CN102083990B - 通过3-羟基烷酸的酶促脱羧制备烯 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过生物学生成烯的方法。其更具体的涉及通过3-羟基烷酸分子的酶促脱羧制备末端烯的方法。本发明还涉及酶系统和使用的微生物菌株，以及得到的产物。

Description

通过3-羟基烷酸的酶促脱羧制备烯
简介
本发明涉及经生物学过程生成烯的方法。更具体的，本发明涉及从3-羟基烷酸型分子制备末端烯(特别是丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯或异戊烯)的方法。
发明背景
目前许多化学化合物来源于石油化学产品。烯(例如乙烯、丙烯、不同的丁烯或戊烯)应用于塑料工业(例如生产聚丙烯或聚乙烯)及化工和燃料的其他领域。
最简单的烯即乙烯处于工业有机化学的核心：它是世界上生产最广泛的有机化合物。特别是用于生产聚乙烯，一种主要的塑料。乙烯可通过(氧化、卤化)反应转化为许多工业上有用的产品。
丙烯具有类似的重要作用：它的聚合产生塑料材料聚丙烯。此产品在抗力、密度、坚固性、可变形性和透明度方面的技术特性是无以伦比的。从1954年被发明之后，世界范围的聚丙烯市场就持续发展。
丁烯以4种形式存在，其中之一异丁烯是甲基叔丁基醚(MTBE)的组成部分，MTBE是汽车燃料的抗爆添加剂。异丁烯还可用于生产异辛烯，其之后可被还原为异辛烷(2，2，4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高燃烧/爆炸比率使其成为用于所谓“汽油”发动机的最佳燃料。
戊烯、己烯和庚烯根据双键的位置和构型以多种形式存在。这些产品有实际的工业应用，但没有乙烯、丙烯或丁烯重要。
目前所有这些烯通过石油产品的催化裂解制备(或从煤或汽油中通过Fisher-Tropsch法的衍生物制备，例如己烯)。因此其成本天然的根据石油价格调整。此外，催化裂解有时伴随相当的技术困难，从而提高过程复杂性和生产成本。
除了以上考虑之外，塑料的生物制备是正在繁荣的领域。石油价格相关的经济担忧和全球(碳中和(carbon-neutral)产品)和地方性(废物管理)二者的环境考虑驱动了生物制备的迅速发展。
生物塑料的主要家族是聚羟基烷酸酯(PHA)。这些聚合物由同时包含酸基和醇基的分子缩合得到。缩合通过酸对下一个单体的醇的酯化反应进行。这种酯键没有在传统塑料聚合物中存在的直接碳-碳键稳定，这解释了为什么PHA具有几周至几个月的生物可降解性。
PHA家族具体包括聚3-羟基丁酸酯(PHB)，3-羟基丁酸酯的聚合物和聚羟基丁酸戊酯(PHBV)，3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的交替聚合物。
PHB由几种细菌菌株例如富养产碱菌(Alcaligeneseutrophus)和巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)天然生成。已经构建了大体上整合了导向PHB或PBA的合成途径的实验室细菌，例如大肠杆菌。该化合物或其聚合物在一些实验室条件下可占细菌重量的高达80％(WongMS等人，Biotech.Bioeng.，2008)。在20世纪80年代尝试了PHB的工业规模生产，但当时认为通过发酵制备该化合物的成本太高。在遗传修饰的植物(整合了在生产者细菌中存在的PHB合成途径的关键酶)中有关这些化合物的直接制备的项目正在进行并可能只需要较低的经营成本。
在与地球化学循环协调的可持续发展工业经营的大环境下，需要通过生物途径生产可用于燃料或合成树脂前体的烷或其他有机分子。第一代生物燃料以乙醇的发酵生产为主，因为发酵和蒸馏过程已经存在于食品加工工业。第二代生物燃料的生产正处于探索期，具体包含长链醇(丁醇和戊醇)、萜、线性烷和脂肪酸的生产。最近的2篇综述提供了此领域研究的一般概述：LadyginaN等人，ProcessBiochemistry，2006，41：1001；和WackettLP，CurrentOpinionsinChemicalBiology，2008，21：187。
在烯的化学家族中，异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是在聚合中生成橡胶的萜基序。其他萜可能通过化学、生物或混合途径生成，作为可用产品例如生物燃料或用于制造塑料。最近的文献显示甲羟戊酸途径(在很多生物的类固醇生物合成中的关键中间体)可能用于从萜家族以工业产量有效的生产产品(WithersST等人，Appl.Environ.Microbiol.，2007，73：6277)。
末端烯[2位是单或双取代的乙烯：H2C＝C(R1)(R2)]的生产明显研究的较少。在小红酵母(Rhodotorulaminuta)中检测到从异戊酸到异丁烯的产生(FujiiT.等人，Appl.Environ.Microbiol.，1988，54：583)，但此转化的效率低于每分钟百万分之一或约每天一千分之一，远远达不到工业应用。FukudaH.等人(BBRC，1994，201(2)：516)阐明了反应机制，其中涉及细胞色素P450酶，其通过还原氧合铁(oxoferryl)基FeV＝O对异戊酸脱羧。反应中不涉及异戊酸的羟基化。异戊酸也是亮氨酸分解代谢中的中间体。通过此途径大规模生物合成异丁烯似乎非常不合适，因为其需要合成和降解1分子亮氨酸以形成1分子异丁烯。并且，催化反应的酶使用血红素作为辅助因子，不适合在细菌中重组表达和改进酶参数。由于所有这些原因，在现有技术下此途径似乎非常不可能作为工业开发的基础。能够少量的从异戊酸天然产生异丁烯的其他微生物也有描述，但是得到的产量甚至比小红酵母的产量更低(FukudaH.等人，Agric.Biol.Chem.，1984，48：1679)。
这些相同的研究也描述了丙烯的天然产生：很多微生物能够产生丙烯，但产量仍然极低。
早就知道植物可以产生乙烯(Meigh等人，1960，Nature，186：902)。根据已阐明的代谢途径，甲硫氨酸是乙烯的前体(Adams和Yang，PNAS，1979，76：170)。2-酮戊二酸的转化也有描述(LadyginaN.等人，ProcessBiochemistry2006，41：1001)。因为单独的乙烯分子需要之前产生的4-或5-碳链，所有这些途径所需要的设备和能量是不合适的，不利于其用于生物生产烯的工业应用。
在鉴定出植物中乙烯的真实代谢前体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)通过形成1-氨基环丙烷-1羧化物(ACC)(Adams和Yang，PNAS，1979，76：170)转化为乙烯的酶步骤之前，在科学文献中曾提出其他几种假说解释乙烯的产生，其中包括3-羟基丙酸脱水产生的丙烯酸(H2C＝CH-CO2H)的脱羧。一些文章具体推测了经丙烯酸从3-羟基丙酸转化为乙烯的代谢途径，以解释乙烯产生的放射性示踪剂研究，其中在植物组织制备物中应用14C标记的底物：大豆子叶提取物中应用β-丙氨酸-2-14C(Stinson和Spencer，PlantPhysiol.，1969，44：1217；Thompson和Spencer，Nature，1966，210：5036)，和香蕉果肉匀浆中应用丙酸-2-14C(Shimokawa和Kasai，Agr.Biol.Chem.，1970，34(11)：1640)。所有这些假说在代谢的乙烯产生中涉及3-羟基丙酸和丙烯酸，而没有鉴定酶活性，在发现甲硫氨酸、SAM和ACC后(Hanson和Kende，PlantPhysiology，1976，57：528；Adams和Yang，PNAS，1979，76：170)，这些假说就从科学文献中消失了。
因此，就我所知，目前没有通过微生物合成生产末端烯例如乙烯、丙烯、1-丁烯、异丁烯、1-戊烯或异戊烯的有效方法。这些方法可能避免使用石油产品并降低生产塑料和燃料的成本。最后，这些方法能够将碳以固体形式贮存，可能具有可观的全球环境影响。
发明概述
本发明描述了经生物过程进行烯化合物合成的方法。
本发明基于末端烯化合物的新型合成途径的设计，所述途径基于3-羟基烷酸的转化。本发明还基于对所述转化可以以生物方式进行的证明，通过使用脱羧酶类型的酶或其变体。本发明可在无细胞系统中体外实现，或通过使用微生物实现。本发明还涉及从碳源中制备烯，所述碳源特别为碳水化合物(特别是葡萄糖)、多元醇(特别是甘油)、可生物降解的聚合物(特别是淀粉、纤维素、聚-3-羟基烷酸)；碳源由微生物转化为属于3-羟基烷酸家族的代谢中间物，之后再转化为末端烯。
更具体的，本发明的目的是提供制备末端烯的方法，其特征在于所述方法包含以下步骤：在具有脱羧酶活性的酶的存在下转化3-羟基烷酸。
本发明的另一个目的是基于3-羟基烷酸化合物作为前体或底物用于制备末端烯化合物的用途。
在本发明具体的实施方案中：
-3-羟基丙酸转化为乙烯；或
-3-羟基丁酸转化为丙烯；或
-3-羟基戊酸转化为1-丁烯；或
-3-羟基3-甲基丁酸(或3-羟基异戊酸)转化为异丁烯；或
-3-羟基3-甲基戊酸转化为异戊烯。
本发明还涉及脱羧酶或产生脱羧酶的微生物在从3-羟基烷酸制备末端烯化合物中的用途。
本发明还涉及组合物，其包含产生脱羧酶的微生物、合适的培养基和3-羟基烷酸化合物或可由微生物转化为3-羟基烷酸化合物的碳源。
本发明的另一个目的涉及生物催化剂，其包含将3-羟基烷酸化合物脱羧为末端烯的脱羧酶或制备脱羧酶的微生物。
本发明的另一个目的涉及由如本发明描述的方法得到的末端烯化合物。
本发明的另一个目的是分离的或纯化的具有脱羧酶活性并包含SEQIDNO：6的全部或部分的酶，或与其具有至少15％序列同源性的酶。
本发明的另一个目的涉及具有脱羧酶活性并包含SEQIDNO：6的全部或部分的酶，或与其具有至少15％序列同源性的酶在制备末端烯中的用途。
本发明的另一个目的涉及制备具有脱羧酶活性并包含SEQIDNO：6的全部或部分的酶或与其具有至少15％序列同源性的酶的方法，所述方法包含在允许表达所述序列的条件下培养包含编码所述序列的重组核酸的微生物。
本发明的另一个目的涉及微生物，其包含编码具有脱羧酶活性并包含SEQIDNO：6的全部或部分的酶或与其具有至少15％序列同源性的酶的重组核酸。
定义
如此处使用的，“3-羟基烷酸”表示包含3-羟基丙酸作为共同基序的任意分子(图1)，任选的在3位碳上有1或2个烷基取代。所述烷基残基或基团可为线性的或分支的。如此处使用的，术语“烷基(alkoyl)”和“烷基(alkyl)”具有相同的意思并可互换。类似的，术语“残基”和“基团”具有相同的意思并可互换。甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基是所述烷基的示例。如果2个烷基取代不同则3位碳变为手性中心。本定义包含2种手性形式，甚至当2种形式中的一种，例如R型，为天然产生的主要形式时亦如此。3-羟基烷酸的示例见图3。任选的，烷基取代可加在2位碳上，其之后也可能变为手性的(如果2个取代不同)。相同的，本发明中3-羟基烷酸底物的构型包含所有的立体异构体。在优选的方式中，3-羟基烷酸对应3-羟基丙酸或3-羟基丙酸的变体或衍生物，其中3位碳上的2个氢原子之一或2个氢原子由仅由碳和氢原子组成的基序取代，所述取代基的碳原子数范围从1至5，优选的从1至3，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或异丁基。如此处使用的，词尾“酸(oate)”可互换的表示羧酸离子(COO-)或羧酸(COOH)。其不用于表示酯。在具体的实施方案中，3-羟基烷酸用以下通式表示：HO-CO-CH2-C(R1)(R2)-OH或O--CO-CH2-C(R1)(R2)-OH。
根据本发明，“末端烯”表示仅由碳和氢(具有通式CnH2n的不饱和碳氢化合物)组成的分子，其包含乙烯和乙烯衍生的有机分子，后者通过结合在2位碳上的2个氢原子由线性或分支的烷基单或双取代。末端烯优选的由通式H2C＝C(R1)(R2)表示，其中R1和R2独立的选自氢原子和线性或分支的烷基，所述烷基优选的具有1至4个碳原子，更优选的选自1至3个碳原子。优选的，烯的2位碳上的2个取代基中的至少1个为线性或分支的烷基。末端烯包含分支的异烯化合物，例如异丁烯。根据本发明的末端烯化合物的优选示例具体为乙烯、丙烯、异丁烯和异戊烯(图4)，或1-丁烯和1-戊烯。
如此处使用的，“碳源”表示可用于根据本发明生物的底物的任意碳化合物。所述术语包括葡萄糖或任意其他己醣、木糖或任意其他戊糖，多元醇例如甘油、山梨醇或甘露醇，或聚合物例如淀粉、纤维素或半纤维素，或聚3-羟基烷酸例如聚3-羟基丁酸。其可为允许微生物生长的任意底物，例如甲酸。其也可为CO2，如果该生物能够进行光合作用。
如此处使用的，“重组”表示生物的人工遗传修饰，通过对染色体或染色体外基因或调控基序例如启动子的添加、去除或修饰，或通过生物的融合，或通过添加任意类型的载体，例如质粒。术语“重组表达”表示涉及基因修饰的蛋白质的产生，优选的为了制备对其宿主而言外源或异源的蛋白质，即所述蛋白质不天然存在于制备宿主中，或为了制备修饰的或突变的内源蛋白质。
如此处使用的，“过表达(overexpression)”或“过表达(overexpressing)”表示蛋白质的重组表达与所述蛋白质的天然表达相比提高至少10％，优选的20％，50％，100％，500％和可能更多，优选的所述蛋白质所来源的微生物和表达其的微生物不同。此定义也包含不存在所述蛋白质的天然表达的情况。
“辅被用物(co-substrate)”是添加至酶反应的产物，用于改进其特定参数，最重要的是改进其活性，所述产物和主要底物以相同量消耗。因此辅被用物必须以和主要底物相当的浓度加入反应。取决于酶，辅被用物的存在可能是酶反应所需要的。
“辅助因子”是添加至酶反应的产物，用于改进其特定参数，最重要的是改进其活性，所述产物在反应中不消耗，因此仅需要以与酶的量成比例的低浓度加入，所述浓度因此被称为“催化(浓度)”。
氨基酸序列的“部分”表示包含至少10，优选的至少20，30，40或50连续的所述序列氨基酸残基的片段。
“同源性”表示2条序列之间存在的相似性，通过所述2条序列的百分比同一性测量。
化合物经常以几种名字为人所知，正式的或普通的。这里，优选分子的普通名。因此：
-“乙烯(ethylene)”用于表示乙烯(ethene)
-“丙烯(propylene)”用于表示丙烯(propene)
-“丁烯(butylene)”用于表示丁烯(butene)
-“异丁烯(isobutylene)”用于表示2-甲基丙烯或异丁烯(isobutene)
-“戊烯(amylene)”用于表示戊烯(pentene)
-“异戊烯(isoamylene)”用于表示2-甲基丁烯或异戊烯(isopentene)
-“丙酸(propionate)”用于表示丙酸(propanoicacid)或丙酸离子
-“丁酸(butyrate)”用于表示丁酸(butanoicacid)或丁酸离子
-“戊酸(valerate)”用于表示戊酸(pentanoicacid)或戊酸离子。
发明详述
具体来说，本发明提供了制备末端烯的方法，其包含3-羟基烷酸化合物的酶促脱羧步骤。本发明还涉及催化此反应的脱羧酶，具体的是甲羟戊酸二磷酸脱羧酶类型的酶，和底物例如3-羟基丁酸、3-羟基戊酸、3-羟基-3-甲基丁酸(或3-羟基异戊酸)和3-羟基丙酸的用途。本发明描述了辅助因子的用途，所述辅助因子包括乙基二磷酸、丙基二磷酸、甲基二磷酸、所述分子的类似物和焦磷酸。本发明还描述了辅被用物的用途，例如ATP或其他包含磷酸酐键的化合物。
本发明还涉及碳源，例如葡萄糖，在从全细胞中通过3-羟基烷酸进行的合成途径直接制备末端烯的用途。
本发明还涉及天然或修饰的生物，其内源产生3-羟基烷酸并也表达将所述3-羟基烷酸转化为末端烯的脱羧酶。
所制备的烯化合物，特别是丙烯、乙烯和异丁烯，是塑料和燃料工业中的关键分子，其通过生物途径从可再生资源中的工业制备代表了重大创新。
因此本发明是根据末端烯类型化合物的新型合成途径的设计得到，所述途径基于3-羟基烷酸类型化合物的转化。本发明证明所述转化可通过生物学进行，通过使用脱羧酶类型的酶，所述酶可将3-羟基烷酸转化为末端烯。如图2中所示，所述转化通过具有3-磷酸-羟基烷酸结构的反应中间体进行。
根据本发明的转化步骤可在分离的酶(或另外包含一种或多种辅助因子的酶系统)存在下在体外进行，或在产生酶的微生物存在下在培养物中进行。
如在此处的实施例5中所描述的，在一些条件下可观察到转化产量的约100倍的信噪比(在不存在酶时测量)。测量了对3-羟基异戊酸(HIV)的亲和力为约40mM。目前尚不清楚这样显著的酶活性是如何得到的：事实上，熟悉酶学理论和实践的生化学家清楚地知道，酶活性位点包含可识别、结合和化学转化一些特异性底物的结构元件。科学文献和实验数据指示，大小或电荷的改变，甚至微小改变可导致底物的排斥。具体来说，没有科学预测可以预料到MDP脱羧酶可使用3-羟基烷酸型的一般分子特别是3-羟基异戊酸作为底物，后者与甲羟戊酸二磷酸的差别不仅在大小上(分子量118，甲羟戊酸二磷酸为308)，而且在天然底物甲羟戊酸二磷酸中存在的二磷酸基团的电荷上。
在一个具体的实施方案中，在反应中加入辅助因子以在催化裂缝中提供空间或电子互补。辅助因子有利地选自焦磷酸离子、甲基二磷酸、乙基二磷酸或丙基二磷酸。更一般的，辅助因子是包含磷酸酐基序的化合物，其具有通式R-O-PO2H-O-PO3H2，其中R具体代表氢原子，线性、分支或环状的烷基，优选的具有从1至10或从1至5个碳原子，或任意其他单价有机基团。本发明也包括对应亚甲基二磷酸单酯的类似基序，由通式R-O-PO2H-CH2-PO3H2代表，其中磷酸酐由亚甲基桥替换，其优势在于不被水解。
在优选的实施方案中，转化在辅被用物存在下进行，所述辅被用物优选的为包含磷酸酐的化合物，优选的为ATP、rNTP、NTP或几种这些分子的混合物、多磷酸或焦磷酸。辅被用物一般存在于宿主中。然而，在另一个具体的实施方案中，可将辅被用物添加至反应中，其优选的选自ATP、rNTP、NTP、一些rNTP或dNTP的混合物、多磷酸和优选的焦磷酸，或包含磷酸酐的化合物(由图2中的通式X-PO3H2代表)。
在本发明的一个具体的实施方案中使用了产生脱羧酶的微生物。在优选的实施方案中，微生物是重组的，其产生相对生产宿主异源的脱羧酶。因此所述方法可直接在培养基中进行，不需要分离或纯化酶系统。在一种特别有优势的方式中，使用如下的微生物：其具有内源产生一种或多种3-羟基烷酸的天然或人工性能，并还表达或过表达天然或经修饰的脱羧酶，从而从溶液中存在的碳源直接制备末端烯。
本发明使用的微生物可为原核生物或真核生物，具体是细菌、酵母、植物细胞、真菌和霉菌、动物细胞。在一个具体的实施方案中，微生物为细菌，具体的为富养产碱菌和巨大芽胞杆菌菌株。
在另一个具体的实施方案中，微生物为重组的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株，其被修饰以内源产生一种或多种3-羟基烷酸，并将它们转化为末端烯。
在另一个具体的实施方案中，微生物为重组的酵母，其产生3-羟基烷酸并将它们转化为末端烯。
在另一个具体的实施方案中，使用微生物一方面产生一种或多种3-羟基烷酸，另一方面使用脱羧酶，任选的由第二种微生物表达脱羧酶。任选的，根据本发明的方法培养和同时使用2种微生物。
在另一个具体的实施方案中，使用全植物或动物(任选的通过转基因修饰)从3-羟基烷酸制备末端烯，无论它们是内源产生的或是外源供应的。
在另一个具体的实施方案中，使用如下光合微生物：其具有内源产生一种或多种3-羟基烷酸的天然或人工性能，并也过表达天然或经修饰的脱羧酶，从而从溶液中存在的CO2直接制备末端烯。优选的，所述微生物为光合作用菌或微藻。
本发明还涉及在上文中描述的微生物和它们制备末端烯化合物的用途。
如以下描述，本发明的方法可在微需氧的条件下进行。
此外，在优选的实施方案中，方法在收集从反应中脱气的末端烯气体的系统的存在下进行。
如此处使用的，脱羧酶表示能够将具有n个碳原子的3-羟基烷酸转化为具有n-1个碳原子的末端烯的任意酶。如在图2中所示，本发明的方法优选的经3-磷酸羟基烷酸反应中间体进行，并且使用的酶有利地具有脱羧酶活性和磷酸化酶活性。
在一个具体的实施方案中，脱羧酶为甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶(酶命名EC4.1.1.33)的系统发生上的超家族中的成员，也就是说，由天然或合成基因编码的，任选的能够催化图2中所示的反应的天然或人工酶。
MDP脱羧酶是参与胆固醇生物合成的酶。已经从许多生物包括动物、真菌、酵母和一些细菌中分离出所述酶。其也可由一些植物表达(Lalitha等人，1985)。已经克隆和测序了许多编码此酶的基因。这些酶一般由300至400氨基酸组成，使用ATP作为辅被用物，ATP在反应中转化为ADP和无机磷酸。磷酸基团从ATP分子转移至甲羟戊酸二磷酸的叔醇，释放ADP。在3-羟基基团磷酸化的反应中间体之后消去磷酸基，在生理条件下释放异戊烯焦磷酸(图2)。
已经解析了此家族一些酶的三维结构。到目前为止，对此家族酶进行的研究相对较少，仅在精确描述胆固醇的生物合成途径中研究了这些酶。另一方面，就我所知，还没有研究将此酶从其天然功能中转换并将其变为工业催化剂。
在SEQIDNO：1到SEQIDNO：16的序列中给出了来自不同生物的MDP脱羧酶的若干实例。
因此，在优选的实施方案中，使用的酶为脱羧酶，其优选的包含选自SEQIDNO：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16的氨基酸序列，或与所述序列之一具有至少15％序列同源性并保留脱羧酶活性的序列。优选的酶有利地与SEQIDNO：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16的基本(primary)序列之一具有至少50％序列同源性，优选的至少80％，更优选的至少85％，甚至更优选的至少90，95，96，97，98或99％同源性。确定序列同源性百分比可通过不同方法和通过本领域技术人员已知的软件程序例如CLUSTAL方法或BLAST，及其衍生软件，或使用序列比较算法例如Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，1970，48：443)或Smith和Waterman(J.Mol.Biol.，1981，147：195)所描述的。
本发明优选的脱羧酶的代表是具有SEQIDNO：6序列的酶和与其具有显著的序列同源性的任意酶。优选的酶有利地与SEQIDNO：6的基本序列具有至少50％序列同源性，优选的至少80％，更优选的至少85％，甚至更优选的至少90，95，96，97，98或99％同源性。所述酶从嗜苦古菌(Picrophilustorridus)中克隆并由本发明范围内的重组方法制备。如在实施例中所示，此酶特别有效的制备根据本发明的末端烯化合物。此酶及其制备和其作为催化剂的用途也是本发明的目的。具体的，本发明的一个目的是包含SEQIDNO：6全部或部分的脱羧酶或与SEQIDNO：6具有显著的序列同源性、优选的至少15％同源性的酶在制备末端烯化合物中的用途。显著的序列同源性是指使用上述算法可检测的序列同源性，优选的高于15％的序列同源性。与嗜苦古菌具有最近的系统发生关系的生物能够制备与SEQIDNO：6最相似的MDP脱羧酶，所述生物为例如Ferroplasmaacidarmanus，嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)，火山热原体(Thermoplasmavolcanium)和Picrophilusoshimae。例如，嗜酸热原体(AC号Q9HIN1)的MDP脱羧酶与SEQIDNO：6具有38％序列同源性；火山热原体(Q97BY2)的MDP脱羧酶与SEQIDNO：6具有约42％序列同源性。在本发明中更具体的考虑了这些MDP脱羧酶的用途。
可根据酶制备根据本发明的末端烯的能力选择天然或合成的其他脱羧酶类型的酶。因此，选择试验包含将纯化的酶或产生酶的微生物与反应底物接触，并测量末端烯化合物的产生。这些试验在实施例部分描述，其中检测了超过60种不同的酶。
使用的酶可为天然的、制备的或人工优化的任意脱羧酶。具体的，有利地使用对一种或多种3-羟基烷酸具有优化活性的脱羧酶。
可从参考脱羧酶(天然的或自身已经是合成或优化的)制备或选择酶，通过蛋白质工程技术例如随机诱变、大量诱变、定点诱变、DNA改组、合成改组、体内进化或完整合成基因。
就此而言，本发明的一个目的还涉及制备针对3-羟基烷酸底物具有脱羧酶活性的酶的方法，所述方法包含以下步骤：对酶来源进行处理，并选择与未处理的酶相比针对所述底物具有增强性能的酶。
在本发明中使用的酶因此可为天然或合成的，通过化学、生物学或遗传方法制备。其也可为化学修饰的，例如以改进其活性、抗性、特异性、纯化或将其固定在支持物上。
本发明的特征在于脱羧酶、特别是天然或修饰的MDP脱羧酶在将3-羟基烷酸转化为末端烯中的用途。
MDP脱羧酶的天然底物是甲羟戊酸二磷酸，其不属于3-羟基烷酸的定义范围。
图2B中描述了MDP脱羧酶使用多种3-羟基烷酸进行的通用反应。认为这些反应直接和一步得到末端烯。
在第一个实施方案中，使用天然或重组的、纯化或未经纯化的酶将3-羟基烷酸转化为末端烯。为此，在底物存在下在允许酶有活性的物理化学条件下孵育酶制剂，允许孵育进行足够长的时间。在孵育结束后，任选的测量末端烯的存在，通过本领域技术人员已知的任意检测系统例如气相层析或比色试验测量烯产物或游离磷酸的形成，或测量3-羟基烷酸底物或ATP的消失。
在优选的实施方案中，添加辅助因子以最佳的模拟天然反应。事实上，3-羟基烷酸的结构一般对应MDP片段，因此在酶-底物结合中在催化裂缝里留出空的巨大空间。用辅助因子填充此空间以代替底物的缺失部分，目的在于最接近地模拟MDP分子。因为辅助因子在反应中不经修饰，因此其仅以催化量加入。在反应底物是3-羟基丙酸的情况下，互补的辅助因子为丙基二磷酸。在反应底物是3-羟基丁酸或3-羟基-3-甲基丁酸的情况下，互补的辅助因子为乙基二磷酸。在反应底物是3-羟基戊酸或3-羟基-3-甲基戊酸的情况下，互补的辅助因子为甲基二磷酸。这些不同的分子显示于图5。有时候，一个反应的互补辅助因子可能对另一个底物的反应有积极作用。一般的，辅助因子可为任意包含磷酸酐的分子，因此具有通式R-PO2H-O-PO3H2，其中R具体是H、线性、分支或环状烷基，或任意其他单价有机基团。本发明也包括对应亚甲基二磷酸单酯的类似基序，其具有通式R-O-PO2H-CH2-PO3H2，其中磷酸酐由亚甲基桥替换，其优势在于不被水解。
更一般的，辅助因子可为单磷酸或甚至是以上分子的无磷酸类似物，或通过在酶催化位点提供空间或电荷互补可改进反应产量的任意其他分子。
在一个具体的实施方案中，在反应中加入辅被用物。所述辅被用物可为ATP，即MDP脱羧酶的天然辅被用物，或任意rNTP(核糖核苷三磷酸)或dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)或rNTP或dNTP的任意混合物，或焦磷酸，或其他多磷酸，或其他包含磷酸酐基团的任意分子(图2中的X-PO3H2)。
在优选的实施方案中，为了将3-羟基烷酸转化为末端烯，使用了与具有脱羧酶活性的天然酶、特别是与对应SEQIDNO：1至16序列的酶之一具有至少15％序列同源性，优选的至少30％，50％和甚至更优选的至少80，90，95，96，97，98或99％序列同源性的酶。具体的，酶可经修饰，通过对SEQIDNO：1至16的酶之一或其他来源鉴定的任意其他脱羧酶进行改造得到。这些酶可能失去了其MDP脱羧酶活性，特别是在实验室的遗传改造中，也可能在自然进化中(在这种情况下可称为退化的MDP脱羧酶)，但保留或提高了针对一种或多种3-羟基烷酸类型分子的活性。对所述底物活性更高的这些酶的变体的产生有可能改进根据本发明的反应产量。例如，野生型MDP脱羧酶针对3-羟基烷酸的反应性不一定是最佳的。可使用本领域技术人员已知的任意方法制备和选择这些变体，所述方法例如随机诱变、定点诱变、大量诱变、DNA改组、或体内进化。
本发明的特征还在于完全的人工酶在将3-羟基烷酸转化为末端烯中的用途，所述酶通过设计和制备编码全新酶的合成基因得到，通过使用或不使用MDP脱羧酶的已知数据设计。
本发明的另一个目的是具有脱羧酶活性和包含SEQIDNO：6全部或部分的分离的或纯化的酶。
本发明的另一个目的涉及具有脱羧酶活性和包含SEQIDNO：6全部或部分的酶、或具有如上述序列同源性的酶在制备末端烯中的用途。在一个变体中，序列可进一步包含另外的残基，例如在N-末端的组氨酸标签。
本发明的另一个目的涉及制备具有脱羧酶活性和包含SEQIDNO：6全部或部分的酶、或与上述序列具有同源性的酶的方法，所述方法包含在允许表达所述序列的条件下培养包含编码所述序列的重组核酸的微生物。在这一点上，本发明描述了除天然核酸(SEQIDNO：19)以外的核酸，其具有为了在细菌中，特别是在大肠杆菌中，表达SEQIDNO：6的酶而优化的序列(SEQIDNO：17)。此核酸和任意优化的核酸(即与野生型序列相比能够在表达中获得至少30％的改进)是本发明的一个目的。
本发明的另一个目的涉及包含编码具有脱羧酶活性和包含SEQIDNO：6全部或部分的酶、或具有如上述序列同源性的酶的重组核酸的微生物。微生物优选的为细菌、酵母或真菌。本发明还涉及包含编码根据本发明的脱羧酶的重组核酸的任意植物或非人动物。
在一个实施方案中，MDP脱羧酶以纯化的形式使用以将3-羟基烷酸转化为末端烯。然而，此方法代价高，因为酶和底物的制备和纯化成本很高。
在另一个实施方案中，MDP脱羧酶以非纯化的提取物存在于反应中，或以非裂解细菌的形式，从而节省了蛋白质纯化的成本。然而，此方法相关的成本仍然很高，因为制备和纯化底物的成本高。
在本发明的另一个实施方案中，方法使用活的生物制备酶，通过酶进行转化。因此所述发明的特征在于制备一种或多种3-羟基烷酸的细菌菌株[例如经实验室修饰以产生所述产物的富养产碱菌和巨大芽胞杆菌，或大肠杆菌菌株]的遗传工程修饰，从而使所述细菌菌株过表达脱羧酶，所述酶优选的来源于不同于宿主微生物的生物，并可直接生成一种或多种末端烯。遗传修饰可包含将脱羧酶基因整合进染色体，表达质粒上的酶，所述质粒包含在酶编码序列上游的启动子，启动子和编码序列优选的来源于不同生物，或本领域技术人员已知的任意其他方法。可选的，可以选择其他细菌或酵母，它们可能具有特定优势。例如，可使用酵母例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，嗜极端细菌例如嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)，或来自例如梭菌(Clostridiae)家族的厌氧菌，微藻或光合细菌。为了最优的制备3-羟基烷酸，其之后被转化为末端烯，菌株也可经遗传工程修饰，即通过体外重组或定向体内进化。
在一个实施方案中，本发明方法的特征在于碳源例如葡萄糖至3-羟基烷酸的转化，之后所述初级产物转化为次级产物，即末端烯。所述方法的不同步骤在图6中显示。
在一个具体的实施方案中，本发明的特征在于聚羟基烷酸至3-羟基烷酸的转化，通过使用酶或合适的物理化学方法，之后所述初级产物转化为次级产物，即末端烯。任选的，聚羟基烷酸已由植物产生，所述植物的代谢途径已经修饰以使其产生高产量的聚羟基烷酸。
在一个具体的实施方案中，本发明包含从大气中的CO2或人工添加至培养基的CO2制备产物的完整方法。所述发明的方法在能够进行光合作用的生物例如微藻中实施。
在这些实施方案中，本发明的方法的另外特征在于从培养中脱气的产物的回收模式。事实上，短的末端烯，特别是乙烯、丙烯、丁烯异构体在室温和大气压下以气态存在。本发明的方法因此不需要将产物从液体培养基中抽提，此步骤通常当以工业规模进行时代价很高。气态碳氢化合物的抽空和贮藏及其可能的后续物理分离和化学转化可通过本领域技术人员已知的任意方法进行。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法还包含检测存在于气相中的烯(特别是丙烯、乙烯和异丁烯)。目的化合物在空气或其他气体环境中的存在，甚至小量存在，可通过多种技术检测，特别是通过气相层析系统使用红外线或火焰电离检测，或与质谱联用。
在一个具体的实施方案中，得到的末端烯为缩合的，之后任选的使用本领域技术人员已知的技术经还原以制备更长链的烯或更长链的烷。具体的，异丁烯可用于合成异辛烷：成功进行此反应的催化方法已详细的描述。
在一个具体的实施方案中，方法涉及在标准培养条件下(30-37℃于1个大气压下，在允许细菌需氧生长的发酵罐中)或非标准条件下(例如，对应嗜热生物的培养条件的更高的温度)培养微生物。
在一个具体的实施方案中，微生物在微需氧的条件下培养，限制注入的空气量以最小化包含烯烃的气体流出物中残留的氧气浓度。
本发明的其他方面和优势将在以下实施例中描述，实施例是为了说明的目的而给出的，而不是为了限制。
附图说明
图1：3-羟基丙酸基序
图2：甲羟戊酸二磷酸经MDP脱羧酶的脱羧——通用活性
图3：3-羟基烷酸的示例
图4：MDP脱羧酶在制备末端烯中的用途
图5：在反应中为了催化位点中的结构互补目的可使用的辅助因子
图6：从葡萄糖制备烯的完整方法
图7：在实施例4的1号条件中进行的酶反应的层析
图8：SEQIDNO：6酶的过表达和纯化步骤的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
1.标记
2.诱导前的培养物
3.裂解液
4.未被柱吸收的组分
5.柱的清洗组分
6.纯化的酶，分子量36.8kDa
图9：HIV至IBN转化的气相层析/质谱(GC/MS)层析分析
1和2：对应不含酶的背景噪音的阴性对照。
3和4：在SEQIDNO：6酶存在下的反应
图10：在存在和不存在ATP的情况下IBN产生的比率
图11：在存在和不存在Mg2+的情况下IBN产生的比率
图12：根据温度的酶活性。比率：在存在酶的情况下相对背景的IBN形成量
图13：根据HIV底物浓度的IBN的产生
图14：最优反应的测量和与背景的比较。通过气相层析用火焰电离检测测量。
图15：通过编码SEQIDNO：6的核苷酸序列的优化改进的表达水平
M道：分子量标记
1、2、3道：天然的核苷酸序列
(1)在纯化柱上样的细胞裂解液，可溶组分
(2)不保留在纯化柱上的裂解液组分
(3)洗脱组分：10μg纯化酶
4、5、6道：优化的核苷酸序列
(4)在纯化柱上样的细胞裂解液，可溶组分
(5)不保留在纯化柱上的裂解液组分
(6)洗脱组分：10μg纯化酶
实施例
实施例1：几种MDP脱羧酶的克隆和表达
编码酿酒酵母MDP脱羧酶的基因通过重叠的寡核苷酸合成并克隆至能够在细菌中表达的pET质粒(Novagen)中。所述质粒之后通过电穿孔转化至细菌菌株BL21(Invitrogen)。在包含氨苄青霉素的培养皿上划线细菌并于37℃培养。第二天，随机选择一个细菌菌落并接种于50ml包含氨苄青霉素的LB培养基中。培养物培养24小时同时摇晃，之后离心培养物，通过超声波处理裂解细菌，制备总蛋白质提取物。在电泳凝胶中上样等分试样的提取物和未经转化的相同菌株的蛋白质提取物，及分子量标记。对应转化菌株的道含有约30kD的单独条带，其对应于蛋白质的预期大小，在上样未经转化细菌的道中没有所述条带。
实施例2：测量蛋白质提取物对3-羟基-3-甲基丁酸的活性
3-羟基-3-甲基丁酸(Sigma，编号55453，名为β-羟异戊酸)以10g/l浓度悬浮。甲羟戊酸二磷酸由甲羟戊酸内酯和其他试剂(Sigma)通过传统方法合成并以10g/l浓度重悬。
准备6个层析小管。在每个小管中加入含有50mMBistris/HCl、1mM二硫苏糖醇、10mMMgCl2和5mMATP的50μL缓冲液。
小管1和4：加入5μl水(无底物)。
小管2和5：加入5μl甲羟戊酸二磷酸制剂(阳性对照)。
小管3和6：加入5μl3-羟基-3-甲基丁酸(HIV)制剂。
小管1、2和3：加入5μl水(无酶)。
小管4、5和6：加入5μl实施例1中描述的酶制剂。
小管用隔膜密封和压褶。所有小管在37℃孵育4小时至3天。
孵育后，使用气体注射器收集各个小管中的气体，通过气相层析测量样品中的CO2浓度。小管5具有非常高的CO2浓度，小管6中也检测到较低浓度的CO2，指示酶制剂对3-羟基-3-甲基丁酸的显著反应。
之后通过气相层析用红外线或火焰电离检测测量小管6气体样品中的异丁烯的存在。
实施例3：使用辅助因子优化反应条件
进行了如前面实施例的小管6中描述的相同反应，但在一个样品中加入了根据要求合成的(synthesizedtoorder)乙基二磷酸作为辅助因子。
在此实施例中使用3个小管。第一个包含前面实施例中所描述的量的缓冲液、ATP和酶提取物。第二个小管包含相同的成分，但另外包含前面实施例中所描述的量的3-羟基-3-甲基丁酸。在第三个小管中，除了3-羟基-3-甲基丁酸，还包含10μl10mg/l的乙基二磷酸。
如前面的实施例，通过气相层析用红外线或火焰电离检测测量异丁烯的形成。发现当乙基二磷酸存在时，产生的异丁烯量随着时间明显更高。
实施例4：筛选酶文库
得到编码来自MDP脱羧酶家族的酶的63个基因的文库并检测其对HIV作为底物的活性。
克隆、细菌培养和蛋白质表达
克隆编码甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶家族EC4.1.1.33的基因，真核基因克隆至pET25b载体(Novagen)，原核来源的基因克隆至pET22b载体(Novagen)，在N-末端紧接甲硫氨酸起始密码子之后添加6-组氨酸标签。通过热休克用这些载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)。细胞于30℃在包含0.5M山梨醇、5mM甜菜碱、100μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中摇晃(160rpm)培养直至600nm的OD达到0.8和1之间。之后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，在20℃过夜(约16小时)继续蛋白质表达。通过4℃，10,000rpm离心20分钟收集细胞，沉淀冷冻于-80℃。
细胞裂解
1.6g细胞在冰上解冻并重悬于5ml包含300mMNaCl、5mMMgCl2、1mMDTT的50mMNa2HPO4pH8。加入20微升lysonase(Novagen)。细胞于室温孵育10分钟，之后放回冰上20分钟。通过在0℃超声水浴中用超声波处理3x5分钟完全的裂解细胞；在脉冲间隔搅匀样品。之后通过4℃，10,000rpm离心20分钟澄清细菌提取物。
蛋白质纯化和浓缩(PROTINO试剂盒)
澄清的细菌裂解液上样至PROTINO-1000Ni-IDA柱(Macherey-Nagel)以进行6-组氨酸标记蛋白的吸附。清洗柱并用4ml包含300mMNaCl，5mMMgCl2，1mMDTT，250mM咪唑的50mMNa2HPO4pH8洗脱目的酶。洗脱液之后在AmiconUltra-410kDa管(cell)(Millipore)中浓缩至250μl的终体积。通过Bradford法定量蛋白质。
酶反应
在缓冲液和反应pH不同的2种试验条件下检测期望的酶反应(3-羟基-3-甲基丁酸，或3-羟基异戊酸或HIV的转化)。
1号试验条件：
100mM柠檬酸
10mMMgCl2
10mMATP
20mMKCl
200mMHIV
最终pH调节至5.5
2号试验条件：
100mMTris-HClpH7.0
10mMMgCl2
10mMATP
20mMKCl
200mMHIV
最终pH调节至7.0
将酶加入反应混合物。因为蛋白质产量不同，在不同样品中加入范围在0.01至1mg/ml的酶量。平行进行不含酶的对照反应。
在2ml小管(Interchim)中进行1ml反应，并用特氟隆/二氧化硅/特氟隆隔膜(Interchim)密封。反应在37℃孵育72小时，无需摇晃。
反应的分析
用装备不可回复(no-return)装置的注射器收集反应中存在的气体。通过气相层析(GC)联合质谱(MS)分析气体样品。仪器事先用一系列异丁烯浓度校准。
柱：BPX5(SGE)
GC/MS：MSD5973(HP)
对每次层析得到3个主峰，第一个对应空气，第二个对应水，第三个对应异丁烯。在制备和检测的63个酶中，在初筛中鉴定出11个潜在的候选酶。这些候选酶中的一些在图7中用箭头标示出。它们的鉴定显示如下，它们的序列为SEQIDNO：6至16(未显示组氨酸标签)。
候选酶1：SEQIDNO：7
Genebank编号：CAI97800.1
Swissprot/TrEMBL编号：Q1GAB2
微生物：戴耳布吕克氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)(菌株ATCC11842/DSM20081)
候选酶2：SEQIDNO：8
Genebank编号：CAJ51653
Swissprot/TrEMBL编号：Q18K00
微生物：HaloquadratumwalsbyiDSM16790
候选酶3：SEQIDNO：9
Genebank编号：ABD99494.1
Swissprot/TrEMBL编号：Q1WU41
微生物：唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivariussubsp.Salivarius)(菌株UCC118)
候选酶4：SEQIDNO：10
Genebank编号：ABJ57000.1
Swissprot/TrEMBL编号：Q04EX2
微生物：酒类酒球菌(Oenococcusoeni)(菌株BAA-331/PSU-1)
候选酶5：SEQIDNO：11
Genebank编号：ABJ67984.1
Swissprot/TrEMBL编号：Q03FN8
微生物：戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)ATCC25745
候选酶6：SEQIDNO：12
Genebank编号：ABV09606.1
Swissprot/TrEMBL编号：A8AUU9
微生物：格登链球菌(Streptococcusgordonii)(菌株Challis/ATCC35105/CH1/DL1/V288)
候选酶7：SEQIDNO：13
Genebank编号：ABQ14154.1
Swissprot/TrEMBL编号：A5EVP2
微生物：节瘤偶蹄形菌(Dichelobacternodosus)VCS1703A
候选酶8：SEQIDNO：14
Genebank编号：EDT95457.1
Swissprot/TrEMBL编号：B2DRT0
微生物：肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)CDC0288-04
候选酶9：SEQIDNO：15
Genebank编号：AAT86835
Swissprot/TrEMBL编号：Q5XCM8
微生物：化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)血清型M6(ATCCBAA-946/MGAS10394)
候选酶10：SEQIDNO：6
Genebank编号：AAT43941
Swissprot/TrEMBL编号：Q6KZB1
微生物：嗜苦古菌(Picrophilustorridus)DSM9790
候选酶11：SEQIDNO：16
Genebank编号：AAV43007.1
Swissprot/TrEMBL编号：Q5FJW7
微生物：嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM
在候选酶10中观察到最高水平的异丁烯(IBN)产生，即纯化的来自嗜苦古菌的SEQIDNO：6脱羧酶。保留此酶用于进一步表征。
实施例5：SEQIDNO：6酶的表征
如实施例4中所描述的纯化重组酶。图8中展示的结果显示在最终蛋白质样品中的酶的纯度为约90％。
确认了分离的酶的活性。反应在以下条件中进行：
100mMTris-HClpH7.0
10mMMgCl2
10mMATP
20mMKCl
250mMHIV
最终pH调节至6.0
3mg/ml酶
在30℃孵育72小时后，通过GC/MS测量信号。结果显示于图9。在酶存在下，相对背景噪音此处的IBN的产生提高了约2.3倍。观察到的此处的背景噪音与有机化学文献中的一致，显示在水溶液中和约100℃的温度下，3-羟基异戊酸缓慢的脱羧为叔丁醇，其部分脱水为异丁烯，遵照有利于叔丁醇形成的平衡(Pressman和Luca，J.Am.Chem.Soc.1940)。
ATP辅被用物的作用
检测条件
100mM柠檬酸
50mMKCl
10mMMgCl2
200mMHIV(待指定)
1mg/ml纯化的酶
pH5.5
在30℃孵育72小时
条件 ATP终浓度 酶
1 0mM 0mg/ml
2 0mM 1mg/ml
3 10mM 0mg/ml
4 10mM 1mg/ml
图10中的结果显示仅在辅被用物ATP存在下观察到酶活性。其他分子，特别是包含磷酸酐键的分子也可为此酶的有效辅被用物。
Mg 2+ 辅助因子的作用
检测条件
100mM柠檬酸pH5.5
50mMKCl
10mMATP
200mMHIV(待指定)
pH5.5
1mg/ml纯化的酶
在30℃孵育72小时
条件 MgCl2终浓度 酶
1 0mM 0mg/ml
2 0mM 1mg/ml
3 5mM 0mg/ml
4 5mM 1mg/ml
图11中的结果显示在Mg2+离子存在下酶活性提高了。其他离子，特别是其他二价离子，也可替代Mg2+离子或与Mg2+离子共同作为辅助因子使用。
根据温度的酶活性
检测条件
100mM缓冲液
50mMKCl
10mMATP
200mMHIV(待指定)
1mg/ml纯化的酶
在不同温度下孵育72小时
图12中的结果显示在约50℃的最优温度下酶适度的热活化。
根据pH的活性
检测条件
100mM缓冲液
50mMKCl
10mMATP
200mMHIV(待指定)
1mg/ml纯化的酶
在30℃孵育72小时
当100mM柠檬酸的pH为5.5时得到最优条件。
酶参数
在前述条件中在50℃孵育下检测了底物范围。酶的Km为约40mMHIV。
反应条件的优化
研究了最优反应条件，保留了以下条件：
100mM柠檬酸
50mMKCl
40mMATP
200mMHIV
1mg/ml酶
在50℃孵育48小时
如图14中所示，信号相对背景噪音的比率为约100。
实施例6：嗜苦古菌MDP脱羧酶在大肠杆菌中表达的优化
在大肠杆菌中的最初表达水平很低，因为在纯化前的SDS-PAGE上很难看见条带。使用http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/上的“Optimizer”程序基于Sharp和Li(1987)的方法测量天然序列用于大肠杆菌表达的密码子优化指数(CAI)。得到的值只有0.23，表示在大肠杆菌中蛋白质表达的低水平。生成了编码相同蛋白质但包含更适于在大肠杆菌中表达的密码子的序列。此序列具有0.77的CAI，离最优的1更近。天然序列和优化序列显示于SEQIDNO：17(包含组氨酸标签的嗜苦古菌(AAT43941)MDP脱羧酶的优化序列)和SEQIDNO：19(包含组氨酸标签的嗜苦古菌(AAT43941)MDP脱羧酶的天然序列)。
优化序列通过寡核苷酸连接合成并克隆至pET25表达载体。在根据前述的实验方案将载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)菌株和诱导后，如前述制备、纯化蛋白质并在凝胶上分析。对了比较，对天然序列进行相同的实验方案。
比较候选酶224的表达水平，使用天然序列或为了在大肠杆菌中表达优化的序列。
图15中的结果显示对应优化基因的蛋白质在凝胶上的未纯化的细胞裂解液道中(道4)明显可见，表明非常显著的表达提高。优化基因在经过纯化步骤后蛋白质的纯度水平也更高。
在粗制裂解液中测量活性。在对应天然核酸序列的粗制裂解液中检测不到活性。改进了蛋白质的表达后得到的具有改进序列(优化克隆224)的粗制裂解液现在展示了此活性。
在此检测中使用以下反应介质：
反应介质
在50℃孵育2天。
结果
1号条件：优化克隆224的裂解液
2号条件：克隆GB6的裂解液(空pET质粒)
实施例7：从3-羟基-3-甲基丁酸合成异丁烯和转化为异辛烷的方法
在1升体积中进行与实施例3中的小管3相同的反应，在装备气体抽提系统的发酵罐中进行。重组酶的存在引起3-羟基-3-甲基丁酸至异丁烯的转化，异丁烯天然脱气，并由位于发酵罐上部的气体抽提系统回收。异丁烯之后通过Amberlyst35wet或36wet树脂(Rohm和Haas)的催化加成以制备异辛烯。通过催化加氢将异辛烯还原为异辛烷。
实施例8：改造酶以改进对底物的有效性
使用随机诱变技术建立包含数千种实施例1中描述的基因的突变体文库。此突变体文库之后克隆进表达质粒并转化进感受态细菌菌株BL21。
分离1000种细菌并接种于包含500μl添加氨苄青霉素的LB培养基的Eppendorf管中。样品在摇床中孵育15小时。第二天，通过在前面实施例中描述的试验方案中的一种或另一种测定产生的异丁烯量。
具有显著提高的异丁烯量的克隆之后用相同的试验方案再次确认。一旦确认此改进，从各个改进的克隆中提取质粒并测序。鉴定对改进的活性起作用的突变并在相同的质粒上组合所述突变。包含不同改进突变的质粒再转化进感受态细菌，并进行相同的分析。
包含组合突变的克隆与仅包含单独改进突变的克隆相比具有显著更高活性，之后将其作为基础用于新一轮突变/筛选，以鉴定具有进一步改进活性的突变体。
此试验方案完成后，选择具有最高活性的包含几种突变的克隆。
实施例9：从3-羟基丙酸合成乙烯的方法
将编码实施例1中描述的酶的基因插入能够在大肠杆菌菌株中表达重组蛋白的质粒。将质粒转化进所述细菌菌株。转化的细菌之后在存在丙基二磷酸(10mg/l)和3-羟基丙酸(1g/l)的发酵罐中培养。重组酶的存在导致3-羟基丙酸至乙烯的转化，其自然脱气并由位于发酵罐上部的气体抽提系统回收。之后在气体样品中通过气相层析用红外线检测在乙烯发射最强的光谱部分测量乙烯。
实施例10：从3-羟基丁酸合成丙烯的方法
将编码实施例1中描述的酶或实施例4中描述的酶的基因插入能够在大肠杆菌菌株中表达重组蛋白的质粒。将质粒转化进所述细菌菌株。转化的细菌之后在存在乙基二磷酸(10mg/l)和3-羟基丁酸(1g/l)(Sigma，编号166898)的发酵罐中培养。重组酶的存在导致3-羟基丁酸至丙烯的转化，其自然脱气并由位于发酵罐上部的气体抽提系统回收。之后在气体样品中通过气相层析用红外线检测在丙烯发射最强的光谱部分测量丙烯。
实施例11：从葡萄糖合成丙烯的方法
将编码实施例1中描述的酶或实施例4中描述的酶的基因插入能够在富养产碱菌细菌中表达重组蛋白的质粒。将质粒转化进所述细菌菌株。
转化的细菌之后在存在葡萄糖和乙基二磷酸的发酵罐中和微需氧条件下培养，之后经历热休克以诱导它们产生大量3-羟基丁酸。重组酶的存在导致3-羟基丁酸至丙烯的同时转化，其自然脱气并由位于发酵罐上部的气体抽提系统回收。
实施例12：从葡萄糖合成丙烯的方法
此实施例描述了与实施例11非常相似的方法。主要区别在于使用修饰的大肠杆菌菌株制备3-羟基丁酸，而非天然菌株例如富养产碱菌。所述菌株通过代谢途径的改造得到，以产生3-羟基丁酸的积聚。加入例如实施例1或实施例4中描述的MDP脱羧酶使3-羟基丁酸转化为丙烯。
实施例13：从葡萄糖合成异丁烯的方法
将编码实施例1中描述的酶的基因插入能够在大肠杆菌菌株中表达重组蛋白的质粒，所述大肠杆菌已经历代谢修饰从而内源合成3-羟基-3-甲基丁酸。
细菌之后在存在葡萄糖的发酵罐中和微需氧条件下培养。重组酶的存在导致3-羟基-3-甲基丁酸至异丁烯的同时转化，其自然脱气并由位于发酵罐上部的气体抽提系统回收。

Claims (33)

1.制备末端烯的方法，其特征在于包含用MDP脱羧酶转化3-羟基烷酸为相应的末端烯的步骤，其中3-羟基烷酸是下式化合物：
HO-CO-CH2-C(R1)(R2)-OH，
其中R1和R2独立的选自氢原子和线性或分支的烷基，所述烷基具有1至4个碳原子，
其中MDP脱羧酶选自SEQIDNO:6-17和19所示的MDP脱羧酶。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于在烯的2位碳上的2个取代基中的至少1个或为线性或分支的烷基。
3.根据权利要求1或2的方法，其包含将3-羟基丁酸转化为丙烯的步骤。
4.根据权利要求1或2的方法，其包含将3-羟基戊酸转化为1-丁烯的步骤。
5.根据权利要求1或2的方法，其包含将3-羟基-3-甲基丁酸转化为异丁烯的步骤。
6.根据权利要求1或2的方法，其包含将3-羟基-3-甲基戊酸转化为异戊烯的步骤。
7.制备异丁烯的方法，其特征在于其包含以下步骤：通过MDP脱羧酶转化3-羟基-3-甲基丁酸，其中MDP脱羧酶选自SEQIDNO:6-17和19所示的MDP脱羧酶。
8.根据权利要求1或7的方法，根据所述方法在反应中加入辅助因子。
9.根据权利要求8的方法，其中所述辅助因子来自磷酸酐家族，由通式R-O-PO2H-O-PO3H2表示。
10.根据权利要求9的方法，其中R为氢原子或甲基，并还可为任意线性、分支或环状烷基，或任意其他单价有机基团。
11.根据权利要求10的方法，其中R为乙基或丙基。
12.根据权利要求8的方法，其中所述辅助因子来自亚甲基二磷酸单酯，具有通式R-O-PO2H-CH2-PO3H2。
13.根据权利要求12的方法，其中R为氢原子或甲基，并还可为任意线性、分支或环状烷基，或任意其他单价有机基团。
14.根据权利要求13的方法，其中R为乙基或丙基。
15.根据权利要求1或7的方法，根据所述方法转化在辅被用物存在下进行。
16.根据权利要求15的方法，其中所述辅被用物为包含磷酸酐的化合物。
17.根据权利要求16的方法，其中所述辅被用物为ATP、rNTP、dNTP或几种这些分子的混合物、多磷酸盐或焦磷酸。
18.根据权利要求1或7的方法，其特征在于转化步骤在无细胞系统中体外进行。
19.根据权利要求1或7的方法，其特征在于转化步骤在过表达所述MDP脱羧酶的微生物存在下进行。
20.根据权利要求1或7的方法，其特征在于使用具有内源产生一种或多种3-羟基烷酸的天然或人工性能，并进一步表达或过表达所述天然或经修饰的MDP脱羧酶的微生物，从而从碳源直接制备末端烯。
21.根据权利要求20的方法，其中微生物为富养产碱菌(Alcaligeneseutrophus)或巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)菌株的细菌。
22.根据权利要求21的方法，其中微生物为经染色体修饰或质粒转化以过量产生一种或多种3-羟基烷酸的重组细菌、酵母或真菌。
23.根据权利要求20的方法，其中碳源为葡萄糖或任意其他己醣、木糖或任意其他戊糖、甘油或任意其他多元醇、或淀粉、纤维素、半纤维素、聚3-羟基烷酸或任意其他聚合物，所述方法在通过使用选自淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶、聚-3-羟基烷酸酶的合适的酶，将所述聚合物降解为单体的系统存在下，和/或特定化学条件下进行。
24.根据权利要求20的方法，其特征在于使用具有内源产生一种或多种3-羟基烷酸的天然或人工性能，并进一步过表达天然或经修饰的脱羧酶的光合微生物，从而从溶液中存在的CO2直接制备末端烯。
25.根据权利要求24的方法，其特征在于所述光合微生物是蓝藻类细菌或微藻。
26.根据权利要求1或7的方法，其特征在于使用允许碳源转化为3-羟基烷酸的第一种微生物，和使用分离的或由第二种微生物表达的脱羧酶，使3-羟基烷酸转化为末端烯。
27.根据权利要求1或7的方法，其特征在于使用表达MDP脱羧酶的植物或非人动物，以通过3-羟基烷酸的脱羧制备末端烯。
28.根据权利要求27的方法，其特征在于多细胞生物在某些代谢途径中进一步经修饰，以合成一种或多种3-羟基烷酸。
29.根据权利要求1或7的方法，其包含收集从反应中脱气的末端烯气体的步骤。
30.根据权利要求1或7的方法，其特征在于方法在微需氧条件下进行。
31.MDP脱羧酶或产生MDP脱羧酶的微生物在从3-羟基烷酸制备末端烯化合物中的用途，其中3-羟基烷酸是下式化合物：
HO-CO-CH2-C(R1)(R2)-OH，
其中R1和R2独立的选自氢原子和线性或分支的烷基，所述烷基具有1至4个碳原子，
其中MDP脱羧酶选自SEQIDNO:6-17和19所示的MDP脱羧酶。
32.组合物，其包含产生MDP脱羧酶的微生物、合适的培养基和3-羟基烷酸化合物或可由微生物转化为3-羟基烷酸化合物的碳源，其中MDP脱羧酶选自SEQIDNO:6-17和19所示的MDP脱羧酶。
33.具有内源产生一种或多种3-羟基烷酸的天然或人工性能，并进一步表达或过表达天然或经修饰的MDP脱羧酶的多细胞生物或微生物，用于从碳源直接制备末端烯，其中MDP脱羧酶选自SEQIDNO:6-17和19所示的MDP脱羧酶。
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