CN114317623B

CN114317623B - 基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法

Info

Publication number: CN114317623B
Application number: CN202210051005.1A
Authority: CN
Inventors: 信丰学; 姜岷; 陈泓羽; 陆家声; 蒋羽佳; 姜万奎; 章文明
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2042-01-17
Also published as: CN114317623A

Abstract

本发明涉及基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液或同体积脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀；所述脂肪酶表面展示大肠杆菌构建方式为：将脂肪酶lipA的编码基因和锚定蛋白estA的编码基因克隆到表达载体上，构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性克隆，即所述脂肪酶表面展示大肠杆菌。本发明的合成方法解决了解决丁酸丁酯生物合成方法对外源脂肪酶依赖造成成本过高的问题。

Description

基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法

技术领域

本发明涉及生物技术和微生物发酵领域，特别涉及一种基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法。

背景技术

丁酸丁酯是一种应用广泛的短链脂肪酸酯，作为溶剂广泛用于有机合成过程；因具有梨、菠萝样香气，是调制食品、饮料及日用化妆品、香精等不可缺少的原料，也是我国GB2760-86 规定允许使用的食用香料。此外，丁酸丁酯在低温下具有与航空柴油相似的理化性质，可直接用作航空燃料，是一种更高附加值的燃料添加剂。丁酸丁酯天然存在于菠萝、香蕉和草莓等水果中，然而含量非常低。

传统生产工艺以丁酸和丁醇为原料、浓硫酸为催化剂，通过酯化反应合成，该工艺虽然技术成熟、产品收率高，但存在副反应多、设备腐蚀严重、“三废”排放量大等弊端。因此，迫切需要开发新型生产工艺，实现丁酸丁酯的高效合成。生物发酵法合成丁酸丁酯能以可再生的生物质为原料，具有反应条件温和、产品纯度高、过程绿色环保等优势。目前，生物发酵法合成丁酸丁酯基于合成类型主要分为四类：（1）一步发酵法直接合成丁酸丁酯，即以单糖为底物直接发酵合成丁酸丁酯；（2）基于溶剂梭菌ABE发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加丁酸和脂肪酶合成丁酸丁酯；（3）基于产丁酸梭菌发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加丁醇和脂肪酶合成丁酸丁酯；（4）溶剂梭菌和产丁酸梭菌混菌发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加脂肪酶。利用脂肪酶催化合成丁酸丁酯，产品纯度高，然而酶成本较高，限制了其大规模应用。

生物法合成丁酸丁酯中的关键步骤为一个以丁酸和丁醇为底物，生成丁酸丁酯的酯化反应，反应中的催化剂可由脂肪酶承担。脂肪酶又名甘油酯水解酶，可催化三酰甘油水解生成游离脂肪酸和甘油，在微环境中的水解反应是可逆的。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，除了对三酰甘油酯有水解活性，还可催化酯化反应，转酯反应，氨解反应等。脂肪酶参与的催化反应具有不需要辅酶、反应条件温和、副产物少等优点。目前较常用的工业化脂肪酶中，有诺维信公司推出的商品固定化脂肪酶—诺维信435。诺维信435通过将来源于南极假丝酵母的脂肪酶B（CALB）吸附于丙烯酸树脂制得，市价约为200元/克，价格昂贵，提高了生物法合成丁酸丁酯的成本。

发明内容

为了解决丁酸丁酯生物合成方法对外源脂肪酶依赖造成成本过高的问题，本发明提供了一种基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液或同体积脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀；

所述脂肪酶表面展示大肠杆菌构建方式为：

将脂肪酶lipA的编码基因和锚定蛋白estA的编码基因克隆到表达载体上，构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性克隆，即所述脂肪酶表面展示大肠杆菌；

其中，所述脂肪酶lipA Genbank登录号为WP_034581463.1；所述锚定蛋白estA来源于Genbank登录号为NC_002516.2的铜绿假单胞菌基因组。

作为一种优选的实施方式，所述表达载体选用pET29a。

作为一种优选的实施方式，所述产丁酸丁酯菌株选自丙酮丁醇梭菌、酪丁酸梭菌中的一种或两种；优选利用丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌混合发酵。

作为一种优选的实施方式，丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例为1:1~1:4。

作为一种优选的实施方式，在产丁酸丁酯菌株发酵24h后，加入所述发酵液/菌体沉淀。

作为一种优选的实施方式，所述脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液获取方式为：

将脂肪酶表面展示大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；

将所述种子液按接种到LB液体培养基中摇瓶培养至OD=0.6~0.8，再加入IPTG诱导培养，获取发酵液。

作为一种优选的实施方式，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀。

lipA是一个来源于丙酮丁醇梭菌的基因，可表达脂肪酶作为丁酸丁酯合成酯化反应中的关键酶。在无外源添加脂肪酶的情况下，丙酮丁醇梭菌单菌发酵仍有少量丁酸丁酯产量，由此推测丙酮丁醇梭菌可内源性表达脂肪酶。将脂肪酶展示于微生物表面，作为一种全细胞生物催化剂，在不需纯化和固定化的复杂工艺条件下，不仅可以直接使用，而且可重复利用，这将大大降低生产成本，本发明经筛选发现Genbank登录号为WP_034581463.1的脂肪酶lipA构建的脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株，其菌体沉淀催化产量接近诺维信，可作为诺维信的廉价替代，解决丁酸丁酯生物合成方法对外源脂肪酶依赖造成成本过高的问题，具有良好的应用潜能。

附图说明

图1为重组表达的质粒双酶切电泳验证结果；泳道1为核酸Marker；泳道2质粒双酶切结果，下方条带为脂肪酶与锚定蛋白融合基因。

图2为在三丁酸甘油脂酶活检测平板上的水解圈图；左列为丙酮丁醇梭菌来源的脂肪酶重组大肠杆菌表面展示菌株，出现明显透明水解圈；右列为对照空载质粒pET29a，无水解圈。

图3为实施例3中利用诺维信435、发酵液、菌体沉淀作为脂肪酶来源的产量对比图。

图4为实施例4中利用诺维信435、发酵液、菌体沉淀作为脂肪酶来源的产量对比图。

图5为实施例5中利用诺维信435、发酵液、菌体沉淀作为脂肪酶来源的产量对比图。

图6为发酵产物产量变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例中丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌ATCC 824（Clostridium acetobutylicumATCC 824），酪丁酸梭菌为酪丁酸梭菌ATCC 25755（C. tyrobutyricum ATCC 25755），均为商业菌株。

实施例1

重组脂肪酶WP_034581463.1大肠杆菌表面展示菌株pET29a-estA-Ca-BL21的构建

（1）在丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum）基因组中经分析比对，得到编码脂肪酶lipA（GenBank登录号：WP_034581463.1）的基因的完整核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：1所示；在登录号为NC_002516.2铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因组中经分析比对，得到编码锚定蛋白estA的基因的完整核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：2所示；

（2）设计上游引物

5'-TAAGAAGGAGATATACATATGATGTTGCATTATGTACATGTTGGA-3'

和下游引物

3'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGAAGTCCAGGCTCAGCGCCA-5'；

以（1）所得两种核酸片段混合物为模板，进行PCR扩增，得到脂肪酶与锚定蛋白的融合基因，同时在序列上游引入NdeI酶切位点，在下游引入XhoI酶切位点。其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

（3）将（2）所合成的脂肪酶与锚定蛋白的融合基因用限制性内切酶NdeI和XhoI分别对纯化的基因片段和质粒pET29a进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞。涂布于LB（含30 μg/mL卡那霉素）平板。挑取阳性克隆通过NdeI和XhoI双酶切鉴定及基因测序，结果表明获得了pET29a-estA-Ca重组质粒；

（4）将（3）所得的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，即获得重组pET29a-estA-Ca-BL21大肠杆菌表面展示菌株。

实施例2

重组表面展示脂肪酶的大肠杆菌的诱导

（1）将重组大肠杆菌pET29a-estA-Ca-BL21面展示菌株接种于含30 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基（NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，pH7.2~7.4）中，于37℃，120 r/min试管培养至对数生长期，作为种子液；

（2）将（1）所述的种子液按1%的接种量接种到LB液体培养基（NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，pH7.2~7.4）中，于37℃，120 r/min摇瓶培养至OD=0.6~0.8，再按0.2%的添加量加入IPTG，于20℃，摇瓶条件下诱导培养24 h。

采用p-NPB法测量所得发酵菌液中的酶活力，酶活单位(U)定义为：每分钟释放出1μmol 对硝基苯酚所需要的酶量作为1个酶活单位。测得空载质粒酶活为0.02 U/mL，发酵菌液酶活为51.79 U/mL。由结果可见，脂肪酶在重组大肠杆菌表面得到了充分有效的展示。

实施例3

基于脂肪酶表面展示大肠杆菌的丁酸丁酯合成方法，步骤如下：

（1）将丙酮丁醇梭菌以接种量5% v/v接种到活化培养基中，37 ℃、120 rpm活化60h，每隔12 h调节pH至5.5；

活化培养基配方为：1 g/L NaCl，0.75 g/L K₂HPO₄，0.75 g/L KH₂PO₄，3 g/L 酵母粉，0.5 g/L MgCl₂•6H₂O，0.3 g/L NH₄Cl，0.015 g/L CaCl₂•2H₂O，1.5 g/L FeCl₂·4H₂O，0.3 g/L KCl，葡萄糖60 g/L，溶剂为水，调节pH至5.5；

（2）将活化的丙酮丁醇梭菌以接种量5 % v/v接种到发酵培养基中，37 ℃、66 rpm发酵168 h，每隔12 h调节pH至5.5；

发酵培养基配方为：1 g/L NaCl，0.75 g/L K₂HPO₄，0.75 g/L KH₂PO₄，3 g/L 酵母粉，0.5 g/L MgCl₂·6H₂O，0.3 g/L NH₄Cl，0.3 g/L KCl，0.015 g/L CaCl₂·2H₂O，1.5 g/LFeCl₂·4H₂O，溶剂为水，pH 5.5，通氮气10～20 min，121℃灭菌15 min；

（3）在过程（2）培养期间，在24 h时分别加入5 g/L诺维信435脂肪酶、脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵菌液、同体积发酵菌液离心后收集所得菌体沉淀，菌液和培养液体积比=1:10；加入萃取剂十六烷，萃取剂和培养液体积比=1:2；加入5 g/L丁酸钠；

测定发酵液中的产物产量，结果显示在加入菌体沉淀作为催化剂时，发酵168h丁酸丁酯的产量达到5.71 g/L，高于加入发酵菌液作为催化剂，且与诺维信435脂肪酶作为催化剂时产量接近，见图3。

实施例4

本实施例和实施例3的不同之处仅在于，活化并接种到发酵培养基中的菌株为酪丁酸梭菌，在培养24 h时用5 g/L丁醇替代丁酸钠的外源添加。

测定发酵液中的产物产量，结果显示在加入菌体沉淀作为催化剂时，发酵168h丁酸丁酯的产量达到9.79 g/L，高于加入发酵菌液作为催化剂，见图4。

实施例5

本实施例和实施例3的不同之处仅在于，分别活化丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌，各以接种量7.5 % v/v、5 % v/v接种到发酵培养基中，在培养24 h时无丁酸钠或丁醇的外源性添加。

培养过程中，每24 h测定发酵液中的产物产量，结果显示在加入菌体沉淀作为催化剂时，发酵168h丁酸丁酯的产量达到13.52 g/L，发酵曲线见图5。

实施例6

本实施例使用实施例1的方法构建菌株，不同之处仅在于脂肪酶lipA来源为GenBank登录号为NC_000964.3的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168。

上游引物5‘-TAAGAAGGAGATATACATATGATGAAATTTGTAAAAAGAAGGATC-3’，下游引物5‘-AGGTGTAGTCGGCGATCAGGCTTAATTCGTTAATTCGTATTCTGG-3’。

采用实施例2的方式诱导脂肪酶表面展示大肠杆菌获取发酵菌液。将发酵菌液应用至实施例3、4所述方法，丁酸丁酯产量分别为1.98 g/L（实施例3）和丁酸丁酯产量为0.61g/L（实施例4）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法

<130> xb22011701

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttgcatt atgtacatgt tggaaacaag aaaagtccaa atacactgct ttttgttcat 60

ggaagcggat gcaatttaaa aatatttgga gaacttgaaa aatatttaga agattataat 120

tgtatacttc tcgatttaaa gggacatggt gaaagtaagg gtcaatgtcc ttctactgta 180

tatggctata ttgataatgt tgctaacttt ataacaaata gcgaagtaac taaacaccaa 240

aaaaatatta ctttaattgg atatagcatg gggggagcta tagttttggg agtagcatta 300

aaaaaattgc cgaatgtaag aaaagttgta tccttaagcg gcggtgctag atttgacaaa 360

ctagataaag attttatgga aaaaatttat cacaatcaac ttgacaataa ctatttacta 420

gaatgtattg gaggtataga taatccacta tctgaaaaat attttgaaac acttgaaaag 480

gatccagata taatgataaa tgatttgatt gcctgtaagc ttattgattt agttgataat 540

ttaaaaaata tagatatacc cgtaaaggca attgtagcaa aagatgagct acttactcta 600

gtagaatatt ccgaaatcat aaagaaagaa gttgaaaatt cagaattaaa aatctttgaa 660

accggtaagc atttcctatt agtagtaaat gctaaaggag tagctgaaga aattaaaaac 720

ttcata 726

<210> 2

<211> 1941

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatcagaa tggcgctcaa gccactggta gcggcctgcc tgctggcttc gctgtccacc 60

gccccgcagg ctgctccttc gccctattcg acgctggtgg tgttcggcga cagcctcagc 120

gatgccgggc agttccccga tcctgccggc cccgccggaa gcacctcgcg tttcaccaac 180

cgggtcggcc cgacctacca gaacggcagc ggcgagatct tcggaccgac cgcgcccatg 240

ctgctcggca atcagctcgg catcgccccg ggtgacctgg ctgcctcgac ctcgccggtc 300

aacgcccagc agggcatcgc cgacggcaac aactgggcgg tgggcggcta ccggaccgat 360

cagatctacg actcgatcac cgcggccaac ggctcgctga tcgagcgcga caataccctc 420

ctgcgcagcc gcgatggcta cctggtggac cgtgcccgcc agggcctggg tgccgacccg 480

aacgcgttgt actacatcac cggcggcggc aacgactttc tccaggggcg catcctcaac 540

gacgtccagg cccaacaggc cgccggtcgc ctggtggata gcgtgcaggc cctgcagcag 600

gccggcgcgc gctacatcgt ggtctggctg ttgcccgacc tgggcctgac cccggctacc 660

ttcggtggtc ccttgcagcc tttcgccagc caactcagcg gcacgttcaa cgccgagctg 720

accgcccagt tgagccaggc cggcgccaac gtcattccgt tgaacatccc gctgctgctc 780

aaggaaggca tggccaaccc ggcttccttc ggcctggccg ccgaccagaa cctgatcggc 840

acctgtttca gcggcaacgg ctgcaccatg aacccgacct acgggatcaa cggcagcacg 900

cccgacccga gcaaattgct gttcaacgac agcgtgcacc cgaccatcac cggccagcgc 960

ctgatcgccg actacaccta ttcgctgctg tcggcgccct gggagctgac cctgctgccg 1020

gaaatggccc acggcaccct gcgtgcctac caggacgaac tgcgcagcca gtggcaggcg 1080

gactgggaga actggcagaa cgtcggccag tggcgcggct tcgtcggcgg cggtggccag 1140

cgcctggact tcgactccca ggacagcgcc gccagcggcg acggcaacgg ctacaacctg 1200

acccttggtg gcagctaccg catcgacgag gcctggcgcg ccggggtcgc cgccggtttc 1260

taccggcaga agctggaagc cggcgccaag gattccgact accggatgaa cagctacatg 1320

gccagcgcct tcgtgcagta ccaggaaaac cgctggtggg ccgacgcggc gttgaccggc 1380

ggctacctcg actacgacga cctgaagcgc aagttcgccc tgggcggcgg cgagcgcagc 1440

gagaaaggcg acaccaacgg ccacctgtgg gcgttcagcg cgcgcctggg ctacgacatc 1500

gcccagcagg ccgacagtcc ctggcacctg tcgccgttcg tcagcgccga ctatgcacgg 1560

gtcgaggtcg acggctattc cgagaagggc gccagcgcca ccgcgctcga ctacgacgac 1620

cagaagcgca gctcgaagcg cctgggcgcc ggcctgcaag gcaagtacgc gttcggcagc 1680

gatacccagc tgttcgccga gtacgcccac gaacgtgagt acgaggacga cacccaggac 1740

ctgaccatgt ccctcaacag cctgccgggc aatcgcttca ccctcgaagg ctacaccccg 1800

caggaccatc tcaaccgcgt ctcactcggc ttcagccaga agctggcgcc ggagctgtcg 1860

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gcgctgagcc tggacttctg a 1941

<210> 3

<211> 1771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatgttgc attatgtaca tgttggaaac aagaaaagtc caaatacact gctttttgtt 60

catggaagcg gatgcaattt aaaaatattt ggagaacttg aaaaatattt agaagattat 120

aattgtatac ttctcgattt aaagggacat ggtgaaagta agggtcaatg tccttctact 180

gtatatggct atattgataa tgttgctaac tttataacaa atagcgaagt aactaaacac 240

caaaaaaata ttactttaat tggatatagc atggggggag ctatagtttt gggagtagca 300

ttaaaaaaat tgccgaatgt aagaaaagtt gtatccttaa gcggcggtgc tagatttgac 360

aaactagata aagattttat ggaaaaaatt tatcacaatc aacttgacaa taactattta 420

ctagaatgta ttggaggtat agataatcca ctatctgaaa aatattttga aacacttgaa 480

aaggatccag atataatgat aaatgatttg attgcctgta agcttattga tttagttgat 540

aatttaaaaa atatagatat acccgtaaag gcaattgtag caaaagatga gctacttact 600

ctagtagaat attccgaaat cataaagaaa gaagttgaaa attcagaatt aaaaatcttt 660

gaaaccggta agcatttcct attagtagta aatgctaaag gagtagctga agaaattaaa 720

aacttcatag cctgatcgcc gactacacct attcgctgct gtcggcgccc tgggagctga 780

ccctgctgcc ggaaatggcc cacggcaccc tgcgtgccta ccaggacgaa ctgcgcagcc 840

agtggcaggc ggactgggag aactggcaga acgtcggcca gtggcgcggc ttcgtcggcg 900

gcggtggcca gcgcctggac ttcgactccc aggacagcgc cgccagcggc gacggcaacg 960

gctacaacct gacccttggt ggcagctacc gcatcgacga ggcctggcgc gccggggtcg 1020

ccgccggttt ctaccggcag aagctggaag ccggcgccaa ggattccgac taccggatga 1080

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gcgagcgcag cgagaaaggc gacaccaacg gccacctgtg ggcgttcagc gcgcgcctgg 1260

gctacgacat cgcccagcag gccgacagtc cctggcacct gtcgccgttc gtcagcgccg 1320

actatgcacg ggtcgaggtc gacggctatt ccgagaaggg cgccagcgcc accgcgctcg 1380

actacgacga ccagaagcgc agctcgaagc gcctgggcgc cggcctgcaa ggcaagtacg 1440

cgttcggcag cgatacccag ctgttcgccg agtacgccca cgaacgtgag tacgaggacg 1500

acacccagga cctgaccatg tccctcaaca gcctgccggg caatcgcttc accctcgaag 1560

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cggagctgtc gctgcgcggc ggctacaact ggcgcaaggg cgaggacgat acccagcaga 1680

gcgtcagcct ggcgctgagc ctggacttct gactcgagca ccaccaccac caccactgag 1740

atccggctgt acaaccgaag aaggtgaggc c 1771

Claims

1.基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法，其特征在于，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液或同体积脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀；

所述脂肪酶表面展示大肠杆菌构建方式为：

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述表达载体选用pET29a。

3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述脂肪酶表面展示大肠杆菌构建方式包括：

在丙酮丁醇梭菌基因组中经分析比对，得到编码脂肪酶lipA的基因的完整核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：1所示；在登录号为NC_002516.2铜绿假单胞菌基因组中经分析比对，得到编码锚定蛋白estA的基因的完整核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：2所示；

设计引物以两种核苷酸片段混合物为模板进行PCR扩增，得到脂肪酶与锚定蛋白的融合基因，同时在序列上游引入NdeI酶切位点，在下游引入XhoI酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

用限制性内切酶NdeI和XhoI分别对纯化的基因片段和载体质粒进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，取验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，即为脂肪酶表面展示大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，设计引物如下：

上游引物：5'-TAAGAAGGAGATATACATATGATGTTGCATTATGTACATGTTGGA-3'

下游引物：3'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGAAGTCCAGGCTCAGCGCCA-5'。

5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述产丁酸丁酯菌株选自丙酮丁醇梭菌、酪丁酸梭菌中的一种或两种；优选利用丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌混合发酵。

6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例为1:1~1:4。

7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，在产丁酸丁酯菌株发酵24h后，加入所述发酵液/菌体沉淀。

8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液获取方式为：

9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液添加量为发酵培养基培养液体积的10%。

10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀。