chlorella , Botryococcus, Nannochloropsis, Physcomitrella , y Ceratodon . Pseudomonas Un microorganismo recombinante , como se proporciona en la presente puede ser una especie de Pseudomonas, particularmente P. syringae . P. syringae es un productor natural de ácido coronámico, y por lo tanto la producción de 1-buteno por P. syringae se puede lograr por inserción de un gen único, un gen que codifica una ACC oxidasa. Muchas cepas de P. syringae están disponibles, asi como también, mutantes en varios genes. Un número de plásmidos están disponibles para preparar constructos recombinantes que contienen genes deseados. Se conocen métodos de transformación por los cuales los constructos pueden ser introducidos en P. syringae y hacer un microorganismo recombinante .

La ruta de biosintesis de coronatina nativa en P. syringae involucra producción de ácido coronámico y un segundo precursor a coronatina, ácido coronafácico . En la presencia de ácido coronafácico, coronatina sintasa puede competir con ACC oxidasa por ácido coronámico y de este modo reducir la cantidad de buteno que podría de otro modo ser producida. Por consiguiente, una mutación nula en un gen de ruta de ácido coronafácico puede ser usado para prevenir la formación de ácido coronafácico. Se conocen cepas de P. syringae que contienen mutaciones de ácido coronafácico. Véase, por ejemplo, Brooks, D.M. et al., (2004) Mol. Plant Microbe. Interact. 17: 162-174. Alternativamente, un constructo recombinante que incluye un gen que inhibe la producción de ácido coronafácico puede ser introducido. En otra modalidad, la síntesis de ácido coronafácico puede ser inhibida a través del uso de un medio de cultivo que comprende un inhibidor de la biosíntesis del ácido coronafácico .

En una modalidad, una ACC oxidasa de tomate se introduce en P. syringae. Esta isoforma ha sido previamente expresada y purificada en forma nativa de E. coli, y de este modo se espera sea activa en Pseudomonas, aunque las ACC oxidasas de otras especies también pueden ser usadas. Los genes de ruta de destoxificación de cianuro tales como ß-cianoalanina sintasa y nitrilasa también son introducidos. Otros genes opcionales pueden ser introducidos en la cepa de Pseudomonas seleccionada, como se discute anteriormente.

Escherichia coli Escherichia coli, un organismo de chasis ampliamente usado en biología sintética, también puede ser usado como la plataforma de microorganismo recombinante . Existen bibliotecas de mutantes, plásmidos, modelos de computadora detallados de metabolismo y otra información disponible para E. coli, que permiten el diseño racional de varios módulos para mejorar el rendimiento del producto. Métodos similar a aquellos descritos anteriormente para P. syringae pueden ser usados para hacer microorganismos de E. coli recombinantes .

Existe un número de plásmidos de amplio rango de hospederos de diferentes fuentes que pueden ser usados para facilitar la clonación y expresión del gen en P. syringae y E. coli. Algunos de los plásmidos son pBBRlMCS2, pBBRlMCS3, pBBRlMCS4, pBBRl CS5 y pBBRlMCS8; pMEKml2; pME6031; pSL1211; pJRDlacI; pLAH30, pLAH31 y pLAH32. Kovach ME, et al., Gene 166: 175-176 (1995); Lu SE, et al., FE S Microbiol Lett 210: 115-121 (2002); Mellgren EM, et al., J Bacteriol 191:3132-3141 (2009); Ng O, et al., Arch Microbiol 173:412-417 (2000); Bertani I, et al, FEMS Microbiol Lett 179:101-106 (1999). Estos plásmidos albergan diferentes orígenes de replicación y diferentes marcadores antibióticos, permitiendo a los plásmidos múltiples ser transferidos simultáneamente en cepas de P. syringae y E. coli. Promotores de E. coli tales como los promotores trc, tac y lacuV5, son activos en cepas de P. syringae.

Par E. coli, los genes de biosíntesis del ácido coronámico y un gen de ACC oxidasa pueden ser insertados en un plásmido de manera que la expresión es controlada por promotores inducibles adecuados. Por ejemplo, pueden ser usados promotores cuya expresión es estrechamente controlada por azúcares tales como arabinosa. Una vez construido, el plásmido de expresión es introducido en un acepa adecuada de E. coli. Cepas que sobre producen isoleucina y valina se conocen y pueden ser usadas como recipientes de tal plásmido de expresión, para además incrementar la producción de buteno y/o propeno. Park, J.H., et al. (2007) Proc. Nati. Acad. Sci. 104: 7797-7802 y Hashiguchi, K. et al., (1999) Biosci. Biotechnol . Biochem. 63: 672-679.

En algunas modalidades, los genes de la biosintesis del ácido coronámico son expresados en un plásmido bajo el control de un promotor constitutivo y un gen de ACC oxidasa es expresado bajo el control de un promotor inducible. Una vez construido, el plásmido de expresión es introducido en una cepa adecuada de E. coli, y el ácido coronámico o ácido norcoronámico son convertidos en 1-buteno y propeno, respectivamente, cuando la ACC oxidasa es inducida. Genes para destoxificación de cianuro están incluidos como se describe anteriormente.

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae es otro organismo de chasis ampliamente usado en biología sintética, y también puede ser usado como la plataforma recombinante del microorganismo. Similares a E. coli y Pseudomonas, existen bibliotecas de mutantes, plásmidos, modelos de computadora detallados del metabolismo y otra información disponible para S. cerevisiae, que permiten el diseño rotacional de varios modelos para mejorar el rendimiento del producto. Se conocen métodos para hacer microorganismos recombinantes .

Los genes de biosintesis del ácido coronámico y un gen de ACC oxidasa pueden ser expresados en levadura usando cualquiera de un número de promotores conocidos. Genes para destoxificación de cianuro están incluidos como se describe anteriormente. Cepas que sobre producen treonina se conocen y pueden ser usadas para incrementar la cantidad de isoleucina disponible para producción de alqueno.

Synechocystis La Synechocystis 6803 puede ser usada como el chasis para un microorganismo recombinante.

La Synechocystis es una cianobacteria bien caracterizada y su genoma ha sido secuenciado. Puede utilizar una amplia variedad de fuentes de energía y carbono, incluyendo azúcares, CO2, y luz solar. Una gran colección de mutantes agénicos está disponible, junto con las series de datos transcriptómicos de nivel de genoma cianobacteriano más grande (más de 160 condiciones) y proteómicos (más de 35 condiciones) .

En el modo mixotrófico, la Synechocystis 6803 puede crecer a velocidades que exceden la suma de velocidades de crecimiento autotrófico y heterotrófico. Esto contrasta con muchos microbios capaces de crecimiento mixotrófico, donde proporcionar carbono fijo reduce fuertemente la fijación de C02. Esto hace a Synechocystis una especie adecuada para combinar fuentes de energía para la conversión de carbono fijo y C02 en alquenos. Además, la capacidad mixotrófica de Synechocystis puede permitir recapturar la pérdida de C02 durante la oxidación del ácido coronámico/ácido norcoronámico, reforzando su eficiencia de carbono sobre organismos heterotróficos .

Genes de la biosíntesis del ácido coronámico operablemente ligados a promotores adecuados, por ejemplo, el promotor lacUV5 controlable, y una ACC oxidasa operablemente ligada a un promotor constitutivo pueden ser introducidos en este microorganismo para permitir la producción de alqueno. Una ventaja de Synechocystis 6803 es que contiene genes endógenos que funcionan para degradar HCN a C02 y NH3. De este modo, genes de destoxificación de cianuro no son requeridos para estas especies. En algunas modalidades, genes que mejoran el reciclaje de C02 y NH3; tales como alanina deshidrogenasa o glutamato deshidrogenasa, pueden ser introducidos .

La Synechocystis 6803 puede ser modificada para sobre producción de isoleucina y/o valina. Véase, por ejemplo, Atsumi, S., Higashide, W., y Liao, J.C. (2009) Nat. Biotech. 27: 1177-8.

Otras cepas cianobacterianas con atributos funcionales importantes también pueden ser usadas como el chasis para un microorganismo recombinante . Por ejemplo, Synechococcus 7002 es una cianobacteria unicelular marina que tiene varias características únicas adecuadas para producción de alqueno. Esta cepa es una de las cianobacterias que crecen más rápido y tienen capacidad para tolerar altas intensidades de luz y, además del C02 y luz solar, puede utilizar glicerol para crecimiento. Su genoma ha sido secuenciado, y la manipulación genética que incluye modificación, inserción y supresión de gen es rutinariamente realizada.

Como se describe anteriormente para Synechocystis 6803, genes de la biosíntesis del ácido coronámico y una ACC oxidasa pueden ser introducidos en Synechococcus 7002 para permitir la producción de alqueno.

Rhodopseudomonas palustris Rhodopseudomonas palustris es una bacteria fotosintética capaz de crecer en la presencia o ausencia de oxígeno usando un número de sustratos. R. palustris posee la capacidad para utilización de H2. El genoma de R. palustris ha sido secuenciado, y el organismo es fácilmente transformable. Estos organismos pueden ser cultivados en medio mínimo suplementado con NaHCC y H2 en el espacio de cabeza, usando luz solar y una hidrogenasa de absorción para generar reductores y accionar la fijación de C02 vía el ciclo de Calvin. Rey, F.E., et al. (2006) J. Bacteriol. 188 ( 17 ): 6143-52. Por lo tanto, en algunas modalidades, este organismo puede ser usado para proporcionar "conversión ascendente" de energía eléctrica y C02 residual a combustibles líquidos.

Genes de la biosíntesis del ácido coronámico y un gen de ACC oxidasa, cada uno operablemente ligado a un promotor constitutivo, puede ser insertado en un plásmido disponible e introducido en R. palustris para permitir la producción de alqueno. La destoxificación de cianuro puede ser realizada usando genes descritos anteriormente para Pseudomonas y E. coli.

Methylococcus capsulatus Los microorganismos del género Methylococcus o Methylomonas, tales como Methylococcus capsulatus Bath y Methylomonas ethanica, pueden utilizar metano ya sea aeróbicamente o anaeróbicamente . Estos microorganismos pueden ser cultivados en medio de sales minerales de nitrato (NMS) suplementado con metano. Véase hittenbury & Dalton, The Prokaryotes . pp. 894-902 (1981) . Por ejemplo, el microorganismo puede ser cultivado a 42 °C en un medio en el cual una fuente de metano, por ejemplo, una relación 1:1 (v/v) de CH4/aire, está presente en el espacio de cabeza.

Methylococcus capsulatus Bath también puede fijar nitrógeno atmosférico de este modo eliminando el requerimiento de fuente de nitrógeno fija. Véase Murrel & Dalton (1983) J Gen Microbiol 129: 3481-3486. El microorganismo puede ser cultivado en la presencia o ausencia de cobre, por ejemplo, concentración final de 10 µ , el cual modula la actividad de las formas solubles contra insolubles de MMO. Regular la concentración de nitrógeno (nitrato o amoniaco) y cobre, se puede regular la actividad y funcionalidad de las enzimas involucradas en el metabolismo del metano. Los microorganismos de Methylomonas típicamente contienen un gen de nitrito dismutasa y lo expresan bajo condiciones anaeróbicas de manera que el nitrito es convertido a oxígeno y nitrógeno. El oxígeno así producido es utilizado por el microorganismo para oxidar metano a metanol vía monooxigenasa de metano (MMO) . Genes de la biosíntesis del ácido coronámico (por ejemplo, un agrupamiento de gen cma) y un gen de ACC oxidasa, cada uno operablemente ligado a un promotor constitutivo o inducible, puede ser introducido en tal microorganismo y de este modo permitir la producción de alqueno de los aminoácidos de cadena ramificada.

Se conocen sistemas de transformación para Methylococcus capsulatus Bath, por ejemplo, Stolyar et al., Microbiology, 1999: 145: 1235-1244. Los sistemas de expresión incluyen una serie de vectores de amplio rango de hospedero e integrativos que llevan promotores adecuados han sido mostrados por expresar satisfactoriamente genes de bacterias Gram-negativa en Methylococcus capsulatus Bath, véase Ali & Murrell, Microbiology, 2009: 155: 761-771 y pueden ser usados para expresar genes recombinantes, por ejemplo, genes de la biosintesis del ácido coronámico y un gen de ACC oxidasa.

En algunas modalidades, genes de destoxificación de cianuro descritos anteriormente para Pseudomonas y E. coli también son insertados en el microorganismo recombinante de Methylomonas . Típicamente, un microorganismo recombinante de Methylomonas también contiene genes para biosintesis de ascorbato, por ejemplo, genes que codifican GDP mañosa sintasa, GDP D-manosa epimerasa, GDP L-galactosa pirofosforilasa, L-galactosa deshidrogenasa , y L-galactonolactona deshidrogenasa. En algunas modalidades, genes para biosintesis de valina y/o isoleucina como se describe anteriormente también son introducidos.

Métodos de Producción de Alquenos Microorganismos recombinantes descritos en la presente pueden ser usados en un método para producir alquenos tales como 1-buteno y propeno. El método incluye hacer crecer el microorganismo recombinante en un medio de cultivo bajo condiciones en las cuales genes de la biosintesis del ácido coronámico y un gen de ACC oxidasa son expresados. Dependiendo del microorganismo particular usado en el método, otros genes recombinantes tales como genes de ruta de destoxificación de cianuro también pueden estar presentes y son expresados. La cantidad de alqueno producido durante el crecimiento en cultivo puede ser monitoreada si se desea, extrayendo gas del espacio de cabeza de los cultivos y analizar las muestras vía GC-MS, de conformidad con los métodos publicados. Zhang et al. Biochem J 307:77-85 (1995) . Niveles de sustratos e intermediarios, por ejemplo, ácido coronámico, ácido norcoronámico, isoleucina y valina, pueden ser determinados extrayendo muestras de medio de cultivo para análisis vía TLC y HPLC de conformidad con métodos publicados. Ullrich, M. and Bender, C.L. (1994) J. Bacteriol. 176: 7574-7586.

Después que el microorganismo recombinante se ha hecho crecer en el cultivo por el periodo deseado de tiempo, el 1-buteno y/o propeno pueden entonces ser recuperados del fermentador usando varios métodos conocidos en la técnica. El buteno y propeno tienen baja solubilidad en agua, alta presión de vapor y fácilmente volatilizan del medio de cultivo. Por consiguiente, el buteno o propeno pueden ser recolectados como un volátil de los componentes gaseosos en el fermentador. Los separadores de membrana pueden ser usados para recuperar alquenos de otros componentes gaseosos. Puesto que el buteno y propeno condensa a presión relativamente baja (36.16 kg/cm2 (~500 psi) ) , pueden ser licuados de la corriente de gas voluminosa del termentador y de este modo separados del resto de los componentes gaseosos. La producción de alquenos tal como 1-buteno y propeno por microorganismos recombinantes como se describe en la presente evita algunos de los métodos de energía intensiva, costosos, para producir buteno y propeno.

Los alquenos de cadena lineal y ramificada producidos por los microorganismos recombinantes descritos en la presente, que contienen uno o más enlaces dobles, tienen utilidad significante en vista de la funcionalidad proporcionada por tales enlaces. El 1-buteno o propeno obtenido por los métodos descritos en la presente pueden entonces ser sometidos a varios tipos de reacciones catalíticas para formar combustibles líquidos tales como alquenos y alcoholes. Por ejemplo, el buteno puede ser oligomerizado para producir octano, dodeceno, o hexadeceno. El buteno también puede ser usado para hacer materiales e intermediarios químicos tales como mezclas de polibutileno, polietileno y propileno, butadieno o caucho de butilo.

Se apreciará que los varios genes y módulos discutidos aquí pueden estar presentes en dos o más microorganismos recombinantes en lugar de un microorganismo único. Cuando se usa una pluralidad de microorganismos recombinantes, pueden hacerse crecer en un cultivo mezclado para producir alquenos. Por ejemplo, un primer microorganismo puede comprender uno o más genes de la biosintesis del ácido coronámico mientras un segundo microorganismo comprende un gen que codifica una ACC oxidasa, un gen que codifica una ß-cianoalanina sintasa, y un gen que codifica una nitrilasa. Alternativamente, los dos o más microorganismos se hacen crecer cada uno en un medio de cultivo separado y el producto del primer medio de cultivo, por ejemplo, ácido coronámico, se introduce en el segundo medio de cultivo para ser convertido en un intermediario subsecuente, o en el producto alqueno final. En otro ejemplo, un primer organismo puede ser un microorganismo especializado que utiliza uno o más sustratos tales como C02, CH4, H2 y excreta azúcar o moléculas de carbono reducidas. El azúcar excretada o moléculas de carbono reducidas son entonces utilizadas por el segundo microorganismo recombinante para producir 1-buteno y/o propeno.

Cuando el metano, ¾ u otros compuestos de sustrato volátil son usados como parte de las condiciones de cultivo, el microorganismo recombinante se hace crecer en un medio de cultivo bajo condiciones en las cuales genes de la biosíntesis del ácido coronámico y un gen de ACC oxidasa son expresados, y el (los) sustrato (s) volátil (es) se introducen en el cultivo, típicamente burbujeando en el medio líquido. El (los) producto (s) alqueno, por ejemplo, 1-buteno y/o propeno, pueden ser recuperados del espacio de cabeza como un volátil a través del uso de una serie de tamices moleculares u otros métodos conocidos en la técnica para fraccionar buteno y/o propeno en. alta pureza del gas. Estos métodos de separación permiten la separación de los productos alqueno de componentes volátiles del medio de cultivo.

La invención será además descrita en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos Ejemplo 1 - Cepas de Pseudomonas P. syringae pv. tomato DC3000 se describe en Cuppels, Appl. Environ. Microbiol. 52: 323-327 (1986). La cepa DC3000 es una cepa patogénica de tipo nativo, designada en la presente como MGC0001. Además de la cepa de tipo nativo GC0001, se usó la cepa mutante DC3000 DB4G3, la cual contiene una inserción Tn5 en el sitio cfa6. Brooks et al., Mol. Plant Microbe Inter. 17: 162-174 (2004). La DB4G3 es deficiente en la biosíntesis de ácido coronafácico y coronatina, y acumula los aminoácidos cíclicos. La cepa DB4G3 es designada aquí como GC0003.

Otras cepas mutantes de P. syringae pv. tomato DC3000 incluyen AK6F3 y AK7E2. Brooks et al., supra. La AK6F3 contiene una inserción Tn5 inmediatamente corriente arriba del codón de inicio por el primer ORF en el agrupamiento del gen biosintético CMA, y produce pequeñas cantidades de ácido coronafácico y niveles indetectables de coronatina. La AK7E2 contiene una inserción Tn5 en el gen cmaA, y produce pequeñas cantidades de coronatina y ligeramente cantidades superiores de ácido coronafácico. La AK6F3 es designada aquí como MGC0005 y AK7E2 es designada aqui como GC0006.

P. syringae pv. glycinea PG4180 es descrita en Bender et al., Gene 133 :31-38 (1993). La cepa PG4180 es una cepa patogénica de tipo nativo, diseñada aqui como MGC0002. Además de la cepa de tipo nativa MGC0002, se utilizó la cepa mutante Al PG4180. La cepa Al contiene una inserción Tn5 en el gen cfa6, y es deficiente en la biosintesis del ácido coronafácico y coronatina. Rangaswamy et al., Proc Nati Acad Sci USA 95: 15469-15474 (1998). Las cepas de Pseudomonas se listan en la Tabla 1.

Tabla 1.

Cepas de Pseudomonas Ejemplo 2 - Microorganismos que expresan Oxidasa ACC de Codón Optimizado Un gen de ACC oxidasa de tomate fue optimizado de codón para expresión en P. syringae pv. tomato DC3000, y sintetizado a ADN 2.0 (Menlo Park, CA USA). El gen optimizado mostró 74% de identidad al nivel de nucleótido con el gen de ACC oxidasa nativo. Un alineamiento de las secuencias de nucleótido optimizadas de codón y nativas se muestra en la Figura 2. Dos sitios de restricción (Ndel y Kpnal) en cualquier extremo del gen se diseñaron por ingeniería para facilitar la clonación.

Para expresión en cepas de P. syringae, el gen optimizado fue primero clonado detrás de un promotor lacUV5. El fragmento del gen promotor completo fue entonces clonado en el plásmido de rango amplio del hospedero pBBR.lM.CS5 para generar un plásmido designado pBBRlMCS5_ACC0. El pBBRlMCS5_ACCO se transfirió en cepas de Pseudomonas por electroporación. Para expresar ACC oxidasa en E. coli, el gen de ACC oxidasa optimizado se clonó en el vector pCGLADuet y expresó en células BL21(DE3).

Cultivos de una noche de cepas de MGC0007 y E. coli que portan los plásmidos recombinantes con el gen de ACC oxidasa optimizado se diluyeron en medio LB fresco (1% den p/v de Bacto-triptona, 0.5% en p/v de extracto de levadura Bacto y 1% en p/v de NaCl a pH 7.5) para E. coli y medio YG fresco (0.5% en p/v de Bacto-triptona, 0.3% en p/v de extracto de levadura Bacto y 2% en v/v de glicerol, pH 7.0) para Pseudomonas, y se hicieron crecer a la temperatura indicada. La expresión de ACC oxidasa en E. coli se indujo durante el crecimiento de fase log por la adición de lmM de IPTG e incubación por 30 min. La expresión de ACC oxidasa en MGC0007 se midió en células en la fase log de crecimiento (aproximadamente 2.5 horas después de la inoculación con un cultivo de una noche) . Los extractos celulares totales se prepararon de las células inducidas y fraccionaron por 12% de electroforesis en gel de proteina como se describe por Zhang Z et al., Biochem J 307:77-85 (1995).

La actividad de ACC oxidasa se midió en los extractos celulares fraccionados como se describe por Zhang et al. Las mezclas de reacción que incluyen extractos celulares recientemente preparados y ACC como sustrato se transfirieron a una botella de suero cerrada con aire. Después de la incubación por 15 min a 30°C, 200 µ? del espacio de cabeza se retiraron con una jeringa y analizaron por cromatografía de gas (Agilent) . Los resultados mostraron que el etileno se produjo después de la expresión de la ACC oxidasa de codón optimizada en Pseudomonas .

El método in vitro de Zhang et al, se modificó para medir la producción de etileno en células intactas de E. coli y P. syringae, incrementando la concentración de ascorbato y NAHCO3 a 15 mM y removiendo el amortiguador de MOPS. La cantidad de etileno producido por células intactas se evaluó por comparación con una curva estándar generada de etileno comercialmente disponible. Los resultados muestran que la producción de etileno en E. coli y P. syringae fue 1.14 y 0.08 nmoles/ml de célula/min, respectivamente, cuando crece a 30°C.

Los resultados in vivo e in vitro establecen que el gen ACC oxidasa de tomate de codón optimizado puede ser expresado y es funcional en P. syringae y E. coli.

Ejemplo 3 - Producción de Propeno y Buteno por P. syringae Microorganismos recombinantes que expresan la ACC oxidasa de codón optimizada del Ejemplo 2 se construyeron en cepas mutantes y de tipo nativas de P. syringae pv. tomato DC3000 y P. syringae pv. glycinea PG4180. Específicamente, cepas MGC0001, MGC0002, MGC0003 y MGC0004 se transformaron con pBBRlMCS5_ACCO para generar cepas MGC0007, MGC0008, MGC0009 y MGC0010, respectivamente. Véase, Tabla 1.

Las cepas se sometieron a ensayo para determinar la producción de propeno y buteno por células intactas en cultivo. Los resultados iniciales indican que la síntesis de propeno y buteno fue inferior cuando las cepas se hicieron crecer en medio que contiene extracto de levadura, peptona bacteriana y glicerol, comparado con la síntesis de propeno y buteno cuando las cepas se hicieron crecer en medio de HSC. Por lo tanto, todos los experimentos subsecuentes se realizaron en células que crecen en medio HSC. El medio HSC se describe en Palmer et al., Appl Environ Microbiol 1993, 59: 1619-1526.

La síntesis de propeno y buteno por células intactas de cepas de Pseudomonas MGC0007, MGC0008, MGC0009 y MGC0010 se midió en células que crecen en medio HSC a 18°C y 30°C. La Figura 3 es un rastro representativo de un cromatograma de gas de productos volátiles en el espacio de cabeza de cultivos de células intactas. Como se muestra en la Tabla 2, los resultados indican que las cantidades de tanto propeno como buteno producidas fueron mayores cuando las cepas se hicieron crecer a 18°C con relación a las cantidades cuando se hicieron crecer a 30°C. En efecto, ni propeno ni buteno pudieron ser detectados cuando la cepa MGC0008 se hizo crecer a 30°C. Los resultados también indican que las cantidades de propeno y buteno producidas bajo estas condiciones fueron mayores en cepas MGC0009 y GC0010 que en cepas GC007 y MGC008. Estos resultados sugieren que las cepas MGC0008 y MGC0010 acumulan cantidades mayores de CMA y nCMA que las MGC007 y MGC008.

Tabla 2 Producción de Propeno y Buteno por Cepas de Pseudomonas Ejemplo 4 - Expresión de un agrupamiento de gen cma en microorganismos El ADN genómico de P. syringae pv. tomato DC3000 se aisló con un kit de aislamiento de ADN genómico y se usó como plantilla para amplificación por PCR de agrupamientos de gen cma. Los cebadores PCR se diseñaron para amplificar los agrupamientos cmaD-C y cmaT-U y las secuencias de nucleótido de los cebadores se muestra en la Tabla 3. Los sitios de restricción (subrayados) se introdujeron en los cebadores para facilitar la clonación en los vectores de expresión.

Tabla 3.

Cebadores para Amplificación de Agrupamientos del Gen cma Los productos amplificados de cada agrupamiento de gen son clonados en plásmidos de expresión inducible para E. coii, Synechocystis y levadura. El nivel de expresión de las proteínas CMA se determina para cada una de las especies bajo condiciones en las cuales se induce la expresión del plásmido .

Ejemplo 5 - Supresión del Agrupamiento de Gen hrp en P. syringae El plásmido pRK415 se usó para construir cepas mutantes derivadas de P. syringae pv. tomato DC3000. El plásmido pRK415 es descrito en Alfano JR, et al., Proc Nati Acad Sci USA 2000, 97:4856-4861. El agrupamiento del gen hrp es suprimido en MGC0009 usando recombinación homologa doble con pRK415 en la siguiente manera. Fragmentos de ADN de aproximadamente 2 kb de longitud de tanto las regiones corriente arriba como corriente abajo de los agrupamientos del gen hrp se amplificaron por PCR. Se introdujo un cásete antibiótico entre los dos agrupamientos para facilitar la selección de cepas que llevan ambos agrupamientos. El plásmido recientemente creado entonces se introdujo en MGC0009 por electroporación y las colonias que crecen en la presencia de antibiótico son seleccionadas y confirmadas para la supresión del agrupamiento del gen hrp. Penaloza-Vazquez A, et al., Microbiology 146:2447-2456 (2000).

La cepa de supresión hrp, cfa6 resultante, se transformó con un plásmido que lleva los siguientes genes recombinantes : un gen que codifica una acetohitroxiácido sintasa II insensible a inhibición de retroalimentación por valina, un gen que codifica una acetohidroxiácido reductoisomerasa, un gen que codifica una dihidroxiácido deshidratasa y un gen que codifica a transaminasa-B . La cepa resultante se hace crecer en medio HSC a 30° C y la cantidad de valina sintetizada es medida a diferentes periodos de tiempo. Como controles, la cantidad de valina producida es comparada con la cantidad sintetizada por MG0009 y MGOOOl.

La cepa de supresión hrp, cfa6 resultante es también transformada con un plásmido que lleva los siguientes genes resultantes: un gen que codifica una aspartato cinasa insensible a retroalimentación, un gen que codifica a treonina desaminasa resistente a inhibición de retroalimentación por isoleucina, un gen que codifica una acetohitroxiácido sintasa II insensible a inhibición de retroalimentación por isoleucina, un gen que codifica una acetohidroxiácido reductoisomerasa, un gen que codifica una dihidroxiácido deshidratasa y un gen que codifica a transaminasa-B . La cepa resultante se hace crecer en medio HSC a 30° C y la cantidad de isoleucina sintetizada se mide de diferentes periodos de tiempo. Como controles, la cantidad de valina producida se compara con la cantidad sintetizada por MG0009 y MG0001.

OTRAS MODALIDADES Se ha descrito un número de modalidades de la invención. Sin embargo, se entenderá que varias modificaciones se pueden hacer sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, la cual se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones .

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo recombinante, caracterizado porque comprende a) uno o más genes de la biosintesis del ácido coronámico, cuya expresión resulta en la producción de ácido coronámico y/o norcoronáraíco; y b) un gen que codifica una ACC oxidasa, en donde al menos uno de los genes es un gen recombinante .

2. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende un gen que codifica una ß-cianoalanina sintasa y un gen que codifica una nitrilasa.

3. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno o más genes de la biosintesis del ácido coronámico son una isomerasa de L-isoleucina o L-valina y una sintasa de ácido coronámico.

4. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el microorganismo además comprende un gen que codifica una alanina deshidrogenase o un gen que codifica una glutamato deshidrogenasa .

5. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo es del género Pseudomonas .

6. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el microorganismo además comprende un gen recombinante que inhibe la producción de ácido coronafácico, o una mutación nula en un gen de la ruta del ácido coronafácico .

7. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el microorganismo además comprende un gen que codifica una serina O-acetil transferasa.

8. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el microorganismo además comprende genes que codifican GDP mañosa sintasa, GDP D mañosa epimerasa, GDP L galactosa pirofosforilasa, L-galactosa deshidrogenasa y L-galanolactona deshidrogenasa .

9. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el microorganismo además comprende un gen que codifica una treonma deshidratasa o un gen que codifica una homoserina deshidratasa .

10. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el microorganismo además comprende un gen que codifica una sintasa de acetohidroxiácido resistente a retroalimentación.

11. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el microorganismo además comprende un gen que codifica a treonina desaminasa, un gen que codifica una citramalato sintasa, o un gen que codifica una isopropil malato deshidrogenasa

12. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el microorganismo es una bacteria.

13. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo es un eucariota.

14. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el eucariota es una levadura.

15. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el eucariota es un organismo fotosintético .

16. El microorganismo recombinante de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque el microorganismo es una cepa de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Synechocystis 6803, Synechococcus 7002, Methylococcus capsulatus, Methylomonas methanica , o Rhodopseudomonas palustris .

17. Un método para producir 1-buteno o propeno, caracterizado porque comprende las etapas de: a) hacer crecer el microorganismo recombinante de la reivindicación 1 en un medio de cultivo, bajo condiciones en las cuales los genes de la biosintesis del ácido coronámico y el gen ACC oxidasa son expresados; y b) recuperar el 1-buteno o propeno producido por dicho microorganismo.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el 1-buteno o propeno es recuperado como un producto volátil de componentes gaseosos en el fermentado .

19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el microorganismo es del género Pseudomonas y el medio de cultivo comprende un inhibidor de la biosintesis del ácido coronafácico .

20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el medio de cultivo comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste de glicerol, glucosa, xilosa, C02, H2 y CH4.